Inverkan av kylningsförloppet på tillväxt av bakterier i gårdstankmjölk.

EN FORSKNINGSRAPPORT FRÅN LRF MJÖLK Rapport nr: 8002 2014-02-20 Inverkan av kylningsförloppet på tillväxt av bakterier i gårdstankmjölk. Anders Christiansson

Inverkan av kylningsförloppet på tillväxt av bakterier i gårdstankmjölk. Sammanfattning Kylning är en förutsättning för att förhindra bakterietillväxt i tankmjölk. En matematisk modell har tagits fram för att kunna förutsäga effekten av långsamma kylningsförlopp på lagfas och tillväxt i mjölk. Innan tillväxten startar måste bakterierna först genomgå ett anpassningsarbete under lagfasen. Anpassningen till miljön i mjölken sker snabbast nära optimumtemperaturen och sker med lägre hastighet när temperaturen sänks och tar då längre tid. Modellen förutsäger hur lång tid lagfasen tar och beräknar därefter tillväxten av psykrotrofa bakterier vid 4 C i upp till 48 timmar. Icke psykrotrofa bakterier som ingår i totalantalet tillväxer inte. Ett antal exempel på effekten av olika kylningsförlopp redovisas. Om mjölken kyls ned normalt inom 2 eller 3 timmar avslutas lagfasen först efter cirka 36 timmar och tillväxten blir marginell vid konventionell mjölkning. Om mjölken får stå t.ex. vid 30 C i tre timmar innan nedkylningen startar så tar lagfasen slut redan efter 8-11 timmar och påverkar då totalantalet bakterier påtagligt. Vid konventionell mjölkning sker förutom tillväxt även en utspädning med ny mjölk vid varje nytt mjölkningsmål. Den ursprungliga halten psykrotrofa bakterier, i kombination med profilen för nedkylningsförloppet, är avgörande för i vilken mån tillväxten kommer att påverka totalantalet bakterier. Vid låg halt psykrotrofer (100/ml) kan mjölken tåla ett långsammare nedkylningsförlopp utan att totalantalet bakterier påverkas. Nedkylning till under 10 C inom två-tre timmar är den mest kritiska fasen. Långsam nedkylning under några extra timmar vid lägre temperatur t.ex. i intervallet 8 till 4 har mindre betydelse. Kylningen av mjölk på VMS-gårdar skiljer från konventionella gårdar genom att små mängder mjölk ständigt tillförs mjölktanken. Detta ställer särskilda krav på kylningstekniken vad gäller nedkylning av den första mjölken och kan leda till förlängda kyltider jämfört med konventionell mjölkning. Men det är det endast de små volymerna från de första timmarnas mjölk som riskerar att kylas långsamt och där bakterierna snabbast avslutar lagfasen. Senare kommer mjölken att hamna i en nedkyld mjölktank och lagfasen för dessa bakterier kommer att bli mycket lång på grund av låg temperatur. Men mjölken späds ständigt ut med mera mjölk vilket medför att vid jämförbara nedkylningsprofiler och samma ursprungshalt psykrotrofa bakterier blir bakteriehalten lägre efter 48 timmar än vid konventionell mjölkning, i synnerhet vid långsamma kylningsförlopp. Tvärtemot vad man skulle kunna tro är mjölk som kyls vid AMS-mjölkning mindre känslig för långsam kylning än vid konventionell mjölkning. Mer kunskap behövs om halter av psykrotrofa bakterier i svensk mjölk och sammansättningen av floran i mjölk under olika hygienförhållanden, men det behöver inte ställas strängare nedkylningskrav för AMS-mjölk än för mjölk vid konventionell mjölkning. Beräkningarna visar snarare att det är fullt tillräckligt med en nedkylning till 4 C inom 3 timmar och mjölken tål ytterligare några timmars långsam kylning i intervallet 8 till 4 C utan problem. Det är önskvärt att tillväxten av psykrotrofa bakterier på gården är låg, eftersom bakterier i aktiv tillväxt kommer att fortsätta att tillväxa i silotanken vid mejeriet. Bättre kännedom om halten psykrotrofa bakterier i gårdstankmjölk kan bidra

till ett bättre beslutsunderlag för krav på mjölkens kylning på gården samt kan även ge underlag för en riskvärdering angående tillväxt i mejerisilotankar. Inledning Leverantörsmjölkens bakteriologiska kvalitet påverkas av hygienen i samband med mjölkning och diskning av utrustningen, samt av mjölkens kylning. Mjölkens bakteriologiska kvalitet är generellt sett god i Sverige. Medianhalten för totalantalet bakterier från svensk leverantörsmjölk år 2011 var cirka 8000 bakterier/ml och endast 1,4 % av analyserna översteg 100 000/ml [1]. Men drygt 20% av gårdarna har högre bakteriehalt än 15000/ml. Det finns tendenser att bakterietalet ökar. Gårdar med robot och större gårdar i allmänhet har i genomsnitt högre bakteriehalt i mjölken än konventionella medelstora gårdar [1]. Anledningen till detta är inte säkerställd men flera teknikrelaterade faktorer kan bidra: Dessa gårdar producerar mycket mjölk och har grövre mjölkledningar, mera komplicerad utrustning som kan vara svårdiskad (t.ex. fler ventiler, värmeväxlare) och större mjölktankar. Det förekommer också att kyltiderna på gårdar med många kor blir mera utdragna än vad som avses. Mejeriernas krav är att mjölken ska vara nedkyld till maximalt 4 C inom 2-3 timmar efter avslutad mjölkning. Men dessa rekommendationer har sitt ursprung i konventionell mjölkning där mjölken snabbt kunde kylas ned. Vid robotanläggningar finns varm mjölk i ledningarna under större delen av tiden och mjölkens kylförlopp kan skilja sig åt jämfört med konventionella anläggningar eftersom det kan ta längre tid att fylla tanken så att kylningen kan slås på. Vid långsam kylning finns det risk att psykrotrofa bakterier växer till, vilket kan leda till negativa effekter av mjölken som mejeriråvara. Kunskapsläget vad gäller effekten av olika kylförlopp på bakterietillväxt är otillräckligt. Denna rapport redovisar beräkningar av bakterietillväxt, baserat på litteraturdata som bearbetats till en tillväxtmodell, under förhållanden som simulerar olika kylförlopp för att nå ökad insikt i kylförloppets betydelse. Bättre kännedom om halten psykrotrofa bakterier i gårdstankmjölk kan bidra till ett bättre beslutsunderlag för krav på mjölkens kylning på gården samt kan även ge underlag för en riskvärdering angående tillväxt i mejerisilotankar. Översikt över rapporten Mjölk är ett mycket näringsrikt livsmedel och gynnsamt för bakterietillväxt. Kylning av mjölken är den absolut viktigaste faktorn för att hämma tillväxten (sid 4) De antimikrobiella substanser som finns i mjölk är inte verksamma i normal mjölk och förhindrar inte tillväxt (sid 4-5). Bakteriernas tillväxt kurva består av tre faser (fig 1). o Lagfasen, som är en anpassningsfas där bakterierna anpassar sig till de nya tillväxtbetingelserna. Ingen tillväxt sker i lagfasen. Lagfasen blir allt längre när temperaturen minskar (fig 2, sid 6). o Logfasen eller den exponentiella fasen där bakterierna delar sig med en konstant hastighet och bakterietalet ökar exponentiellt. Tillväxthastigheten blir långsammare och startar senare när temperaturen sjunker (fig 2). o Stationärfasen när tillväxten har upphört. En matematisk modell för tillväxt i av psykrotrofa bakterier i opastöriserad mjölk vid olika temperaturer har tagits fram baserad på litteraturdata (sidan 8-13). Modellen beräknar lagfasens längd under olika kylningsförlopp och beräknar sedan tillväxten fram till 48 timmar. Modellen bygger på att de bakterier som har snabbast tillväxthastighet kommer att dominera efter 48 timmar. Detta är oftast psykrotrofa Pseudomonas-arter (tabell 1-2, sid 10-11). Modellens förutsägelser stämmer väl med litteraturdata under simulerad lagring av mjölk på gården (sid 22). 2

Alla bakterier är inte psykrotrofa och tillväxer därför inte. Totalantalet bakterier i mjölken består av mesofila bakterier, som inte växer i kyla, samt psykrotrofa, som tillväxer. Om mesofila bakterier dominerar, så kommer tillväxten av psykrotrofa bakterier att märkas först när de ökat i halt så att de finns i lika eller högre halt än de mesofila bakterierna. I beräkningarna har halten psykrotrofa bakterier satts till 100 eller 1000/ml och totalantalet bakterier till 10000/ml. Vid konventionell mjölkning tillförs mjölken i fyra omgångar. Bakterier i den första omgången kommer att avsluta lagfasen först. För varje ytterligare mjölkningsmål sker en utspädning av de växande bakterierna, varpå tillväxten fortsätter. Bakterierna i senare mjölkmål hinner inte avsluta lagfasen. Kylning i samband med AMS skiljer från konventionella gårdar genom att små mängder mjölk ständigt tillförs mjölktanken. Beräkningarna tar hänsyn även till utspädning och tillväxt under dessa omständigheter. Vid jämförbara nedkylningsprofiler blir halten psykrotrofa bakterier lägre för AMS än vid konventionell mjölkning (tabell 5 sid. 21) Ett antal tillväxtscenarier redovisas på sidan 14-20 (fig 6-15). o Nedkylning till 4 C inom 2 eller 3 timmar ger mycket liten påverkan på mjölkens o psykrotrofa bakterier (fig 7 sid 15 ). Lagfasen blir 36 respektive 35,5 tim Om mjölken endast kyls till 6 C och förblir vid denna temperatur fram till 48 timmar förkortas lagfasen till 26 timmar och tillväxten ökar något i förhållande till kylförvaring vid 4 C (fig 9 sid 16). o Om mjölken kyls normalt till 10 C och sedan stannar vid denna temperatur i 5 timmar minskar lagfasen till 29 timmar, förutsatt att mjölken sedan kyls snabbt till 4 C (fig 10, sid 16). Halten psykrotrofa bakterier ökar måttligt till 750/ml om ursprungshalten är 100/ml. o o o o o o Med ökande halt psykrotrofa bakterier ökar risken för höga totalantal (fig 12-13, sid 18-19). Tre timmar vid 30 C leder till en kraftig förkortning av lagfasen till 8 timmar, vilket innebär att totalantalet bakterier ökar med 100000/ml om ursprungshalten psykrotrofa bakterier är 1000/ml (fig 11, sid. 17) och med 10000/ml om ursprungshalten är 100/ml. Den ursprungliga halten psykrotrofa bakterier, i kombination med profilen för nedkylningsförloppet är avgörande för i vilken mån tillväxten kommer att påverka totalantalet bakterier. Detta framgår av tabell 4 (sid. 17) där effekten av olika lång tid vid 30 C visas. Beroende på om halten psykrotrofa bakterier är låg (100/ml) eller hög (1000/ml) så kan mjölken stå i 1-2 timmar vid 30 C utan större påverkan på totalantalet vid konventionell mjölkning. Figur 14-15 (sid. 20) visar två olika verkliga kylningsförlopp i AMS. Skillnaden i tillväxt för dessa system är liten, trots relativt lång kylningstid i fig 15 (tabell 5A-B sid. 21). Vid AMS-kylning sker i stort sett ingen ökning av psykrotrofa bakterier medan en halterna ökar 2-3 gånger vid konventionell kylning. Tabell 5C visar tillväxt i samband med långsam kylning, 7 timmar, till 4 C. Eftersom den långsamma kylningen beror på lång tid vid lägre temperatur (under 8-10 C) så påverkas inte halten psykrotrofa bakterier jämfört med 5A för AMS medan ökningen är större för konventionell kylning. Tabell 5D visar att 2 timmar vid 30 C följt av långsam kylning ger dramatiska effekter på antalet psykrotrofa bakterier vid konventionell kylning, trots utspädningseffekten. Även AMS påverkas men är fortfarande relativt låga vid en starthalt på 40-100 psykrotrofa bakterier/ml. Mer information behövs om vad som är normala initialhalter psykrotrofa bakterier i tankmjölk. En begränsad undersökning tyder på att halterna ligger mycket lågt för fyra gårdar med lågt totalantal bakterier (median <10/ml) i mjölken och lågt även för fyra gårdar med högt totalantal (max 200/ml) vid hämtning. Om detta är normalt så 3

innebär det att mjölken är mycket tålig mot temperaturstörningar och att långsamma kylningsförlopp, särskilt vid temperaturer under 8-10 C ger mycket begränsad effekt på psykrotrofa bakteriers tillväxt. Den mjölk som kommer in till mejeriernas silotankar kommer att innehålla psykrotrofa bakterier i olika halter beroende på hanteringen på gården. Om mjölken innehåller aktivt växande bakterier så kommer de att fortsätta att växa till i silotanken, vilket minskar hållbarheten (EU-gränsvärde 300.000/ml före pastörisering). Som exempel kan nämnas att modellen förutsäger att om halten psykrotrofa bakterier i aktiv tillväxt i en silotank är 10.000/ml och mjölken förvaras 1 dygn vid 4 C så skulle halten bakterier öka till 160.000/ml. Modellberäkningarna ovan tyder dock på att den genomsnittliga halten psykrotrofa bakterier från gårdarna är lägre. Större kännedom om halten psykrotrofa bakterier i gårdstankmjölk kan bidra till ett bättre beslutsunderlag för krav på mjölkens kylning på gården samt kan även ge underlag för en riskvärdering angående tillväxt i mejerisilotankar. Faktorer som påverkar bakterietillväxt i mjölk De grundläggande faktorerna som påverkar tillväxt av bakterier i ett livsmedel är tillgången till näring, ph, vattenaktivitet, tillgång till syre, temperaturen samt förekomst av bakteriehämmande substanser, t.ex. organiska syror och andra antimikrobiella ämnen. Mjölk är ett mycket näringsrikt livsmedel som är ett utmärkt tillväxtsubstrat för bakterier om förhållandena är de rätta. För opastöriserad mjölk är det i stort sett endast låg temperatur som hindrar mjölken från förskämning. Alla övriga tillväxtpåverkande faktorer är i stort sett optimala för bakterierna. Det är väl känt att i opastöriseradmjölk som producerats under hygieniska förhållanden och som snabbt kyls ned till 4 C sker ingen mätbar förändring av totalantalet bakterier under 2 dygn [2]. Men det finns ett antal antibakteriella komponenter i mjölken, som har som funktion i att skydda kalven från skadliga bakterier och att bekämpa bakterier vid mastit [3], som eventuellt skulle kunna bidra till att hämma bakterietillväxt i opastöriserad mjölk under kortare eller längre tid. Nedanstående litteraturöversikt över de antimikrobiella systemen visar dock att dessa system har ingen inverkan på hämning av bakterier under normala förhållanden. Antibakteriella ämnen i mjölk Laktoferrin är ett järnbindande protein med antibakteriella egenskaper, som minskar risken för bakterietillväxt bl.a. genom sin förmåga att sänka halten järn som är tillgängligt för bakterier [3]. Beroende på koncentration kan laktoferrin vara bakteriehämmande eller bakteriocidalt [4]. Bakterier behöver järn som tillväxtfaktor i varierande grad. Medan mjölksyrabakterier kräver lite järn så är t.ex. Pseudomonas betydligt mera järnkrävande [4]. Laktoferrin produceras av polymorfonukleära leukocyter och ökar i halt vid infektion i juvret. I sinmjölk är halten också förhöjd och bidrar till ett aktivt försvar mot t.ex. Escherichia coli [4]. Även i kolostrum är halten förhöjd [3]. I normal mjölk har dock laktoferrrin ingen bakteriehämmande effekt bl.a. eftersom halten är för låg [3]. Lysozym är ett protein som angriper cellväggen hos bakterier och därigenom hämmar eller dödar dem. Halten lysozym ökar i mjölken vid mastit men är alltför låg i normal mjölk för att vara bakteriehämmande [3]. Laktoperoxidas (LP) är ett protein som i närvaro av väteperoxid och thiocyanat-joner har antibakteriell effekt. Proteinet finns i relativt hög koncentration i mjölk, men varierar med tiden. Högst halt finns 3-4 dagar efter kalvens födsel och minskar sedan. Thiocyanat finns naturligt i mjölken men varierar med fodret medan väteperoxid kan bildas av katalasnegativa mjölksyrabakterier (vid 4

hög halt i mjölken). I normal mjölk är laktoperoxidassystemet inte aktiverat eftersom halterna av thiocyanat och väteperoxid är för låga [5]. Genom tillsats av thiocyanat och väteperoxid aktiveras systemet. SCN -_ jonen oxideras av H 2 O 2 till hypothiocyanat OSCN -, som tar sig över cellmembranet i sin odissocierade form, och reagerar med fria sulfhydrylgrupper och inaktiverar metaboliska enzymer hos bakterien [6]. Aktiverat laktoperoxidas har snabb bakteriocidal verkan mot gramnegativa bakterier som Pseudomonas fluorescens som följs av en period med bakteriostatisk effekt i upp till 10 tim vid 30 C [5]. I varma länder är det tillåtet att aktivera laktoperoxidassystemet för att kunna bevara mjölkens kvalitet under betingelser när mjölken inte kan kylas [7]. LP-systemet är även aktivt mot psykrotrofa bakterier under kylförvaring. Den bakteriedödande effekten sker betydligt långsammare, men upp till 5 dygns tillväxthämning kunde uppnås vid 5 C i opastöriserad mjölk [8]. Det aktiverade LP-systemet har bakteriedödande effekt även mot grampositiva bakterier, men med mycket långsam avdödningseffekt i kyla [9]. Laktoperoxidas inaktiveras endast delvis vid lågpastörisering och kan aktiveras i pastöriserad mjölk [10] Xanthinoxidas är ett oxidativt enzym som bildar reaktiva syreföreningar. Enzymet har nyligen visat sig har antibakteriell effekt i mjölk [11], men det är oklart vilken betydelse det har i mjölken. Andra mera specifika (t.ex. immunoglobuliner) och ospecifika antibakteriella komponenter förekommer också i mjölk [3], men kan inte bedömas ha betydelse för hämning av bakterietillväxt i normal mjölk. Sammantaget finns det inget som tyder på att de antimikrobiella systemen skulle ha tillväxthämmande effekt på bakterier i normal opastöriserad mjölk [12]. Det finns en missuppfattning bland vissa konsumentgrupper att de antimikrobiella systemen i opastöriserad mjölk skulle ha en skyddande effekt mot patogena bakterier [13]. Men de antimikrobiella proteinerna förekommer antingen i för låg halt eller är inte aktiverade. Prediktiv mikrobiologi - en metod att kunna förutsäga bakterietillväxt Tillväxtkurvan Bakteriers tillväxt vid en given temperatur och i en given miljö kan beskrivas med en tillväxtkurva där 10-logaritmen för halten bakterier/ml avsätts mot tiden. Tre olika tillväxtfaser kan urskiljas: lagfasen, logfasen (eller den exponentiella fasen) och stationärfasen (statfasen) (fig 1). Figur 1. Tillväxtkurva för en bakterie. Lagfas 0-3 tim, logfas 4-13 tim, statfas efter 15 tim 5

Lagfasen Produktskadliga eller patogena bakterier kan hamna i mjölken genom kontamination från miljön via kons spenar och från otillräckligt diskad mjölkningsutrustning eller kyltank. De kommer då från en omgivning som skiljer sig åt från miljön i mjölken. Miljön de kommer ifrån kan t.ex. vara mindre näringsrik och temperaturen kanske är en annan. Bakterierna kan också vara skadade p.g.a. värme eller disk/desinfektionsmedel i samband med disk av mjölkningsanläggningen. Då måste bakterierna återhämta sig och sedan anpassa sig till den nya miljön. Denna period kallas lagfasen (λ). Under lagfasen sker en intensiv syntes av bl.a. nya enzymer som krävs för att kunna tillgodogöra sig näringskomponenter i miljön och en reparation av skador på cellen om det behövs. Detta kan ta olika lång tid beroende på omständigheterna. En bakterie som kommer från en mjölkrik miljö och hamnar i en mjölktanken kommer i gång snabbare än en bakterie som utsatts för uttorkning på en yta av t.ex. rostfritt stål för att senare hamna i mjölk. Generellt sett är lagfasen kortast vid optimumtemperaturen och ökar proportionellt med lägre temperatur (Figur 2) ned till minimumtemperaturen, under vilken ingen tillväxt sker (lagfasen blir oändlig), även om bakterien kan överleva. Liknande effekter på lagfasens längd erhålls också av andra tillväxtbegränsande faktorer, t.ex. ph och vattenaktivitet. Vid temperaturer över maximum finns ingen lagfas. Bakterierna kan inte tillväxa utan dör, snabbare ju högre temperaturen är. Lagfasens längd beror dessutom på bakteriernas tidigare historik, (t.ex. värmebehandling, uttorkning, ph och effekter som beror på typ av matris/miljö, t.ex. hämning från andra bakterier) vilket gör att det ibland kan vara svårt att förutsäga lagfasens längd. Figur 2. Lagfas och tillväxt för totalantalet bakterier vid olika lagringstemperaturer. Halt vid start 5000 cfu/ml. Gul 20 C, röd 15 C, orange 10 C och blå 4 C. Exponentiell tillväxtfas (logfas) När lagfasen är slut börjar bakterierna att föröka sig. En bakteriecell ökar då i storlek och delar sig i två nya bakterieceller, som i sin tur växer till och bildar 4 celler o.s.v. (Figur 3). Celldelningen sker med konstant hastighet per timme. Antalet bakterier ökar exponentiellt. Detta kallas logaritmisk 6

tillväxt (logfas) och kan beskrivas med en tillväxtkurva ritad med bakteriehalten i 10 logskala (Figur 1 och 2). Lutningen på kurvan motsvarar tillväxthastigheten per timme, som betecknas µ och uttrycks i antal 10 log-enheter per timme. Ett annat sätt att beskriva tillväxten är genom att ange generationstiden (g), som är den tid det tar för en cell från att den bildats till att det har vuxit till och delat sig. Tillväxten kan då beskrivas med formeln N=N 0 *2 t/g N är antalet bakterieceller efter tiden t (tiden för tillväxt), N 0 är antalet bakterieceller vid start och g = generationstiden, tiden mellan två delningar, uttryckt i samma tidsenhet som tillväxttiden t (minuter, timmar, dygn). Figur 3 Exponentiell bakterietillväxt Samma formel men i logaritmerad form: 10 log N = 10 log N 0 + 10 log (2)*t/g 10 log N = 10 log N 0 + µ *t Tillväxthastigheten per timme (µ) är lika med 10 log (2)/g (vilket är lika med 0,301/g) d.v.s. den är konstant under logfasen under rådande betingelser. Tillväxthastigheten påverkas av alla de faktorer som inverkar på bakterien t.ex. temperaturen, näringstillgången etc. I figur 2 visas inverkan av olika temperaturer. Vid högre temperatur blir generationstiden (g) kortare och därmed sker tillväxten snabbare upp till optimumtemperaturen. Motsvarande effekter får man även av andra faktorer som påverkar tillväxten men i mjölk är både ph, vattenaktivitet och näringstillgång praktiskt taget konstanta. Om generationstiden eller µ är känd så är det lätt att beräkna tillväxtökningen under en viss tid vid konstanta omgivningsförhållanden. Stationärfasen Förr eller senare tar logfasen slut. Exponentiell tillväxt är endast möjlig så länge det finns tillgång till näring eller så länge inte avfallsprodukter från metabolismen (t.ex. mjölksyrabildning som sänker ph) blir begränsande. Detta innebär att tillväxten avstannar och bakterierna går in i stationärfasen. Det är 7

ett inaktivt stadium där bakterier oftast överlever utan att tillväxa eller så småningom dör. När bakterietillväxten börjar närma sig stationärfasen ( 10 log 7-9/ml) är påverkan på produkten oftast tydlig i form av smak-, lukt eller konsistensförändringar, d.v.s. produktförstöring. För patogena bakterier kan den halt bakterier som behövs för att orsaka sjukdom vara betydligt lägre. Det är viktigt att mjölkens bakterieflora inte når upp till 10 log(6/ml) eftersom det då finns risk för att enzymer från psykrotrofa bakterier (som är mycket värmeresistenta och inte inaktiveras genom pastörisering) kan påverka produktkvaliteteten även om bakterierna dör [14]. Därför är det viktigt att leverantörmjölkens bakteriehalt hålls låg och med god marginal till gränsvärdena i lagstiftningen. Modell för tillväxthastighet vid olika temperaturer Det finns ett enkelt samband som kan användas för att beräkna tillväxthastigheten under logfasen för en bakterie vid olika temperaturer, förutsatt att alla andra tillväxtbetingelser hålls konstanta: (µ) =b*(t-t 0 ), där (µ) är kvadratroten av tillväxthastigheten µ i logenheter per timme, T är den temperatur där man vill beräkna µ, b är en konstant som motsvarar riktningskoefficienten för den linje som erhålls genom att mäta µ vid olika temperaturer och dra en rät linje mellan punkterna. T 0 är en teoretisk minimitemperatur (ej identisk med den fysiologiskt sanna minimitemperaturen) som erhålls genom att förlänga linjen mellan punkterna ner till noll på y-axeln [15]. Den anses vara konstant för en given bakterie, t.ex. L. monocytogenes under rådande betingelser. Detta samband gäller vid temperaturer under optimumtemperaturen [16]. Figur 4 Exempel: Tillväxt av Listeria monocytogenes i pastöriserad mjölk 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 y=0.0158x + 0.0367 b 0.10 0.05 T 0 =- 2,32 C 0.00-10 -5-0.05 0 5 10 15 20 Temperatur C Beräkning av lagfasens längd För att kunna göra en realistisk bedömning av bakterietillväxt är det ofta viktigt att känna till lagfasens längd. Under lagfasen sker ingen tillväxt. Detta kan beskrivas på följande sätt: 8

10 log N = 10 log N 0 + µ *(t-λ) där λ är lagfasens längd. Med kännedom om tillväxthastigheter och lagfaser vid olika temperaturer är det möjligt att beskriva lagfasens längd i en ekvation. Förhållandet mellan µ och λ är konstant i en given tillväxtmiljö: µ*λ= h 0 [17, 18]. Om µ (vid en given temperatur) och h 0 är kända kan också λ beräknas för motsvarande temperatur. Situationen blir mera komplicerad om temperaturen varierar och lagfasen ännu inte tagit slut när temperaturen ändras t.ex. vid kylning av mjölk. Detta kan lösas med tid/temperatur-integrering [19, 20]. Beräkning av integrerad lagtid vid varierande temperatur Lagtiden krävs för att bakterierna ska ta sig/anpassa sig till ett nytt fysiologiskt tillstånd som medger tillväxt. Det anses att det arbete som krävs är en funktion av tidigvarande fysiologiskt tillstånd i den miljö bakterierna kommer från och de nya tillväxtförhållandena i den miljö där de hamnar, samt den tid/hastighet, (R) som detta arbete sker på för att nå dit. Arbetet betecknas som W n (work needed) [17]. t 1 *(lag) = W n /R ( 1 tid) Hastigheten är beroende av temperaturen och övriga tillväxtparametrar = W n () = W n Tillväxtekvation för olika temperaturer: µ=b 2 *(T-Tmin) 2 Tillväxtekvation enligt Xanthiakos för Listeria i mjölk [21]: µ ln =b 2 *(T-Tmin) 2 =0,024 2 *(T-(-2.32)) 2 (anm. µ ln :tillväxhastighet uttryckt i naturliga logaritmer, lnskala) µ ln *t(lag)= h 0 =1,34 (enligt Xanthiakos) µ log *t(lag) = (µ ln /ln10)* t(lag)= h 0 *ln 10 µ log *t(lag)=1,34*ln10 t(lag)=l T = 1,34*ln10/(0,024 2 *(T+2.32) 2 anm L T lag tid vid given temperatur T () 1 ) = 1 () ((0,024 (T ( 2.32)) ) =1 (1,34!"10) () ( #") = $ % &' ( ) = ',*+.*,+ ) =5356.7 (W n för det specifika fallet) 9

Vid tid-temperaturintegrering multipliceras tid*(t-t min ) 2 för varje temperatursteg och summeras sedan. När summan uppnått W n upphör lagfasen [19]. En modell enligt denna princip har implementerats i beräkningarna nedan över tillväxt i tankmjölk vid långsam kylning. Litteraturdata för utveckling av modell för tillväxt av bakterier i opastöriserad tankmjölk En genomgång av litteraturen bildade grund för utveckling av tillväxtmodellen. Temperaturen är avgörande för den bakteriologiska hållbarheten hos opastöriserad mjölk. Det blir stor skillnad i tillväxt om mjölken förvaras vid olika temperaturer mellan 4-8 [22]. Kylning till 2 C gav 2 dygns längre hållbarhet (hållbarhetstid här definierad som tid till log 6/ml), 5 dygn, jämfört med gårdsmjölk vid 6 C (2,9 dygn) [23]. Vid förvaring av mjölk av god kvalitet vid 1,5-2 C kunde bakteriehalten hållas så låg som 2600-13000 cfu/ml i 7 dygn [24]. Den kritiska faktorn för hållbarheten var den ursprungliga halten psykrotrofa bakterier, både vid 2 och 6 C [23, 24]. I opastöriserad mjölk som förvaras vid 4-5 C kommer bakteriefloran att domineras av olika arter av Pseudomonas, som t.ex. P. fluorescens, P. fragi, Pseudomonas gessardi och P. lundensis [25, 26]. I betydligt mindre omfattning kan psykrotrofa arter inom Enterobacterieceae och Acinetobacter förekomma [25]. Mjölk som omedelbart kylts till 4 C visade i genomsnitt ingen ökning i totalantal bakterier efter 48-72 timmar [2] medan det i mjölk som förvarats 2-3 timmar vid 30 C före kylning skedde tillväxt. Stadhouders et al. tolkade detta som att lagfasen blev kortare genom förvaring vid hög temperatur [2]. Uppgifter om tillväxthastigheter för olika bakterier i opastöriserad mjölk är fåtaliga men kan ibland utläsas eller beräknas från data i tabeller och figurer i publikationer. En sammanställning av beräkningar från litteraturdata vid kylförvaring finns i tabell 1. Tabell 1. Beräknade tillväxthastigheter i opastöriserad mjölk vid olika temperaturer Temperatur C log my Anmärkning Ref.nr. 4 0.037-0.05 gen.tid 6-8 tim 22 4 0.028; 0.04; 0.0523 blandflora 34 4 0.032; 0.022 enskilda stammmar 2 4.4 0.021 blandflora 24 4 0.0300 blandflora 28 4 0.0410 anrikad psykr. blandflora 29 8 0.102 blandflora 27 8 0.078 anrikad psykr. blandflora 30 Tabellen visar att det finns en variation i tillväxthastigheten för bakterier i opastöriserad mjölk vid 4 respektive 8 C. Detta är naturligt eftersom bakteriefloran i mjölk varierar och i verkligheten förekommer det en blandflora med bakterier som har olika tillväxthastighet. 10

Tabell 2 Tillväxthastigheten vid 4 C för enskilda isolat av psykrotrofa bakterier som ympats i opastöriserad getmjölk. Art Stam g (tim) log mymax (tim) Ps. fluorescens C9 8.34 0.036 G8 9.52 0.032 G16 21.49 0.014 J11 11.79 0.026 L3 12.05 0.025 L12 17.86 0.017 Ps. fragi F9 5.04 0.060 L20 7.23 0.042 Serratia liquefaciens D29 14.07 0.021 Opast. tankmjölk - 5.8 0.052 Tabell 2 visar att tillväxthastigheten hos isolat av psykrotrofa bakterier från getmjölk varierar mellan art och mellan stammar av samma art [27]. Samtliga isolat odlades i samma batch av mjölk. Tillväxten i tankmjölken av den naturliga floran utan tillsats av bakterier var 0.052 logenheter/timme, d.v.s. nästan lika snabb som det snabbaste bakterieisolatet. Variationen i tillväxthastighet för tankmjölk i tabell 1 ovan är i samma storleksordning som variationen mellan stammar i tabell 2. Det är sannolikt att den snabbast växande bakteriestammen kommer att bestämma den slutliga bakteriehalten i tankmjölk. I ett fåtal undersökningar har studier gjorts av tillväxthastigheten för samma tankmjölksprov vid olika temperaturer [28, 29]. Tatini [29] studerade mjölkprover (59 gårdar över ett år, totalt 296 prover) som preinkuberades vid 7, 13, 21 och 30 C. Generationstider beräknades och kvadratrotsmodellen enligt Ratkowsky användes: Rot ln my = -8,3988+0,03168*temp (Kelvin) vid psykrotrofhalter som initialt var log 2-6/ml. To = - 8.03 C. Författarna ansåg att ekvationen väl beskrev tillväxten i en blandflora i tankmjölk. Jämförelse med andra studier gjordes också [28, 30]. Tyvärr saknas data om lagfasens längd i dessa undersökningar. Griffiths och Phillips [31] studerade bakterietillväxt och tog fram en modell som beskriver bakterietillväxt i pastöriserad mjölk av varierande hygienisk kvalitet. Deras modell beskriver dessutom lagfasens längd som en funktion av temperaturen. I pastöriserad mjölk kommer gramnegativa psykrotrofa bakterier, som återkontaminerar mjölken efter pastörisering, ofta att dominera floran som begränsar hållbarheten [25, 26, 32-34]. Griffiths och Phillips [31] anger denna ekvation för tillväxthastigheten: Rot (ln µ)=0.031*(t-6,9), där T är temperaturen i C. Denna ekvation överensstämmer väl med Tatinis och är identisk med Tatinis beräknade medelvärde för de undersökningar han jämförde med [29], se Figur 5. 11

Figur 5. Jämförelse mellan olika tillväxtekvationer för psykrotrofa bakterier i tankmjölk enligt Tatini (opastöriserad mjölk), och medelvärde av olika undersökningar (medel opastöriserad mjölk), samt tillväxt i pastöriserad mjölk (rot ln my past) enligt Griffiths och Phillips. Rot (ln my) 1.00 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 0 10 20 30 Temperatur C Phillips past Tatini opast Medel opast Det var god överensstämmelse mellan Griffiths och Tatinis data och därför gjordes fortsatta beräkningar enligt Griffiths, eftersom det då också fanns data om lagfasens längd vid statisk temperatur: Rot (1/lagfasens längd i timmar)= 0.015*(lagringstemperaturen i C + 5.7). För att kunna beräkna lagfasens längd vid varierande temperatur under kylning beräknades genomsnittligt h 0 till 2,16 med hjälp av µ och λ för data vid olika temperaturer. Därefter gjordes beräkningar för att kunna utföra tid/temperaturintegrering på samma sätt som beskrivits ovan (se sid 9). ln(µ)=0.031 2 *(T+6.9) 2 (T= temperatur i C) h 0 =2.16 h 0 =Log10(µ)*λ(tim) λ(tim)=2.16*ln(10)/ 0.031 2 *(T+6.9) 2 () ( #") =2.16*ln(10)/ 0.031 2 *(T+6.9) 2 W n =5175 Tid temperaturintegrering implementerades i Excel tillsammans med ekvationer för att kunna beräkna tillväxten vid olika temperaturer efter att lagfasens avslutats. För exempel på beräkningar klicka här: Exempel tid-temperaturintegrering.xlsx För att använda modellen matar man in kylningsförloppet samt ursprungshalten psykrotrofa bakterier. Kylningsförloppet beskrivs i form av tidsintervall i timmar där medeltemperaturen för intervallet anges. Önskad upplösning kan uppnås genom att välja storleken på tidsintervallet. Som resultat erhålls lagfasens längd och tillväxtförloppet fram till 48 timmar. Tabell 3 visar tillväxthastigheten i mjölk för Griffiths modell, generationstid och lagfasen enligt Griffiths ekvation samt lagfasen även beräknad med formeln för tid/temperaturintegrering. 12

Tabell 3. Data ur Griffiths modell. Beräknad lag anger lagtiden med tid/temperaturintegrering Temperatur C log µ/tim generationstid (tim) lag tim Beräknad lag 2 0.033 9.1 75.0 65.3 3 0.041 7.4 58.7 52.8 4 0.050 6.1 47.2 43.6 5 0.059 5.1 38.8 36.5 6 0.069 4.3 32.5 31.1 7 0.081 3.7 27.6 26.8 8 0.093 3.2 23.7 23.3 9 0.106 2.9 20.6 20.5 10 0.119 2.5 18.0 18.1 11 0.134 2.3 15.9 16.2 12 0.149 2.0 14.2 14.5 13 0.165 1.8 12.7 13.1 14 0.182 1.7 11.5 11.8 15 0.200 1.5 10.4 10.8 16 0.219 1.4 9.4 9.9 17 0.238 1.3 8.6 9.1 18 0.259 1.2 7.9 8.3 19 0.280 1.1 7.3 7.7 20 0.302 1.0 6.7 7.2 21 0.325 0.9 6.2 6.6 22 0.349 0.9 5.8 6.2 Jämför tabell 1 och 2. Tillväxthastigheten vid 4 och 8 C är enligt modellen ovan oftast snabbare eller lika snabb som i litteraturdata för opastöriserad mjölk. Den beräknade lagtiden stämmer väl överens med Griffiths ekvation men tenderar att underskatta tiden något vid låga temperaturer. Detta har ingen betydelse eftersom tillväxtberäkningarna vid låg temperatur då blir worst case. I de följande beräkningarna har ekvationerna extrapolerats upp till 30 C, eftersom kurvan är linjär upp till temperaturoptimum [15]. Över optimum avtar tillväxthastigheten snabbt och mer komplicerad ekvation kan beskriva detta [16]. I avsaknad av data har tillväxthastigheten över 30 C satts till samma värde som för 30 C. Detta gör att lagfasens längd underskattas något, men eftersom nedkylningen i början går mycket snabbt så kan detta anses försumbart. Kylningen av mjölk på VMS-gårdar skiljer från konventionella gårdar genom att små mängder mjölk ständigt tillförs mjölktanken. Detta ställer särskilda krav på kylningstekniken vad gäller nedkylning av den första mjölken och kan leda till förlängda kyltider jämfört med konventionell mjölkning. Men det är endast de relativt små volymerna från de första timmarnas mjölk som riskerar att kylas långsamt och där bakterierna snabbast avslutar lagfasen. Senare kommer mjölkvolymer att hamna i en nedkyld mjölktank och lagfasen för dessa bakterier kommer att bli så lång att ingen tillväxt. I AMS-system sker också en ständig utspädning av mjölken. Utspädningen är störst för den tidigaste mjölken och blir med tiden procentuellt av mindre betydelse. Detta till skillnad från konventionell kylning där utspädningsfaktorn blir lika stor för varje mjölkningsmål. Utspädningsfaktorn är alltså större vid AMS. Vid beräkningar för VMS-kylning beräknas lagfasens längd först på samma sätt som för konventionell kylning. Därefter beräknas tillväxten i mjölken timmesvis, d.v.s. för den första timmens mjölk beräknas tillväxten från lagfasens slut fram till 48 timmar som om endast denna mjölk fanns i tanken. Sedan beräknas tillväxten med start från medeltemperaturen för nästa timme. För varje timme beräknas tid för lagfasens slut och eventuell tillväxt. Halten i mjölken korrigeras med den utspädning 13

som sker p.g.a. hela mjölkvolymen i tanken. Det aritmetiska medelvärdet av mjölken från varje timme beräknas och ger den slutliga bakteriehalten i tanken. Ett förenklat exempel på beräkningar i Excel kan studeras här: Exempel utspädning i robot.xlsx Resultat av beräkningar med modellen Kylning vid konventionell mjölkning Figur 6. Kylförlopp för en mjölktank med god kylkapacitet. 10000 35 30 1000 25 bakterier/ml 100 10 20 15 10 Temp. C totalantal bakterier psykrotrofa temp 5 1 0 0 50 100 150 Tid (min.) Figur 6 visar kylförloppet för mjölken i en tank med väl fungerande kylning. Mjölken har kylts ned till 4 C inom cirka 2 timmar. I exemplet har totalantalet bakterier satts till 10000 bakterier/ml och de psykrotrofa bakterierna till 100/ml. Under detta kylförlopp förutsäger modellen att de psykrotrofa bakterierna inte hinner lämna lagfasen. Figur 7 visar vad som händer efter samma kylförlopp vid mjölkens förvaring vid 4 C fram till hämtning. Bakterierna måste genomföra ytterligare anpassningsarbete innan lagfasen avslutas och det arbetet tar lång tid vid 4 C. Först efter 36 timmar börjar de psykrotrofa bakterierna tillväxa och har blivit 350/ml vid hämtning. Majoriteten av totalantalet bakterier består i detta fall av mesofila bakterier som inte kan föröka sig vid 4 C. Eftersom antalet mesofila bakterier är mycket högre än halten psykrotrofa bakterier märks praktiskt tagen ingen ökning av totalantalet (10000 + 350). Totalantalet bakterier är till synes oförändrat. 14

Figur 7. Bakterietillväxt under 2 dygn efter ett normalt kylförlopp 10000 35 30 1000 25 Bakterier/ml 100 10 20 15 10 Temperatur C Totalantal Psykrotrofa Temperatur 5 1 0 20 40 60 Tid (tim) 0 Om kyltiden istället är 3 timmar så ökar halten psykrotrofa bakterier till 490/ml, d.v.s. skillnaden är försumbar. Figur 7 är något förenklad eftersom det tillkommer ytterligare tre mjölkningsmål till tanken under 48 timmar vid konventionell mjölkning och detta leder till en något förhöjd temperatur i samband med att ny mjölk tillkommer (Figur 8). Temperaturökningen är dock liten och kortvarig och leder endast till att lagfasen förkortas till 33 timmar jämfört med 36 timmar i figur 6. Ökningen i halten psykrotrofa bakterier blir enligt modellen 570 bakterier/ml istället för 350/ml. Denna försumbara effekt har inte tagits med i fortsatta beräkningar. Eftersom lagfasen är 33-36 timmar hinner inte de bakterier som tillkommer vid mjölkning 2-4 att gå ur lagfasen. Det antas att bakteriehalten som tillförs tanken i dessa mål är den samma som i mål 1. Därför sker en utspädning av den bakteriehalt som uppnås genom tillväxt och halten blir något lägre (160/ml istället för 350) jämfört med ovan. Denna utspädning har inte tagits med i de följande figurerna (fig. 9-14) men nämns i texten. Utspädning och tillväxt i senare mjölkningsmål blir viktig i samband med jämförelser med AMS-mjölkning och redovisas där (tabell 5). Figur 8. Temperaturförändringar i mjölktanken vid fyra mjölkningstillfällen Temperatur C 35 30 25 20 15 10 5 0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 Timmar Figur 9 visar tillväxten efter normal kylning ned till 6 C och därefter förvaring vid denna tid fram till 48 timmar. Lagfasen förkortas till 26 timmar och halten psykrotrofa bakterier ökar till 3300/ml vilket 15

medför att totalantalet bakterier ökar från i det här fallet 10000 till 13300/ml (10800 efter korrektion för utspädning och tillväxt i mjölk från de andra mjölkningsmålen). En liten förändring i kyltemperaturen till 6 C under hela förvaringstiden innebar alltså att bakterietalet ökar märkbart om än marginellt (förutsatt att starthalten psykrotrofa bakterier är 100/ml). Däremot bör ett långsammare nedkylningsförlopp med 6 C under några få timmar inte ha större betydelse. Figur 9. Normal kylning, men temperaturen i kyltanken hamnar på 6 C 100000 35 10000 30 25 Bakterier/ml 1000 100 10 20 15 10 5 Temperatur C Psykrotrofa Totalantal Temp. ( C) 1 0 20 40 60 Tid (timmar) 0 Figur 10 visar ett exempel där kylningen fungerat normalt fram till 10 C, men där kylningen avstannar i 5 timmar för att sedan komma igång igen. Den längre tiden vid 10 C medför att lagfasarbetet även i detta fall går snabbare och de psykrotrofa bakterierna börjar tillväxa redan efter 29 timmar. Vid 48 timmar har de förökat sig från 100/ml till 900/ml vilket innebär att totalantalet bakterier har ökat till 10900 (10200 efter korrektion för utspädning i senare mjölkningsmål), som är en marginell ökning. Tack vare att temperaturen snabbt går ned till 4 C efter stoppet vid 10 C så blir konsekvensen inte större än i föregående exempel. Men om ursprungshalten psykrotrofa bakterier var 1000/ml istället för 100/ml så skulle förökningen blivit 2000/ml med följd att totalantalet blev 12000/ml. Figur 10 Förlopp där kylningen upphör under 5 timmar vid 10 C. 100000 35 10000 30 25 Bakterier/ml 1000 100 10 20 15 10 5 Temperatur C Psykrotrofa Totalantal Temp. ( C) 1 0 20 40 60 Tid (timmar) 0 16

Figur 11 visar vad som händer om mjölken står varm vid 30 C i 3 timmar innan kylningen kommer igång. Lagfasen är då slut redan efter 8 timmar för det första mjölkningsmålet. De psykrotrofa bakterierna, som antas vara 1000/ml (obs!) från början i detta exempel, hinner föröka sig till 100000/ml och dominerar helt totalantalet bakterier (110000/ml). Om halten psykrotrofa bakterier istället hade varit 100/ml så skulle totalantalet bakterier ha blivit 20000/ml. (110000/ml blir 35000/ml efter korrektion för utspädning i senare mjölkningsmål). Mjölken är nedkyld vid det andra mjölkningsmålet vilket innebär att lagfasen för den mjölken blir för lång för att tillväxt ska ske. Figur 11. Mjölken står varm vid 30 C i tre timmar. 1000000 35 100000 30 Bakterier/ml 10000 1000 100 10 25 20 15 10 5 Temp. C totalantal bakterier psykrotrofa Temp 1 0 20 40 Tid (tim) 0 Ytterligare exempel på liknande scenarier med olika tid vid 30 C visas i tabell 4. I dessa exempel har korrektion gjorts för utspädning i senare mjölkningsmål. Tabellen visar att mjölken kan tåla 1-2 timmar vid 30 C beroende på om halten psykrotrofa bakterier är hög eller låg. Tabell 4. Inverkan av förlängd temperatur vid 30 C före kylning på lagfasens längd och bakterietillväxt vid efterföljande lagring vid 4 C för tankmjölk. Totantal vid hämtn. Temp Tid (tim) Starthalt psykr. Start totalantal Lagfas tim Psykr. vid hämtning 30 0.25 100 10000 36 100 10100 30 0.25 1000 10000 36 1700 11000 30 1 100 10000 26 300 10300 30 1 1000 10000 26 3100 13100 30 2 100 10000 18 790 10790 30 2 1000 10000 18 7900 17900 30 3 100 10000 8 10000 20000 30 3 1000 10000 8 25000 35000 Ursprungshalten psykrotrofa bakterier kommer att ha stor betydelse för hur lång tid mjölken kan tåla långsam kylning innan totalantalet bakterier ökar. Figur 12 visar totalantalet bakterier i mjölken efter 48 tim, dels när mjölken kylts normalt till 4 C inom två timmar och dels när mjölken endast kylts ned till 6 C och sedan förvarats vid denna temperatur. Totalantalet (mesofila) bakterier vid starten antas 17

vara 10000/ml. Figuren visar totalantalet (mesofila och psykrotrofa) bakterier som uppnås på 48 timmar förutsatt olika ursprungshalt av psykrotrofa bakterier (1-10000/ml d.v.s. log 0 till log 4/ml). Totalantalet förändras endast marginellt vid 4 C med en ursprungshalt upp till 1000 psykrotrofer/ml (log 3) (jämför figur 7), medan motsvarande situation gäller vid 6 C upp till 100/ml (log 2) (jämför figur 8). Om ursprungshalten är 1000/ml förökas totalantalet till 40000/ml (halterna ej korrigerade för utspädning). Figur 12. Inverkan av den ursprungliga halten psykrotrofa bakterier, på totalantalet bakterier efter 48 tim efter normal nedkylning till 4 C respektive vid nedkylning till 6 C 350000 300000 Effekt av lagring vid 6 C istället för 4 C Totalantal/ml 250000 200000 150000 100000 Kyltid 2 tim 4 C 6 C 46 tim 50000 0 0 1 2 3 4 5 Log psykrotrofa/ml Om det sker allvarligare störningar i kylningen så blir den ursprungliga psykrotrofhalten alltmer viktig. Figur 13 visar två scenarier där mjölken stått vid 10 C i 5 timmar innan den kylts ned till 4 C samt där mjölken stått 3 timmar vid 30 C i 3 timmar före nedkylning. Vid 10 C-fallet påverkas inte totalantalet bakterier om den ursprungliga psykrotrofhalten är 100/ml (jämför figur 9), men vid 1000/ml blir totalantalet 17000/ml och ökar ytterligare vid högre halter psykrotrofa bakterier. Om mjölken får stå varm vid 30 C blir den ursprungliga psykrotrofhalten helt avgörande. Endast om denna är 10/ml eller lägre sker det ingen mätbar ökning i totalantalet. Vid 100/ml blir totalantalet 20000/ml och vid 1000/ml uppnås 110000/ml. 18

Figur 13. Inverkan av den ursprungliga halten psykrotrofa bakterier, på totalantalet bakterier efter 48 tim vid olika kylningsstörningar före nedkylning till 4 C 120000 100000 Effekt av olika kylningsstörningar Totalantal/ml 80000 60000 40000 20000 5 tim 10 C 3 tim 30 C 0 0 1 2 3 4 5 Log psykrotrofa/ml Kylning i VMS-system För att illustrerar effekten av utspädning och därmed lägre bakteriehalt i VMS-system gjordes beräkningar för olika exempelscenarier för psykrotrofa bakterier. Beräkningarna har också gjorts för konventionell mjölkning med samma temperaturprofil och här har tagits med den utspädning som sker även vid konventionell mjölkning. I tabell 5 visas en jämförelse mellan tillväxten av psykrotrofa bakterier om mjölken förvarats i kyltank i ett AMS-system eller vid konventionell mjölkning, vid 4 olika scenarier (A-D). Olika antaganden om ursprungshalten psykrotrofa bakterier har gjorts. A) Mjölken står i kyltanken vid 27 C i cirka 1 timme. Därefter slås kylkompressorn på och temperaturen är nere i 4 C efter ytterligare 1,5 timme (figur 14). Lagfasen blir under dessa förhållanden 34 timmar för den första mjölken som hamnar i tanken. Halten mesofila bakterier antas vara 10.000/ml i alla exempel och redovisas inte här, men ska läggas till halterna i tabellen för att få totalantalet bakterier. Det är tydligt att bakteriehalten vid hämtning blir jämförbar i AMS och i konventionella system under dessa förhållanden på grund av effektiv kylning även om halterna i AMS är något lägre. Om den ursprungliga psykrotrofhalten är låg så påverkas inte bakteriehalten nämnvärt i någondera av systemen (jämför figur 7). 19

Figur 14 exempel på nedkylningsprofil i AMS 30.0 25.0 Temperatur C 20.0 15.0 10.0 5.0 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Tid (timmar) B) Mjölken kyls kontinuerligt under mjölkningen. 4 C nås efter cirka 4,5 timmar (figur 15). Lagfasen blir 30 timmar för den första mjölken. Tillväxten blir något högre vid konventionell mjölkning jämfört med den i föregående exempel på grund av kortare lagfas, men det är ingen stor skillnad på halterna vid hämtning i de två systemen (kylning i AMS ger hälften så höga halter av psykrotrofer som vid konventionell kylning). Även i detta exempel kyls mjölken relativt effektivt och vid låga ursprungshalter har skillnaden ingen praktisk betydelse. Figur 15 Ytterligare ett exempel nedkylningsprofil i AMS 40 35 Temperatur C 30 25 20 15 10 5 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Tid (timmar) C) Mjölken kyls långsamt. Efter 2 timmar är temperaturen 10 C, temperaturen fluktuerar därefter och 8 C uppnås efter 3,5 timmar och temperaturen ligger stabilt runt 4 C först efter 7 timmar. Lagfasen blir 29 timmar för den första mjölken. Det blir något större skillnad mellan systemen men påverkan vid låg halt psykrotrofer blir liten. Eftersom merparten av det långsamma kylningsförloppet sker under 10 C och att temperaturen fluktuerar under denna så blir effekten på totalantalet bakterier efter 48 timmar begränsad (jämför figur 10). Det är dock tydligt att kylning i AMS är mindre känslig för långsam kylning än i konventionella system. D) Mjölken står i tanken i 2 timmar vid 30 C innan kylningen startar. Därefter följer samma temperaturprofil som i exempel C ovan, fast förskjutet med 2 timmar. Lagfasen förd en första mjölken blir 9 timmar. Det innebär lång tid för tillväxt i mjölken som startar redan i det första mjölkningsmålet vid konventionell kylning. Halterna blir därför dramatiskt höga och helt oacceptabla redan vid låga ursprungshalter (jämför tabell 4). Vid kylning i VMS blir bakterieutvecklingen betydligt 20

lägre och vid låga ursprungshalter (40-100 psykrotrofer/ml) tål mjölken detta extremt långsamma kylningsförlopp. En förklaring till detta är att andelen mjölk som utsätts för hög temperatur är mycket lägre i VMS, där endast de första timmarnas mjölk (några hundratal liter) lämnar lagfasen snabbt, men att senare mjölk kyls ned effektivt till 4 C vilket gör att tillväxten i denna mjölk blir minimal på grund av lång lagfas. Mjölken späds dessutom ut successivt med ny mjölk. Vid konventionell mjölkning riskerar all mjölk i det första mjölkningsmålet att lämna lagfasen tidigt vilket ger höga bakterietal. Tabell 5. Jämförelse mellan beräknad tillväxt av psykrotrofa bakterier vid kylning i AMS-system och vid konventionell mjölkning efter 48 timmar med identiskt kylningsförlopp. A) 1tim vid 27 C, 4 C efter 2,5 tim, lag 34 tim B) Kylning till 4 C efter 4,5 tim, lag 30 timmar Starthalt Konv slut AMS slut Starthalt Konv. slut AMS slut 40 30 45 40 110 45 100 200 110 100 280 110 500 980 560 500 1370 560 1000 1960 1110 1000 2750 1130 C) Långsam kylning, 7 timmar till 4 C, lag 29 timmar D) 2 tim vid 30 C och långsam kylning 7 tim till 4 C, lag 9 timmar Starthalt Konv slut AMS slut Starthalt Konv slut AMS slut 40 160 50 40 5100 610 100 400 130 100 12800 1530 500 1990 650 500 64100 7700 1000 3980 1300 1000 129000 15300 Undersökning av kylning och psykrotrofa bakterier vid några gårdar Tabellen ovan visar tydligt att halten psykrotrofa bakterien i mjölken som hamnar i tanken är av stor betydelse för i vilken mån tillväxt kommer att ske till nivåer som påverkar totalantalet bakterier. Vi vet inte vilken starthalt som är vanlig i Sverige idag. En begränsad undersökning gjordes i samband med ett SLF-projektet Samband mellan bakterietal och diskparametrar på AMS-gårdar Förstudie [35]. I detta projekt jämfördes disk- och hygienförhållandena på fyra gårdar med låga totalantal bakterier med 4 gårdar med genomgående höga bakterietal (genomsnitt 10000/ml respektive 36000/ml). Extra analyser av tankmjölk vid hämtning gjordes som ett komplement till projektet, se tabell 6. Analyserna gjordes vid två tillfällen. Enterobacteriaceae är en grupp gramnegativa bakterier som är vanliga bl.a i kons tarm och i stallomgivningen. Gramnegativa bakterier är en större grupp som också innefattar psykrotrofa bakterier t.ex. Pseudomonas. Det var stor skillnad i halten gramnegativa bakterier och Enterobacteriaceae mellan gårdar med låga respektive höga totalantal bakterier. För gårdar med låga totalantal understeg halterna nästan alltid 100/ml och var oftast under 10/ml vid hämtning. För gruppen med höga totalantal varierade halten gramnegativa bakterier mellan 50 och 740 bakterier/ml. Flertalet Enterobacteriaceae är inte psykrotrofa men fångas ändå upp i analysen av gramnegativa bakterier. Endast i tre fall (röda siffror) kan man med säkerhet säga att det är en signifikant skillnad i analysresultat d.v.s. maximal halt gramnegativa psykrotrofa bakterier i H-gruppen var 740/ml och i övrigt betydligt lägre. Kyltiderna till 4 C varierade i genomsnitt mellan 2,8 och 6,5 timmar. Exemplet i tabell 4C kommer från en H-gård. Resultaten visar att åtminstone för dessa åtta gårdar var starthalterna psykrotrofa bakterier låga (jämför tabell 5) och att det då inte sker någon kraftig tillväxt av gramnegativa bakterier, trots att kylprofilerna oftast avvek från mejeriernas krav på nedkylning till 4 C inom 2-3 timmar. 21