Gula boken / RAM hemsida 1(7) Pneumocystis jiroveci pneumonia (PCP) Victor Fernandez, Smittskyddsinstitutet, 060403. Smittämnet Pneumocystis jiroveci (tidigare P. carinii) är en atypisk svamp som infekterar lungorna hos människa [Wakefield, 2002]. Molekylära studier har visat att det finns olika Pneumocystis arter var och en infekterande en specifik mammalievärdorganism [Demanche et al, 2001]. Livscykeln hos Pneumocystis tillväxtstadier antas innehålla en asexuell form och en sexuell övergångsform. Alla kända tillväxtstadier återfinns i värdorganismens lungalveoler och inkluderar en amöboid mononuklerad trofozoit, en precysta och en mogen cysta som innehåller intracystiska kroppar (sporer) som kan utvecklas till trofozoiter. En systematisk analys av livscykeln har inte kunnat genomföras eftersom det inte är möjligt att odla organismen in vitro. Patogenes och patofysiologi Patogenesmekanismerna för pneumocystos är inte kända. Förmodligen överförs smitta genom inhalation av cystor från omgivningen. Intracystiska kroppar utsöndras sedan i lungalveolerna där de utvecklas till trofozoiter som selektivt binder till typ I pneumocyter. Denna kolonisation av alveolärt endotel leder till en reducerad halt av protein med ytspänningsnedsättande egenskaper och till förändringar i den lokala cellpopulationen inklusive en reduktion av antalet alveolära makrofager, nekros av typ I pneumocyter och tillväxt av typ II pneumocyter. Ytterligare konsekvenser av framskriden infektion är skador på den alveokapillära barriären, pulmonärt ödem samt grava störningar av gasutbytet i lungorna. Symtom och klinisk bild (pneumoni) P. jiroveci-infektioner, även kallade pneumocystoser, manifesterar sig i tre olika kliniska varianter: 1) den infantila eller interstitiella plasmacellspneumonin som återfinns främst hos prematurt födda eller undernärda barn. 2) pneumoni hos individer med nedsatt immunförsvar som t.ex. aids-patienter, transplantations patienter eller patienter som genomgår kemoterapi. 3) en sällan förekommande extrapulmonell eller disseminerad form. Subklinisk kolonisation av lungalveoler är vanligt förekommande. Typiska symtom innefattar torrhosta, feber, viktminskning, frossa, bröstsmärta, progressiv dyspne och cyanos. Även om sjukdomsförloppet kan vara snabbt utvecklas symtomen normalt gradvis och kan förekomma flera månader innan diagnosen kan fastställas. Radiologiskt karakteriseras Pneumocystis pneumoni (PCP) av bilaterala diffusa eller interstitiella infiltrat som kan liknas vid krossat glas. Det är mycket ovanligt att P. jiroveci-infektioner ger extrapulmonära manifestationer. Epidemiologi och prevention P. jiroveci är vanligt förekommande och i de flesta fall har barn exponerats vid tre till fyra års ålder. Även om teorier som postulerar att sjukdomen orsakas av aktivering av en latent infektion har förekommit sedan länge visar nya data att återinfektion är en vanlig företeelse [Morris et al, 2002]. Studier med känslig PCR-baserad detektion ger vid handen att exponering av immunkompetenta vuxna resulterar i en kortvarig kolonisation eller subklinisk infektion [Sing et al, 1999]. Sjukdomen överförs troligen som luftburen smitta [Olsson et al, 1998]. Samlade data tyder dels på att person till
Gula boken / RAM hemsida 2(7) person smitta lär äga rum dels så att späd- och småbarn kan utgöra tillfälliga reservoarer [Pifer et al, 1978; Lundgren et al, 1997]. Det är inte känd huruvida en omgivningsreservoar existerar. Profylax har reducerat incidensen av PCP. De vanligaste preparaten vid prevention är trimethoprim-sulfamethoxazole (peroralt) som förstavalsalternativ och nebuliserad pentamidine. Provtagning och transport Ett flertal provmaterial från bronksköljvätska till munsköljvätska kan användas för Pneumocystis-diagnostik. Diagnostikens känslighet är avhänglig av hur representativt provmaterialet är. Generellt gäller därför att ett så representativt provmaterial (med förekomst av alveolärmakrofager) som möjligt bör eftersträvas. Provtagning Bronksköljvätska (BAL) Bronksköljvätska är det mest representativa provmaterialet. Vid bronkoskopi erhålls BAL genom sköljning med ca 200 ml kroppstempererad fysiologisk koksaltlösning i portioner om ca 50 ml. BAL kan även erhållas från intuberade patienter utan bronkoskopi. För Pneumocystis-analys erfordras 5-10 ml BAL. Sputum Inducerat sputum (inhalationsinducerat) Ett alternativ till BAL är sputum som erhålles efter 10-20 min inandning av nebuliserad 3 % koksaltlösning. Patienten bör undvika fast föda före provtagning. Patienten bör borsta tänder (utan tandkräm), tunga och munhålans slemhinnor samt gurgla och snyta sig före provtagningen. Ej inducerat sputum Vanligt sputumprov, helst taget med hjälp av sjukgymnast, kan användas för Pneumocystis-diagnostik, men provmaterialet är vanligen mindre representativt än inducerat sputum eller BAL. Övrigt provmaterial från luftvägar I de fall varken bronksköljvätska eller sputum kan erhållas, t.ex. från små barn, patienter med blödningsbenägenhet och trakeostomerade patienter, kan trakealsekret, nasofarynxsekret eller munsköljvätska användas. För tillräcklig analytisk känslighet krävs PCR-analys för dessa material. Lungvävnad Pneumocystis kan också påvisas i vävnadsprov från lungorna. Biopsin läggs i fysiologisk koksaltlösning. Transport Samtliga prov transporteras i tättslutande rör/burk med ytterhylsa. Kyl eller frystransport erfordras ej.
Gula boken / RAM hemsida 3(7) Laboratoriediagnostik Allmänt Som förstahandsmetod för påvisning av Pneumocystis rekommenderas BAL-prov kombinerad med immunmorfologi. PCR är känsligare än immunmorfologi och kan rekommenderas som förstahandsmetod när invasiv provtagningsteknik ej kan användas. Referensmetodik Immunmorfologi infärgning med monoklonal antikropp. Ett flertal kommersiella kit för immunmorfologisk diagnostik finns på marknaden. Meridian: MeriFluor Pneumocystis artikelnr 250050 Biorad: Monofluo Pneumocystis carinii IFA Test kit art nr 32515 Båda dessa kit innehåller direktkonjugerade monoklonala antikroppar som färgar in både trofozoit och cyststadium. Detaljerade instruktioner medföljer varje kit. Känsligheten för cystpåvisning är god men vissa svårigheter att känna igen trofozoiter föreligger och tillverkarna rekommenderar endast positivt svar vid cystpåvisning. Vid SMI används en indirekt immunmorfologisk metod som innefattar flera olika steg och är arbets- och tidskrävande [Elvin et al, 1988]. Den har visat hög specificitet och sensitivitet jämfört med andra immunmorfologiska metoder. På grund av metodens komplexitet rekommenderar vi den ej som rutinmetod på mikrobiologiska laboratorier. Den rekommenderas dock som referensmetod för validering av andra metoder. Resistensbestämning och resistensutveckling Sulfaderivat med antifolataktivitet har varit de viktigaste preparaten för terapi och profylax av PCP under de senaste 30 åren. Utveckling av resistens mot sulfa hos P. jiroveci har postulerats genom de specifika förändringar som har hittats i genen som kodar för dihydropteroatsyntas (DHPS) som är det enzym i folsyracykeln som inhiberas av sulfapreparat. Sulfaresistens som förorsakas av mutationer i dhps-genen är vanligt förekommande hos både patogena bakterier och protozoer. Mutationer som ger förändringar i kodon 55 och 57 i P. jiroveciis dhps-gen kan korreleras med misslyckad profylax och behandling av PCP [Helweg-Larsen et al, 1999; Takahashi et al, 2000]. Antibiotikaresistens kan inte fastställas på konventionellt sätt eftersom det inte går att odla P. jiroveci in vitro. Epidemiologisk typning Konventionella metoder som t.ex. serotypning har inte kunnat användas för att differentiera isolat av P. jirovecii. All nuvarande typning är baserad på genetiskapolymorfismer i ett flertal loci inkluderande mitokondriella rrna-gener (mtssu och mtlsu), ITS1 och ITS2 i det nukleära rdna och, bland andra, aromlokuset. För närvarande tycks analys av ITS1- och ITS2-regionerna med fler än 70 olika identifierade genotyper vara mest informativt för att påvisa biovariation hos P. jiroveci [Lee et al, 1998].
Gula boken / RAM hemsida 4(7) Alternativ diagnostik PCR Användning av PCR för påvisning av Pneumocystis DNA är ett område under ständigt utveckling men metoden rekommenderas endast som ett andrahandsalternativ för detektion av Pneumocystis i BAL och inducerat sputum (immunomorfologi är förstahandsval). Däremot är PCR att föredra i kliniska prover med lägre diagnostiskt utbyte, t.ex. icke-inducerat sputum, trakealsekret, nasofarynxsekret eller munsköljvätska. Ett antal PCR-baserade metoder för detektion av Pneumocystis har beskrivits som använder olika DNA sekvenser för amplifiering, t.ex. mitokondriellt DNA som kodar för ribosomalt RNA (rrna) eller MSG (Major Surface Glycoprotein) DNA [Wakefield et al, 1991; Huang et al, 1999]. Studier av dessa metoder har påvisat en högre känslighet för detektion av P. jiroveci jämfört med histokemisk färgning och immunomorfologi i BAL och även i icke-invasivt provmaterial. Den högre känsligheten hos PCR har inte bara medfört att P. jiroveci kan påvisas tidigt i kliniska infektioner utan också hos patienter som aldrig utvecklar PCP (upp till 20% av fallen). Det senare tyder på en asymptomatisk kolonisering av vissa individer som kan agera som bärare av smittämnet/sjukdomen. Behandling av dessa patienter med en positiv PCR-reaktion i BAL eller inducerat sputum men med negativ immunomorfologi är en kontroversiell fråga men en uppföljning av dessa individer rekommenderas. Vid SMI används för närvarande för diagnostik en s k nested PCR-metod i två steg, baserad på amplifiering av den mitokondriella genen för den stora subenheten av rrna. Alla prov oavsett begäran om PCR, analyseras på SMI först med immunmorfologi. PCR-metoden används sedan som ett känsligare komplement. På provsvaret anges alltid att påvisning av P. jiroveci DNA med negativ immunomorfologi kan tyda på en begynnande klinisk PCP eller en temporärt subklinisk kolonisation. Utvecklingen av realtids-pcr under senare år har öppnat möjligheten att direkt kvantifiera P. jiroveci i kliniskt provmaterial. Detta gör det möjligt att mer objektivt skilja på asymptomatisk kolonisation och PCP. Histokemiska metoder Traditionellt har histokemiska färgningsmetoder använts för påvisning av Pneumocystis. Dessa färgmetoder är relativt enkla och kräver ingen avancerad utrustning. De har dock låg känslighet jämfört med infärgning med monoklonal antikropp eller PCR. Giemsafärgning Enkel och snabb metod med låg känslighet då endast trofozoiter och sporozoiterna inuti cystorna färgas. Kräver BAL av hög kvalitet och mycket erfaren avläsare. Toluidine blue O färgning Metod som endast färgar cystor. Problematisk eftersom andra svampar (främst Candida) också färgas in och kan vara svåra att differentiera från Pneumocystis [Gosey et al, 1985].
Gula boken / RAM hemsida 5(7) Silverfärgning - Grocottfärgning Svampfärgningsmetod som används på patologilaboratorier [Grocott, 1955]. Begränsningar som vid Toluidine blue O färgning. Calcofluor white (Fungiflour, Polysciences Inc., Warrington, Pa) Färgar kitin i cystväggen [Stratton et al, 1991]. Kräver UV mikroskop. Kvalitetskontroll Internkontroll - Immunmorfologi Positiv kontroll från humanmaterial innehållande Pneumocystis färgas vid varje analystillfälle. För prepareringen av positiv kontroll vid immunmorfologi se kitbeskrivning. Internkontroll - PCR Pneumocystis DNA från humanmaterial ingår vid varje analystillfälle. Externkontroll Inga externa kvalitetsprogram för Pneumocystis immunmorfologi eller PCR finns tillgängliga. Nationella eller internationella provningsjämförelser rekommenderas. Svarsrutiner Immunmorfologi Cystor/trofozoiter av Pneumocystis jiroveci påvisade/ej påvisade PCR Pneumocystis jiroveci DNA påvisade/ej påvisade. Laboratorierapportering Pneumocystis är ej anmälnigspliktig enligt smittskyddslagen.
Gula boken / RAM hemsida 6(7) References Demanche C, Berthelemy M, Petit T, Polack B, Wakefield AE, Dei-Cas E, Guillot J. Phylogeny of Pneumocystis carinii from 18 primate species confirms host specificity and suggests coevolution. J Clin Microbiol 39:2126-2133 (2001). Elvin KM, Bjorkman A, Linder E, Heurlin N, Hjerpe A. Pneumocystis carinii pneumonia: detection of parasites in sputum and bronchoalveolar lavage fluid by monoclonal antibodies. British Med J 297:381-384 (1988). Gosey LL, Howard RM, Witebsky FG, Ognibene FP, Wu TC, Gill VJ, MacLowry JD. Advantages of a modified toluidine blue O stain and bronchoalveolar lavage for the diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. J Clin Microbiol 22:803-807 (1985). Grocott RG. A stain for fungi in tissue sections and smears using Gomori's methenamine-silver nitrate technic. Am J Clin Pathol 25:975-979 (1955). Helweg-Larsen J, Benfield TL, Eugen-Olsen J, Lundgren JD, Lundgren B. Effects of mutations in Pneumocystis carinii dihydropteroate synthase gene on outcome of AIDS-associated P. carinii pneumonia. Lancet 354:1347-1351 (1999). Huang SN, Fischer SH, O'Shaughnessy E, Gill VJ, Masur H, Kovacs JA. Development of a PCR assay for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia based on amplification of the multicopy major surface glycoprotein gene family. Diagn Microbiol Infect Dis 35:27-32 (1999). Lee CH, Helweg-Larsen J, Tang X, Jin S, Li B, Bartlett MS, Lu JJ, Lundgren B, Lundgren JD, Olsson M, Lucas SB, Roux P, Cargnel A, Atzori C, Matos O, Smith JW. Update on Pneumocystis carinii f. sp. hominis typing based on nucleotide sequence variations in internal transcribed spacer regions of rrna genes. J Clin Microbiol 36:734-741 (1998). Lundgren B, Elvin K, Rothman LP, Ljungstrom I, Lidman C, Lundgren JD. Transmission of Pneumocystis carinii from patients to hospital staff. Thorax 52:422-424 (1997). Morris A, Beard CB, Huang L. Update on the epidemiology and transmission of Pneumocystis carinii. Microbes Infect 4:95-103 (2002). Olsson M, Lidman C, Latouche S, Bjorkman A, Roux P, Linder E, Wahlgren M. Identification of Pneumocystis carinii f. sp. hominis gene sequences in filtered air in hospital environments. J Clin Microbiol 36:1737-1740 (1998). Pifer LL, Hughes WT, Stagno S, Woods D. Pneumocystis carinii infection: evidence for high prevalence in normal and immunosuppressed children. Pediatrics 61:35-41 (1978).
Gula boken / RAM hemsida 7(7) Sing A, Roggenkamp A, Autenrieth IB, Heesemann J. Pneumocystis carinii carriage in immunocompetent patients with primary pulmonary disorders as detected by single or nested PCR. J Clin Microbiol 37:3409-3410 (1999). Stratton N, Hryniewicki J, Aarnaes SL, Tan G, de la Maza LM, Peterson EM. Comparison of monoclonal antibody and calcofluor white stains for the detection of Pneumocystis carinii from respiratory specimens. J Clin Microbiol 29:645-647 (1991). Takahashi T, Hosoya N, Endo T, Nakamura T, Sakashita H, Kimura K, Ohnishi K, Nakamura Y, Iwamoto A. Relationship between mutations in dihydropteroate synthase of Pneumocystis carinii f. sp. hominis isolates in Japan and resistance to sulfonamide therapy. J Clin Microbiol 38:3161-3164 (2000). Wakefield AE, Guiver L, Miller RF, Hopkin JM. DNA amplification on induced sputum samples for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. Lancet 337:1378-1379 (1991). Wakefield AE. Pneumocystis carinii. Br Med Bull 61:175-188 (2002).