30. Undersökning av aminosyror i surkål VAD GÅR LABORATIONEN UT PÅ? Du ska l ära dig tekniken vid tunnskiktskromatografi, TLC undersöka vad som händer med proteinerna och polysackariderna vid mjölksyrajäsning av vitkål använda tunnskiktskromatografi för att separera de aminosyror som bildas av proteinerna identifiera de separerade aminosyrorna utföra några enkla test på surkålsspadets innehåll Mjölksyrajäsning Mjölksyrajäsning är en typ av fermentering (jäsning) av livsmedel och innebär att livsmedlet delvis oxideras. Oxidationen sker genom inverkan av enzymer som finns i bakterier av släktet Lactobacillus. De räknas till mjölksyrabakterierna. Det är några av dessa bakterier som gör att färsk mjölk omvandlas till filmjölk. Mjölksyrajäsning kan användas som konserveringsmetod. Det beror på att den bildade mjölksyran sänker ph så mycket att andra bakterier inte kan föröka sig. Samtidigt med fermenteringen sker en viss förändring av livsmedlet. Bl.a. bryts proteiner och polysackarider ned till mindre molekyler. Surkål Surkål är exempel på en mjölksyrajäst grönsak. Mjölksyrajäsning var ursprungligen en konserveringsmetod för råvaror och livsmedel. Men vissa fermenterade livsmedel har också andra fördelar och därför anses t.ex. surkål vara nyttig mat (se uppgift 3, Experiment B). Surkål kan tillverkas på följande sätt: Strimla vitkål och banka strimlorna med en mortelpistill. Lägg dem sedan i ett glaskärl eller en rostfri skål. Häll en koksaltlösning (masshalten koksalt ca 1,5 %) över kålen så att den precis täcks av vätskan. Pressa ned kålen med hjälp av en tallrik och en tyngd så att kålen inte kommer i kontakt med luft. Låt skålen stå i rumstemperatur ca 1 vecka. Du ska nu undersöka vad som händer med kålen när mikroorganismerna bearbetar den i anaerob miljö och då använda en kromatografiteknik som kallas tunnskiktskromatografi. Liber AB. Denna sida får kopieras. 104
Tunnskiktskromatografi teori Man använder ofta tunnskiktskromatografi, TLC (Thin-Layer Chromatography), för att separera och identifiera små joner och molekyler, t.ex. aminosyror. Några droppar av provlösningen appliceras ( fästs ) på en plast- eller glasplatta som är täckt med ett inert, poröst material, t.ex. kiselgel (porösa korn av kiseldioxid). Plattan ställs sedan ner i en behållare med lite vätska, det s.k. elueringsmedlet, se figur. Elueringsmedlet är en blandning av olika lösningsmedel. I denna laboration ska du använda ett elueringsmedel som innehåller vatten, saltsyra, propanol och butanon. Vätskeblandningen sugs in i det porösa skiktet på kromatografiplattan. Vätskan bildar där en mobil (rörlig) fas som sakta vandrar fram genom den stationära (stillastående), fasta fasen. Lösningsmedlen väljs så att ett av dem adsorberas starkare till den stationära fasen än de andra. På kornen bildas ett tunt vätskeskikt där det särskilt starkt adsorberade lösningsmedlet dominerar. Denna adsorberade, stationära vätskefas har alltså en annan sammansättning än den mobila vätskefasen. Kiselgelen på de TLC-plattor som du ska använda adsorberar framför allt vatten. plastfilm prover elueringsmedel ;;;; yyyy ;;;; yyyy ;;;; yyyy När lösningsmedelsfronten kommer fram till startpunkten den punkt där ett prov applicerats löses de ämnen som ingår i provet. Ämnena fördelas på olika sätt mellan den adsorberade, stationära lösningsmedelsfasen och den mobila vätskefasen alltefter ämnenas löslighet i de båda faserna. En viss del av ett ämne kommer att finnas i den stationära vätskefasen, resten i den mobila fasen. Varje ämne fördelas mellan de båda faserna så att följande jämvikt en fördelningsjämvikt ställer in sig: ämne A (i stationär vätskefas) ämne A (i mobil vätskefas) För varje ämne kan man ange en jämviktskonstant [A (mobil)] K = [A (stationär)] Man har valt elueringsmedel så att de ämnen som ingår i provet får olika värden på jämviktskonstanten. Därför kommer ämnena att föras framåt med olika hastighet: det ämne som har störst löslighet i den stationära vätskefasen (dvs minst K) vandrar långsammast medan det ämne som är lösligast i den mobila vätskefasen (störst K) rör sig snabbast. Ämnenas molekyler vandrar ständigt mellan den stationära fasen och den mobila fasen så att fördelningsjämvikten behålls under vandringen. Kromatograferingen avbryts när vätskefronten närmar sig plattans övre kant. Innan man lokaliserar och identifierar de olika ämnena måste kromatogrammet torkas och ev. också framkallas med något färgreagens eller belysas med UV-ljus av lämplig våglängd. De olika ämnena kommer då att synas som färgade eller mörkare fläckar. Liber AB. Denna sida får kopieras. 105
EXPERIMENT A. TUNNSKIKTSKROMATOGRAFI Utrustning 1 eller 2 tunnskiktsplattor med beläggning av silikagel (kiseldioxid), 1 eller 2 kromatografikärl eller bägare 400 cm 3 hög modell, plastfilm (som lock till bägarna), några kapillärrör, pincett, värmelampa eller hårtork. Kemikalier Spad från surkål (helst egen tillverkning men den kan också köpas i hälsokostaffär). Späd en volymsdel surkålsspad med två volymsdelar etanol. Filtrera den uppkomna fällningen. Referenslösningar (5 mg/cm 3 ) av följande aminosyror: alanin, leucin, valin, asparaginsyra, prolin och glutamin. Elueringsvätska: propanol, butanon och saltsyra (3,0 mol/dm 3 ) i volymsproportionerna 12:3:5. Framkallare: Etanol-eller acetonlösning av ninhydrin (masshalt 1 %) Utförande 1. Häll elueringsvätska i ett kromatografikärl till ca 0,5 cm höjd. Skaka kärlet så att väggarna blir fuktade. Lägg på locket eller sätt parafilm över kärlet. Låt det sedan stå några minuter. Då blir luften i kärlet mättad med elueringsmedlets ångor. 2. Ta fram en tunnskiktsplatta 1. Använd pincett. OBS! Ta inte med fingrarna på plattans beläggning. Risk för föroreningar som stör analysen! Markera svagt på plattan/plattorna en baslinje som figuren visar (använd t.ex. en blyerts). Märk ut åtta punkter på denna linje. Numrera dem 1 8. (Använder du två plattor anpassar du punkterna till detta.) 3. Gör upp en tabell med rubriken Tabell 1. Aminosyror i referenslösningarna enl. modellen på s. 105. Anteckna i tabellen att du ska applicera spad från surkålen i punkterna 3 och 6 på plattorna och referenslösningar i de övriga punkterna (se figur). 1,5 2 cm 1 2 3 4 5 6 7 8 1 Läraren bör på förhand ha klippt ut plattor som passar till kromatografikärlet/bägaren. Eventuellt måste två plattor användas. Liber AB. Denna sida får kopieras. 106
4. Applicera lösningarna i de angivna punkterna på följande sätt: Doppa en kapillärpipett i en av lösningarna. Torka av spetsen mot ett filtrerpapper. Tryck pipettspetsen lätt mot en av punkterna på plattan. Torka fläcken försiktigt med en värmelampa eller med varmluft från en hårtork. Upprepa proceduren ett par gånger med samma lösning. (Genom att applicera flera små droppar och torka mellan varje droppe får man mindre och mer koncentrerade provfläckar än om man sätter på flera droppar på en gång.) Applicera på samma sätt de övriga lösningarna. 5. Sätt försiktigt ned plattan i kromatografikärlet (se figur s. 102). OBS! Baslinjen får inte nå ned i elueringsvätskan. 6. Låt plattan stå i ca 45 min. Utför under tiden experiment B. 7. Ta upp plattan ur kromatografikärlet. Markera vätskefrontens läge. 8. Torka plattan i ett värmeskåp vid ca 100 º C. 9. Framkalla aminosyrorna genom att i dragskåp doppa ned plattan i ninhydrinlösning. Använd handskar och pincetter när du lyfter plattan i och ur ninhydrinlösningen. 10. Torka plattan i värmeskåpet vid 100 º C. Ta ut plattorna efter 10 min och granska dem. Uppgifter 1. Gör en tabell med rubriken Tabell 2. Aminosyror i surkålsspadet enl. modellen på s. 106. 2. Identifiera några aminosyror i surkålsspadet med hjälp av referenslösningarna. För in syrornas namn i tabell 2. 3. Jämför aminosyrorna i ditt kromatogram med de aminosyror som registrerats i HPLC kromatogrammet i figuren nedan. Liber AB. Denna sida får kopieras. 107
Ett jonbytarkromatogram av surkålsspad som visar förekomsten av ett flertal aminosyror. Kromatogrammet har erhållits med HPCL-teknik. Talen vid topparna anger tiden i minuter från försökets start. (Se vidare i Gymnasiekemi B s. 192.) Tilläggsuppgifter Under kromatograferingen har ju de olika ämnena vandrat olika långt på kromatografiplattan. Varje ämne karakteriseras av sitt s.k. R f -värde. Det definieras på följande sätt (se figur): den sträcka ämne Avandrat a Rf ( A) = = den sträcka vätskefronten vandrat b 1. Mät vandringssträckan dels för vätskefronten (sträckan b i figuren), dels för var och en av referenserna i punkterna 1, 2, 4, 5, 7 och 8 (sträckan a i figuren). Anteckna värdena i tabell 1. Beräkna R f -värdena och för in dem i tabellen. 2. Mät hur långt några av aminosyrorna i surkålsspadet har vandrat. För in värdena i tabell 2. Beräkna R f -värdena och för in dem i tabell 2. Jämför aminosyrornas R f -värden med R f -värdena för referenserna i tabell 1. b a Vätskefront Baslinje Tabell 1. Aminosyror i referenslösningarna. Vätskefrontens vandring: b = cm Fläck Aminosyrans namn och formel a/cm R f 1 osv 8 Liber AB. Denna sida får kopieras. 108
Tabell 2. Aminosyror i surkålsspadet Vätskefrontens vandring: b = cm Fläck a/cm R f Aminosyrans namn I osv V Elueringsvätskan hälls i särskilt kärl. Läraren ger anvisningar om hur ninhydrinlösningen ska hanteras. Experiment B. Bestämning av surkålsspadets ph m.m. Medan aminosyrorna vandrar på kromatografiplattan kan du göra följande undersökningar på spadet från surkålen och på lösningarna av albumin, alanin och tyrosin: 1. Bestämning av ph 2. Fehlings prov 3. Biuretprovet 4. Xantoproteinprovet Teori Med Fehlings prov kan man undersöka om spadet innehåller någon reducerande sockerart. Till ett prov av spadet sätts lösningar av kopparsulfat och natriumhydroxid. Därefter värms blandningen. Biuretprovet visar om det finns ämnen som innehåller två eller fler peptidbindningar. Också i detta fall sätter man lösningar av kopparsulfat och natriumhydroxid till provet men blandningen värms inte. Xantoproteinprovet visar om spadet innehåller aminosyror med aromatisk ring. Vid denna undersökning sätter man salpetersyra till provlösningen och värmer blandningen. Utrustning Bägare 400 cm 3, provrör, dropprör, värmeplatta eller brännare, trefot och nät, ph-meter med tillbehör. Kemikalier Surkålsspad, albuminlösning (masshalt 2 %), alaninlösning (5 mg/cm 3 ), tyrosinlösning (5 mg/cm 3 ), HNO 3 5 mol/dm 3, Fehling I och Fehling II, buffertlösningar för kalibrering av ph-metern. Liber AB. Denna sida får kopieras. 109
Utförande Gör i ordning en tabell med rubriken Tabell 3. Resultat av olika på prov på surkålsspad, albumin, alanin och tyrosin (se modellen nedan). 1. Bestämning av ph Kalibrera ph-metern. Mät ph på ett prov av surkålsspadet. För in ph-värdet i tabell 3. 2. Fehlings prov Till detta prov (och till xantoproteinprovet) ska du använda ett varmt vattenbad, t.ex. en bägare med kokande vatten. Häll ca 2 cm 3 av surkålsspadet i ett provrör. Tillsätt 3 droppar Fehling I och minst 3 droppar Fehling II (provet måste bli basiskt). Värm provet några minuter i vattenbadet. Notera ev. förändringar och för in resultatet i tabell 3. 3. Biuretprovet Du ska göra detta prov dels på surkålsspadet, dels på referenslösningar som innehåller albumin, alanin resp. tyrosin. Häll 2 cm 3 av de fyra lösningarna i var sitt provrör. Sätt 3 droppar Fehling I 1 och 3 droppar Fehling II 2 till varje provlösning. Notera ev. färgändringar efter ett par minnuter. För in resultatet i tabell 3. 4. Xantoproteinprovet Detta prov ska liksom biuretprovet utföras på såväl surkålsspadet som referenslösningarna. Sätt 2 cm 3 salpetersyra (3 mol/dm 3 ) till varje provlösning. Värm provrören några minuter i vattenbadet. Notera ev. färgförändringar. För in resultatet i tabell 3. Tabell 3. Resultat av olika prov på surkålsspad, albumin, alanin och tyrosin ph Fehlings prov Biuretprov Xantoproteinprov Surkålsspad Albumin ---- ------- Alanin ---- ------- Tyrosin ---- ------- 1 Fehling I innehåller CuSO 4 och 2 Fehling II innehåller NaOH, dvs. de reagens som används vid biuretprovet Liber AB. Denna sida får kopieras. 110
Innehållet i provrören kan hällas ut i vasken tillsammans med mycket vatten efter avslutade försök. Uppgifter och frågor 1. I punkterna 2, 3 och 4 ovan har du utfört Fehlings prov, biuretprovet resp. xantoproteinprovet. Ta reda på vilka reaktioner som sker i de olika proven. 2. Skriv en kortfattad redogörelse där du anger vilka slutsatser du kan dra om vad som sker vid fermentering av vitkål med Lactobacillus. Vad bildas av proteinerna resp. av polysackariderna i vitkålen? 3. Ta reda på varför många anser att fermenterade grönsaker/matvaror är särskilt nyttiga. Riskbedömning Måttligt riskfylld laboration. Ninhydrinlösningen hanteras i dragskåp eller i dragbänk. Ninhydrin irriterar huden och färgar den violett. Använd handskar och pincetter då ninhydrinlösning används. Ninhydrinspray får ej användas. Fehlings lösning II är basisk. Salpetersyra är sur. Båda är frätande. Skölj genast med kallt vatten om du fått lösning på hud eller kläder. Vid spill eller stänk torka upp och/eller skölj med vatten. Elueringslösningen hälls i särskilt kärl för ev. återanvändning. Liber AB. Denna sida får kopieras. 111