LABORATIONS-KOMPENDIUM

KAROLINSKA INSTITUTET VERSION 110910 Institutionen för medicinsk biokemi och biofysik Tandläkarprogrammet, Termin 1 LABORATIONS-KOMPENDIUM Säkerhet på kurslab Pipetteringsövning Laboration Syrabas Laboration Salivamylas Uppgifter för torrlaboration, hemolys, osmos, tonicitet

ALLMÄNT Vid laborationsföreläsningen belyses huvuddragen av den aktuella laborationens teori samt dess praktiska utförande. Det är viktigt att ni läst igenom det aktuella avsnittet i laborationskompendiet innan laborationsföreläsningen, det sparar tid både åt läraren och åt er själva. Laborationsresultatet redovisas genom att gruppen diskuterar en ifylld resultatredovisning med erforderliga kurvor (ritade på mm-papper), tabeller och kommentarer, med sin handledare vid slutet av laborationen. Redovisningen skall alltså ske i samband med laborationstillfället. Vid ritning av diagram på mm-papper gäller: a) ange ordentligt vad axlarna representerar, med enhet b) skalindelningen bör väljas så att avläsning kan göras entydigt och utan svårighet. Se även illustration på insidan av omslaget till mm-pappersblocket. c) om skalindelningen är 0,01 0,02 0,03 osv. ml kan man vid axeln ange enheten ml x 10 2 och använda graderingen 1-2 - 3 osv. Observera exponentens tecken: om indelningen är 1000-2000 - 3000 osv anges enheten som ml x 10-3 och graderingen blir 1-2 - 3 osv. Var aktsam med apparatur. Vågarna är dyrbara precisionsinstrument. Fråga lärare om handhavandet. ph-elektroder är sköra samt dyra. SÄKERHET PÅ KURSLAB PÅ LABORATORIET Vid allt laborativt arbete ska arbetsrock användas. All förtäring (mat eller dryck), matlagning, rökning, snusning, tuggummituggning etc är förbjuden på laboratoriet. Man får heller inte förvara mat (och dylikt) öppet i laboratoriet. Innan du lämnar laboratoriet för att äta eller fika, eller jobba vid kursdatorerna, skall du på grund av kontamineringsrisken ALLTID ta av arbetsrocken och tvätta händerna. Av säkerhetsskäl är det förbjudet för obehöriga, t.ex. barn, att vistas i laboratorierna. Det är också förbjudet att ta med sig hundar eller andra husdjur in på lab. ATT ARBETA MED KEMIKALIER Tänk på att det alltid finns risk för att spill eller kemikalier kan ha lämnats kvar på bänkar eller i dragskåp. Därför krävs stor aktsamhet på lab. För att minska risken, ta för vana att alltid torka upp när du spillt på bänken eller i dragskåpet. Under laborationerna kommer du i kontakt med SYROR och BASER. Den verkliga faran med dessa ämnen är om de kommer i ögat. Använd därför SKYDDSGLASÖGON. Vid hudkontakt 2

uppstår irritation/sveda/frätskador, och droppar på kläderna förstör dessa. Huden läker, och kläder kan ersättas, men ögonskada kan bli livslång! Andra kemikalier är brandfarliga eller explosiva. Dessutom kan kemikalier ge problem genom att förorena glasvaror, bänkar etc. så att senare analyser försvåras. Diskmedelsrester kan hämma enzymer. Det är därför viktigt att diska och skölja noga, avsluta med att skölja i destillerat vatten. På kursdatorerna (plan 2, Scheelelab) finns ett datoriserat uppslagsverk om kemikaliers egenskaper och dess risker. För att inte utsätta andra för okända kemikalier, torka alltid av labbänkarna samt dragskåp efter avslutad lab! Dragskåpen har två effektlägen, ett för grundventilation ("avstängt") som är tillräckligt för förvaring, och ett läge för full effekt som används vid arbete med farliga ämnen. Ju lägre dragskåpsluckan placeras, desto effektivare funktion. För fullgott skydd tillåts en lucköppning på max 28 cm:s höjd (se markering SAFETY LEVEL på dragskåpet). Om starka syror och alkali kommer på huden eller kläderna bör man skölja ordentligt med vatten, eventuellt med dusch. Kemikaliestänk i ögonen behandlas omedelbart med vattenspolning minst 15 min - med öppna ögonlock (vid lutstänk är det speciellt viktigt att skölja noga och länge). Om du använder kontaktlinser måste dessa tas ut före sköljning - låt därför alla i din grupp veta om du har kontaktlinser. Ögondusch finns vid räddningsstationerna i anslutning till varje kurslab. Använd skyddsglasögon i förebyggande syfte. På räddningsstationerna finns också brandfiltar. Dessa skall användas för att kväva eld, t.ex. i kläderna på en kamrat. Dessutom finns ett flertal eldsläckare och larm. Lär dig var denna skyddsutrustning finns och hur den används! Fråga amanuens om du är osäker. Pipettering görs med "PI-pump eller "Peleusboll", vilka ingår i labutrustningen. Vid vissa laborationer utlämnas automatpipetter. Farligare reagens portioneras vanligen direkt till proven med hjälp av speciell doseringsanordning som sitter på förrådsflaskan. Om du är osäker i säkerhetsfrågor så diskutera dessa med lärare på lab eller lab-ansvarig. Viss litteratur i ämnet finns på amanuenslab. ARBETA RENT - FÖLJ ANVISNINGAR - ANVÄND DITT OMDÖME Om någon olycka eller tillbud inträffar, t.ex. brand, syror eller alkali på hud och kläder, gifter i munnen: TILLKALLA OMEDELBART AMANUENS! 3

PIPETTERINGSÖVNING EN ÖVNING SOM NI ALLA SKA GÖRA Erfarenheten av att använda automatpipetter är väldigt varierande. Men eftersom det är tråkigt när en lab går fel p.g.a. onödiga missar i pipetteringen, så kommer här en grundlig pipetteringsövning som utgår från i stort sett att du inte har någon erfarenhet alls. Automatpipetter är noggranna precisionsinstrument om man använder dem rätt..! Men de är dyra (ca 2000:-), så hantera dem försiktigt, de är känsliga för stötar, felinställningar mm. Ta en pipett med blå topp, vilket mätintervall har den? (Ta för vana att alltid kolla mätintervallen innan du använder en pipett!) Känn på pipettens (pistongens) två lägen. ("First stop", "second stop" se bild i bruksanvisn.) Sätt på en passande spets med filter och ställ in på 300 µl. Tryck ner till first stop, doppa ner spetsen i vattnet och släpp försiktigt upp pistongen, markera nivån med en spritpenna, tryck sen ut på en vågbytta. Vikt? Upprepa men tryck ner till second stop. Volym? Vikt? Vilket stop är det rätta? När du trycker ut en lösning, vilket stop trycker du då till för att få ut allt? Ställ in pipetten på 200 µl och doppa ner i lösningen (vattnet ), och tryck ner pistongen till first stop, släpp upp pistongen vad händer? Väg vattnet: Upprepa men släpp försiktigt upp pistongen. Skillnad? Vikt? Vilket sätt ger bäst resultat (mest överensstämmande med pipettinställningen)? Väg nu tre pipetteringar med samma inställning. Skriv ner inställd volym och viktresultaten och fundera på om de är tillräckligt lika. Volym: Vikt 1: Vikt 2: Vikt 3: Kommentar: 4

Ta en pipett med grå topp, vilket mätintervall har den? Vid så här små volymer är det extra viktigt att göra rätt, annars blir det lätt dubbelt så mycket, eller inget. Sätt på rätt storlek av engångsspets. Ställ in 2 µl, doppa ner i rött vatten och sug upp, torka av spetsen mot bägarens kant, håll sen pipettspetsen 5 cm över vågbyttan som du ska pipettera till och tryck ut Var hamnar droppen? Alternativt tillvägagångssätt för att få ner den röda droppen i vågbyttan? Du ska pipettera 180 µl, vilken pipett använder du då? (Ange färg på toppen och mätintervall.) 5

Laboration Syrabas, Buffertar Utförande: Acetatbuffertar med totalkoncentrationen 0,1 M men med olika ph ska tillverkas från lösningar av 0,1 M HAc (ättiksyra) och 0,1 M NaAc (natriumacetat), dvs. svag syra (HAc) och korresponderande svaga bas (Ac - ). Buffertarna, vars totala volymer ska vara 50 ml, blandas i plastbägare. Sju olika acetatbuffertar med ph 3,2, ph 3,7, ph 4,2, ph 4,7, ph 5,2, ph 5,7 och ph 6,2 framställes (jämför resultatredovisningen). Buffertformeln: ph = pk a + log (c b /c a ) används vid beräkningen. Vi vet det önskade ph-värdet för varje buffert samt att pka-värdet är 4,75 för ättiksyra. Beräkna hur stora volymer av den svaga syran (HAc) och den svaga basen (Ac - ) som ska blandas. Beräkningen göres som ett ekvationssystem, där buffertformeln utgör den ena ekvationen, och den andra är c a + c b = 0,1. Först beräknas alltså koncentrationerna av korresponderande syra samt bas, i den buffert som ska blandas. Därefter beräknas hur många mol som behövs för att tillverka 50 ml av bufferten, och slutligen vilka volymer av 0,1 M HAc och 0,1 M NaAc som ska blandas. Avrunda till hela ml och för in värdena i tabellen i resultatredovisningshäftet. När de sex buffertarna är framställda görs följande försök. Mätvärden samt observationer införs i resultatredovisningen. 1) Tag 10 ml av varje buffert och bestäm ph med ph-meter 2) Till 10 ml av varje buffert sätts 1 ml 0,1 M HCl och ph bestäms med ph-meter 3) Till 10 ml av varje buffert sätts 1 ml 0,1 M NaOH och ph bestäms med ph-meter 4) Till 10 ml av varje buffert sätts 4 droppar av en indikator (bromkresolgrön). Anteckna provernas färg. Angående ph-metern: Kalibrera ph-metern med standardbuffert ph 7,0. Efter kalibrering förvaras glaselektroden nedsänkt i dest. vatten mellan mätningarna. Kontrollera att glaselektrodens membran ej torkat före laborationen (och var observant härpå även under och efter laborationen). 6

Laboration Syrabas, Titrering av känd aminosyra (serin) Varje laborationsgrupp får ut två aminosyra-prover som ska karaktäriseras med hjälp av titrering. 1 st känd aminosyra (serin) och 1 st okänd (se nästa sida). Proverna är märkta med lab.gruppens nummer. Titreringen följs samtidigt på två sätt, med ph-meter och med en indikatorlösning. Notera särskilt i vilka ph-intervall buffring erhålles, och tänk efter vad detta beror på. En molekyl med flera protolyserbara grupper (som aminosyror) kan avge flera protoner och uppvisar därför flera buffrande intervall samt flera ekvivalenspunkter, en för varje proton. Vid ekvivalenspunkten har lika många mol bas tillsatts som antalet mol protolyserbar grupp på molekylen. Koncentrationen för aminosyran kan beräknas genom att använda de kända volymerna och den tillsatta basens (lutens) koncentration. Kemikalier: Serin-lösning, 0,1 M NaOH-lösning, 0,5 M Utförande: Sätt upp byrett och gör i ordning för titrering. Fyll byretten med drygt 10 ml NaOH (upp till 0- strecket). Häll upp 10 ml serin-lösning i en plastbägare (engångsmugg). Två droppar universalindikator tillsättes. NaOH tillsätts från byretten under försiktig omrörning. OBS! Rör inte om med ph-elektroden. Den är mycket ömtålig. Efter varje tillsats avläses ph och tillsatt volym NaOH (iakttag att natriumhydroxiden ej droppar på eller i omedelbar närhet av glaselektroden). Notera även när färgomslag sker. Initialt tillsättes 0,2 ml NaOH mellan varje gång ni mäter ph. Gör allt mindre tillsatser av NaOH nära omslagspunkterna. Alltså, tillsatserna ska minska när ph-förändringarna tenderar att öka. Titreringen avslutas när ph är cirka 12. Se till att ni får jämvikt i er bägare innan ni mäter ph. Aminosyran serin kan avge två protoner, och kurvan skall uppvisa två buffrande intervall samt två ekvivalenspunkter, en för varje protolyserbar grupp. Redovisning: Plotta resultaten på millimeter-papper, med ph på x-axeln och ml tillsatt NaOH på y-axeln. Läs av pka-värdena för aminosyrans protolyserbara grupper. Identifiera de olika omslagspunkterna i titrerkurvan. I vilka ph-intervall buffrar serin? Jämför med teoretiska värden, t ex i Rådmark & Wetterholm: Appendix-Syrakonstanter. Beräkna koncentrationen av aminosyran, utifrån ekvivalenspunkterna. Stämmer beräkningen med angiven koncentration (0,1 M)? 7

Laboration Syrabas, Titrering av okänd aminosyra Kemikalier: Prov med okänd aminosyra (0,1 M) NaOH-lösning, 0,5 M Utförande: Som för titreringen av serin. Sätt även här till NaOH, initialt i portioner om 0,2 ml, mät ph. Två droppar universalindikator tillsätts. Räkna med att ni bör tillsätta cirka 1,5 ggr så mycket NaOH här, som i titreringen av serin. Titreringen avslutas när ph är cirka 12 Redovisning: Plotta resultaten på ett millimeterpapper som i försök 2. Använd de pka-värden ni erhåller för att bestämma vilken aminosyra det är i er lösning. Använd t ex tabellen i Rådmark & Wetterholm: Appendix-Syrakonstanter. Kommentera gärna resultaten (kort). Erhöll ni förväntade resultat? 8

Resultatredovisning, buffertar I) Tabell enligt nedan Buffert Volym 0,1M Volym 0,1M Beräknat Avläst ph Färg nr HAc (ml) NaAc (ml) ph (1) (2) (3) (4) 1 3,2 2 3,7 3 4,2 4 4,7 5 5,2 6 5,7 7 6,2 (1) uppmätt ph (2) ph efter tillsatt 0,1 M HCl (3) ph efter tillsatt 0,1 M NaOH (4) färg efter tillsatt bromkresolgrön II) Rita ett diagram på mm-papper där buffertarnas ph (avläst ph enligt försök (1) ovan) avsätts på abscissan (x-axeln) medan ΔpH (enligt nedan) avsätts på ordinatan (y-axeln). Två kurvor inritas: Kurva A: ΔpH=(1)-(2), ph-förändringarna vid tillsats av 0,1 M HCl. Kurva B: ΔpH=(3)-(1), ph-förändringarna vid tillsats av 0,1 M NaOH. Var är buffertkapaciteten störst? Varför? Kommentera direkt i diagrammet! Laborationsredogörelsen består alltså av denna sida ifylld, till vilken ett diagram med två kurvor bifogas. 9

Resultatredovisning, titrering av känd aminosyra (serin) Titrering av aminosyran serin Resultatet presenteras i en tabell (på separat papper) med följande utseende: Potentiometrisk titrering av serinlösning med 0,5 M NaOH Grupp nr... Tillsatt 0,5 M NaOH (ml) ph Indikatorfärg 0,0 ml Åskådliggör sambandet mellan luttillsats och ph i ett diagram med ph som abscissa (x-axel) och volym lut som ordinata (y-axel). I diagrammet noteras färgomslag, och buffrande intervall samt ekvivalenspunkter utmärkes. Beräkna aminosyrans koncentration med utgångspunkt från funna ekvivalenspunkter. Titrering av okänd aminosyra Resultatet redovisas i en tabell (på separat papper) med följande utseende: Potentiometrisk titrering av 10,0 ml svag syra med 0,5 M NaOH Grupp nr... Tillsatt 0,5 M NaOH (ml) ph Indikatorfärg 0,0 ml Vidare ritas ett diagram med ph som abscissa och ml NaOH som ordinata. I diagrammet utsätts experimentellt erhållna ekvivalenspunkt(er) och pk a -värden. Indikatorlösningens färgomslag noteras även i diagrammet. Med ledning av erhållna pk a -värden, vilken aminosyra har titrerats? Stämmer koncentrationen (0,1 M) med ekvivalenspunkterna? Hela laborationsredogörelsen innehåller alltså 2 tabeller och 2 kurvor i 2 diagram. Dessutom anges syraprovens koncentrationer. OBS, redovisa dessa uträkningar i anslutning till respektive diagram. 10

Laboration SALIVAMYLAS Introduktion Salivamylas är ett enzym i saliven som katalyserar nedbrytningen av vissa polysackarider till kortare kolhydrater (maltos, maltotrios och dextriner). Enzymets fysiologiska substrat, stärkelse, består av långa glukoskedjor av två typer, amylos (ogrenad, ungefär 25 %) och amylopektin (grenad, ungefär 75 %). Båda är polymerer av glukos, där glukosenheterna är kopplade till varandra med α-1,4-bindningar. Men ungefär var 30:e glukosenhet i amylopektin är även kopplad till ytterligare en glukoskedja via en α-1,6-bindning. Detta medför att amylopektin i motsats till amylos blir grenad (jämför bilden nedan). Stärkelse, som finns i vegetabilisk föda, men även glykogen (den animaliska motsvarigheten till stärkelse) fungerar som substrat. Glykogen liknar amylopektin, men är ännu mera förgrenad med ett greningsställe vid var femte till tionde glukosenhet. α-1,6-glykosidisk bindning Schematisk presentation av amylos och amylopektin, de två beståndsdelarna i stärkelse. Amylos består av ogrenade glukoskedjor med α- 1,4-glykosidiska bindningar, medan amylopektin (och glykogen, den animaliska motsvarigheten till stärkelse) innehåller förgreningar via α-1,6- glykosidiska bindningar. Förgrening i amylopektin/glykogen i detalj. Två glukosenheter i huvudkedjan är kopplade med α- 1,4-glykosidiska bindningar. En α-1,6-glykosidisk bindning medför förgreningen. (från: Berg, J.M.: Biochemistry. Tymoczko, J.L.; Stryer, L.; 6. ed.: New York, N.Y.: Freeman) De α-1,4-glykosidiska bindningarna medför att stärkelsemolekylerna blir spiralvridna: De α-1,4-glykosidiska bindningarna i amylos och amylopektin favoriserar en helikal struktur och gör att stärkelsemolekylerna blir spiralvridna. (från: Berg, J.M.: Biochemistry. Tymoczko, J.L.; Stryer, L.; 6. ed.: New York, N.Y.: Freeman) 11

Mätning av salivamylasets aktivitet - Teori Salivamylasets aktivitet kan följas experimentellt på olika sätt. Ni kommer att använda följande två metoder: 1) Jodprovet (jodjodkalium-lösning) Jodjodkalium-lösning (I 2 /KI) är en blandning av jod och kaliumjodid som lätt bildar polyjodidjoner: 2 I 2 + I - I 3 - + I2 I 5 - Bildning av polyjodidjoner i I 2 /KI-lösning Polyjodidjoner kan lagras in i stärkelsens helikala struktur (se introduktion). Jodjodkaliumlösning (I 2 /KI) och stärkelse ger då upphov till en blå färg, medan dess nedbrytningsprodukter tillsammans med jod ger en gul färg. Om enzym och stärkelse blandas så kommer provet färgas blått så länge tillräckligt med stärkelse finns kvar. När mängden stärkelse sjunkit under en kritisk nivå kommer den blåa färgen att försvinna och en brunaktig skiftning uppstå (akromatiska punkten). Får reaktionen fortsätta ytterligare någon tid kommer lösningen att få en gul färg. Jodfärgning kan antingen mätas efter en viss bestämd tid eller också som här: man mäter tiden tills stärkelsen brutits ner och ingen blå färg med jod längre erhålls. 2) DNS-metoden Denna metod bygger på reducerande sockerarters förmåga att reducera 3,5-dinitrosalicylat (gult) till 3-amino-5-nitrosalicylat (rött). Reducerande sockerarter är sackarider som i lösning kan bära en fri aldehydgrupp. Slutprodukten av amylasets nedbrytning är bl.a. maltos, maltotrios och dextriner. De är alla reducerande socker, eftersom de har en glukosenhet med fri hydroxylgrupp på kolatom 1 (C-1-hydroxylgrupp), vilket medför att ringstrukturen ligger i jämvikt med den öppna strukturen med aldehydgrupp (jämför exempel nedan). Ju mera fortskriden nedbrytningen av amylos i provet är, desto fler reducerande socker kan påvisas. Maltos består av två glukosenheter som är kopplade med varandra via en α-1,4-glykosidisk bindning. Bara ringstrukturen till höger med den fria C-1-hydroxylgruppen kan öppnas (se nedan). (från: Berg, J.M.: Biochemistry. Tymoczko, J.L.; Stryer, L.; 6. ed.: New York, N.Y.: Freeman) 12

H 1 Reducerande socker. Glukosens ringstruktur (och 1 allmänt glukosenheter med en fri C-1-hydroxylgrupp) kan 5 5 i lösning omvandlas till en öppen struktur med aldehydgrupp. Aldehydgruppen är en reducerande grupp, d.v.s. den oxideras lätt. Enzymet amylas får först bryta ned stärkelse till enklare reducerande sockerarter, bl.a. maltos och maltotrios: Stärkelse Amylas reducerande socker Efter en bestämd tid, 10 min, avbryts reaktionen genom tillsats av 3,5-dinitrosalicylat (DNS) och blandningen kokas. Detta leder till att enzymet denatureras samt att de reducerande sockerarterna reducerar DNS: 3,5-Dinitrosalicylat (DNS) gul färg 3-amino-5-nitrosalicylat röd färg Den uppkomna röda färgen mäts spektrofotometriskt. Absorbansen är ett mått på halten reducerande socker i provet och därmed på enzymaktiviteten. Fysikalisk-kemiska faktorer som påverkar amylasets aktivitet 1. Temperatur bör hållas fysiologisk ( 37 C). Låter man enzymet verka vid 10 C lägre temperatur nedsätts reaktionshastigheten till ungefär hälften, medan den ökas till ungefär det dubbla vid 10 C högre temperatur. 2. ph 3. Jonhalten. Väsentligt för reaktionen är att Cl - finns närvarande. Cl - binder till enzymet och orsakar en konformationsförändring som ökar enzymets aktivitet. Dessutom har enzymet Ca 2+ bundet, och är beroende av detta för aktivitet. 4. Enzymhämmare. Vissa ämnen och joner har en stark hämmande effekt på enzymet, till exempel F - och komplexbildaren EDTA (binder tvåvärda katjoner). 13

Rening av amylas ur humansaliv Avsikten med laborationen är framförallt att studera salivamylasets jonberoende. Då det i saliven finns kloridjoner måste en saltfri preparation av enzymet framställas. Detta görs genom "avsaltning" med gelfiltrering. Efter gelfiltreringen kontrolleras enzyminnehåll med jodprovet, dvs. genom att jodjodkaliumlösning sättes till ett prov från varje fraktion efter inkubering med stärkelse. Kloridjoner påvisas med AgNO 3 som bildar svårlöslig vitaktig fällning av AgCl. Den fraktion som innehåller amylasaktivitet (men ej kloridjoner) används vidare i jonförsöket. Cl - + Ag + + NO 3 - AgCl + NO 3 - Påvisning av klorid. Kloridjoner fälls ut med hjälp av silvernitratlösning. Vid jonförsöket får enzymet bryta ned stärkelse i närvaro av olika anjoner (F - och Cl - ) samt en komplexbildare (EDTA som binder tvåvärda katjoner), varvid man undersöker hur lång tid man kan påvisa stärkelse i lösningen. Reaktionen utföres vid ph 7,0 och 40 C. Gelfiltrering är en ofta använd metod för enzymrening. Vanligen används Sephadex, som sväller i vatten och bildar en gel bestående av ett nätverk av korsbundna dextranmolekyler. I denna laboration används en färdigpackad Sephadex-kolonn, s.k. PD-10 kolonn. Vid kromatografin kommer de större proteinmolekylerna att vandra mellan gelkornen och snabbt passera genom kolonnen. Lågmolekylära föreningar såsom oorganiska salter tränger in i det finaste nätverket och retentionstiden blir därför längre, d.v.s. salter kommer ut ur kolonnen efter proteiner. Denna typ av filtrering separerar främst proteiner från salter men en viss separation mellan större och mindre proteiner är möjlig. Exempel på rening av albumin från NaCl i en PD-10 kolonn from: PD-10 desalting column, Instructions for use (GE Healthcare) 14

Utförande Fyll vattenbaden och ställ in temperaturen på 40 C. Varje grupp lägger i varsin porslinsplatta. Rening av enzym med gelfiltrering: Varje grupp producerar tillsammans 3-4 ml saliv. Överför saliven till centrifugrör och centrifugera 10 min på näst högsta hastigheten. OBS! Vid centrifugeringen måste motviktsrör användas. Under centrifugeringen bildas 3 skikt i centrifugröret: Sediment i botten, ett skummigt ytskikt och ett klart mellanskikt. Ur mellanskiktet sugs 1 ml som överförs till ett nytt rör. Späd salivprovet genom att tillsätta 4 ml NaAc-buffert. Rör om med en pipett. Märk upp tre rena rör 1, 2, 3. Tappa ur vätskan ur PD-10-pelaren genom att ta bort lock och propp. 2,5 ml av salivprovet sätts på pelaren. Låt provet rinna in i pelaren och samla upp eluatet i rör 1. När salivprovets yta sjunkit till pelarytan sättes 2,5 ml NaAc-buffert på pelaren. Använd en ren pipett! Låt bufferten rinna in och samla upp eluatet i rör 2. Sätt därefter på ytterligare 2,5 ml NaAc-buffert och samla upp eluatet i rör 3. Efter sista elueringen: fyll PD-10-kolonnen med NaAc-buffert och sätt på lock och propp för att förhindra att matrixen torkar ut. Bestämning av amylas- och klorid-innehåll i fraktionerna: Dela gärna upp er inom gruppen så att några gör amylasbestämning och några kloridbestämning av fraktionerna. Eftersom vi har renat bort Cl - från amylaset och enzymet är beroende av jonen för en bra aktivitet så tillsätter vi nu Cl - till stärkelsen. Därigenom kan vi kontrollera amylasets tillgång till kloriden, och styra vårt försök vad gäller amylasets jonberoende. Blanda därför 15 ml stärkelselösning med 162 mg NaCl (185 mm). Denna lösning ska användas både vid test av amylasinnehåll, förtestet samt jonförsöket. Amylasinnehåll Testa jod och stärkelse genom att blanda en droppe av stärkelse/nacl-lösningen med en droppe jodjodkalium-lösning på en porslinsplatta. Vilken färg? Blanda sedan 2 droppar från varje fraktion från gelfiltreringen (rör 1,2 och 3), med 1 droppe stärkelse/nacl-lösning på en varm och torr porslinsplatta. (Viktigt är att plattan håller 40 o C under hela de 10 minutrarna som reaktionen ska få fortgå, så palla upp porslinsplattan försiktigt på provrörsställ i vattenbadet.) Låt stå i 10 minuter. 15

Tillsätt därefter 1 droppe jodjodkalium-lösning till varje prov. Anteckna var blå respektive ofärgat prov erhållits. Var har stärkelsen brutits ner? I vilka fraktioner finns amylas? Kloridinnehåll Tag 7 droppar av var fraktion från gelfiltreringen till 3 centrifugrör (konisk botten). Sätt till 2 droppar silvernitratlösning till varje rör. Anteckna i vilka fraktioner vit fällning erhållits. (Troligtvis kommer ni endast att se en blå/grå-aktig dimma ) som syns då man håller upp provet mot en lampa.) I vilka fraktioner finns det salt (kloridjoner)? Studium av salivamylasets jonberoende: Du har nu bestämt vilka fraktioner som innehåller enzym och vilka som innehåller salt. Den/de fraktioner som innehåller enzym men inte salt ska användas vidare. De andra kan slängas. Rådgör med amanuens om du är osäker! STÄLL FRAKTIONEN SOM NI SKA ARBETA VIDARE MED PÅ IS! Späd 1 ml av enzymfraktionen med 3 ml NaAc-buffert. Rör om och märk röret: spätt enzym 1+3. Denna spädning brukar oftast vara lämplig till försöket men enzymet kan behöva spädas mer. Detta avgörs vid förtestet. Förtest: Hur lång tid tar det för 0,5 ml enzym att bryta ned stärkelsen i röret? Förvärm 2,5 ml av stärkelselösningen innehållande NaCl minst 5 minuter i ett provrör i vattenbad (40 C). Förbered under tiden en porslinsplatta genom att sätta en droppe jodjodkalium-lösning i varje brunn. Tag en droppe av stärkelselösningen och sätt till första brunnen med jodjodkalium-lösning. Använd detta som en noll-referens. Tillsätt 0,5 ml av det spädda enzymet till de 2,5 ml stärkelselösning i vattenbadet (låt röret vara kvar i vattenbadet under tillsatsen) och blanda försiktigt. Anteckna tiden eller starta tiduret. 16

Vid tiderna 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 13, 16, 20 minuter tages en droppe av blandningen till porslinsplattan med jodjodkalium-lösning. Anteckna tiden till den akromatiska punkten uppnåtts (bestäm själv en viss brun färgnyans = akromatiska punkten). Om akromatiska punkten är passerad redan inom 5 min får ni späda enzymlösningen en gång till med NaAc-buffert 1+1 (mät med mätpipett) och göra om försöket. Jonförsök: När ni med ledning av förtestet fått fram en lämplig spädning på ert enzym: Gör i ordning fyra rör innehållande: o 2,5 ml stärkelselösning med NaCl (185 mm). (Färdigt sedan tidigare) o 2,5 ml stärkelselösning med NaCl (185 mm) + 1 mmol NaF (42 mg). Väg själv upp NaF o 2,5 ml stärkelselösning (innehållande NaCl) + 15 mm EDTA (finns färdigblandad) o Kontrollrör innehållande endast 2,5 ml stärkelselösning UTAN NaCl Förvärm alla rör i vattenbad (40 C) i 5 minuter. Förbered under tiden flera porslinsplattor med jodjodkalium-lösning, såsom i förtestet. Från vart och ett av de 4 rören tas 1 droppe till varsin droppe jodjodkalium-lösning på porslinsplattan. (Nollreferens) Alla inkubationer ska startas samtidigt eller med några sekunders intervall. För att snabbt kunna tillsätta rätt mängd enzym kan det vara bra att mäta upp 0,5 ml enzym i nya rör och starta reaktionen genom att tillsätta detta med en Pasteurpipett. Tillsätt därför enzym (0,5 ml av den spädning ni provat er fram till) till fyra rena rör som får stå på is. Starta tidtagningen så snart ni tillsatt enzym. Byt Pasteurpipett och tag prov från inkubationerna på samma sätt, och vid samma tider, som under förtestet (1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 min osv.). Detta kräver att alla hjälper till! Notera tiden för uppnående av akromatiska punkten. Avsluta provtagningen efter ca 20 minuter. (Rådgör med amanuens) Gick reaktionen snabbare eller långsammare efter tillsats av Cl -, F - och EDTA? 17

Enzymaktivitetens ph-beroende För denna uppgift får ni kommersiellt pankreatisk amylas (0,25 mg/ml lösning) och använder DNS-metoden (se teoridelen) för att bestämma enzymaktivitetens ph-beroende. Ni ska undersöka ph-området mellan ph 5 och 9. Lämpliga buffertar finns färdigberedda (40 mm fosfatbuffert, 13,4 mm NaCl med ph 5, 6, 7, 8 och 9). Förbered 10 rör (två st, blank och prov, för varje ph) Till varje rör sättes 0,3 ml av stärkelselösningen ( potatisstärkelse, koncentration: 20 mg/ml) och 0,7 ml H2O Tillsätt nu 1 ml buffert ph 5 till en blank och ett prov, sedan 1 ml buffert ph 6 till en blank och ett prov osv. Förvärm rören i vattenbad (40 o C) Tillsätt 0,1 ml H2O i blankrören och 0,1 ml enzym i provrören, med rören kvar i vattenbadet. (Tillsätt i jämna tidsintervall, t.ex. i 15 sekunder-takt och starta tidtagningen samtidigt som ni tillsätter första gången) Låt stå i vattenbadet (40ºC) i 10 min Avbryt reaktionen genom att tillsätta 200 µl 1,2 M NaOH-lösning (i samma jämna tidsintervall och ordning som ovan); använd skyddsglasögonen! Sätt 3 ml DNS-reagens till samtliga rör (använd framsatta flaskor med 3 ml-vogelpipetter) Värm rören 5 min i kokande vattenbad Tillsätt 10 ml dest. vatten. Blanda noga! Läs absorbansen i den kalla lösningen vid 540 nm inom 30 min efter avkylningen. Ifall absorbansen är högre än 0,8 spädes lösningen med dest. vatten, omskakas och mäts om. Resultatet redovisas i ett diagram där absorbansen vid 540 nm (proportionell mot reaktionshastigheten) sättes på y-axeln och ph på x-axeln. Var ligger amylasets ph-optimum? 18

Enzymaktivitetens beroende av substratkoncentration Också här får ni kommersiellt pankreatisk amylas och använder DNS-metoden (se teoridelen). Alla mätningar här görs vid ph 7. Förbered 14 olika rör (två st, blank och prov, för varje substratkoncentration) Pipettera efter pipetteringschemata nedan. Tillsätt enzymet allra sist och i jämna intervall, t.ex. 15 sekunder! OBS! Rören ska förvärmas ca 5 min i vattenbad (40 o C) innan enzym tillsätts. BLANK \ Rör nr 1 2 3 4 5 6 7 Buffert ph 7 (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Stärkelse (ml) 0 0,15 0,30 0,45 0,60 0,75 1,00 H2O 1,1 0,95 0,80 0,65 0,50 0,35 0,10 PROV \ Rör nr 1 2 3 4 5 6 7 Buffert ph 7 (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Stärkelse (ml) 0 0,15 0,30 0,45 0,60 0,75 1,00 H2O 1,0 0,85 0,70 0,55 0,40 0,25 0 Enzym (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Låt stå i vattenbadet (40ºC) i 10 min Avbryt reaktionen genom att tillsätta 200 µl 1,2 M NaOH-lösning (i samma jämna tidsintervall och ordning som när ni tillsatte enzymet); använd skyddsglasögonen! Sätt 3 ml DNS-reagens till samtliga rör (använd framsatta flaskor med 3 ml-vogelpipetter) Värm rören 5 min i kokande vattenbad Tillsätt 10 ml dest. vatten. Blanda noga! Läs absorbansen i den kalla lösningen vid 540 nm inom 30 min efter avkylningen. Om absorbansen är högre än 0,8 spädes lösningen med dest. vatten, omskakas och mäts på nytt. Resultatet redovisas i ett diagram där absorbansen vid 540 nm (proportionell mot reaktionshastigheten) sättes på y-axeln och volym tillsatt stärkelse på x-axeln. Beskriv hur amylasets aktivitet förändras med ökande substratkoncentration. 19

Resultatredovisning, Laboration 2 Efter gelfiltreringen kontrollerades vilka fraktioner som innehöll enzym resp. joner. I vilka fraktioner erhölls blå färg? I vilka fraktioner erhölls en vitaktig fällning? Vad består denna fällning av? Vilka fraktioner innehöll enzym? Vilken fraktion användes i vidare försök? Krävdes ytterligare spädning av enzymet? Diskutera vad detta kan bero på! Vad som menas med den akromatiska punkten? I jonförsöket uppmättes tiden för den akromatiska punkten, ange tiden för: Renade enzymet: min Renade enzymet + NaCl min Renade enzymet + NaCl + NaF min Renade enzymet + NaCl + EDTA min Vad innebär det att tiden för en akromatisk punkt är kort resp. lång? Hur påverkades amylasets aktivitet av Cl - och F -? Vad kan det bero på? Hur påverkade komplexbildaren EDTA amylasets aktivitet och vad kan det bero på? Jämför amylasets ph-optimum med fysiologiskt ph. Beskriv hur amylasets aktivitet (reaktionshastighet) ändras med ökande substratkoncentration. 20

Uppgifter för torrlaboration, hemolys, osmos, tonicitet Självstudium med lärartillgång Mål Att förstå hur hemolys uppkommer, osmos, osmotiskt tryck, och tonicitet. Beräkna osmotiskt tryck (Π). Hemolys, en laboration på papperet Somliga lösta ämnen i erytrocytens omgivning ger upphov till hemolys, men ej andra. De joner och molekyler (lösta ämnen) som ej kan diffundera genom erytrocytmembranet ger upphov till osmos, dessa är alltså osmotiskt aktiva lösta ämnen. Lösta ämnen som själva kan diffundera genom membranet är osmotiskt inaktiva. Graden av osmos mätes genom att bestämma hur stor andel av erytrocyter som hemolyserar (spricker). Övningen illustrerar också skillnaden mellan begreppen tonus (som beror av summakonc. lösta ämnen som är osmotiskt aktiva) och osmolaritet (summakonc. alla lösta ämnen). Tänkt utförande För att se hur röda blodkroppar mår i osmotiskt hänseende, då de vistas i koksaltlösningar med olika koncentrationer, tänker vi oss att blodprover (0,5 ml) blandas med 4,5 ml av olika lösningar, i provrör, enligt följande: A) 0,5 ml blod + 4,5 ml 154 mm NaCl B) 0,5 ml blod + 4,5 ml 120 mm NaCl C) 0,5 ml blod + 4,5 ml 100 mm NaCl D) 0,5 ml blod + 4,5 ml 80 mm NaCl E) 0,5 ml blod + 4,5 ml 70 mm NaCl F) 0,5 ml blod + 4,5 ml 60 mm NaCl G) 0,5 ml blod + 4,5 ml 40 mm NaCl H) 0,5 ml blod + 4,5 ml dest H2O 21

Provrören skakas omgående genom att slå med ett finger mot röret, varefter rören får stå i 5 min. Därefter centrifugeras provrören i bordscentrifug vid max.hastighet i 2 min. Härvid kommer hela (intakta) röda blodkroppar att sedimentera, hamnar alltså i pelletten, medan innehållet från trasiga röda blodkroppar (som hemolyserat) blir kvar i supernatanten. Graden av rödfärg (hemoglobin) i supernatanten blir alltså ett mått på hur stor andel av de röda blodkropparna som gått i hemolys. Graden av rödfärg i supernatanten mätes med en spektrofotometer (vid 420 nm, som är ett absorbans-maximum för hemoglobin). Mätning av de åtta supernatanterna ger följande: Abs 420 nm A) 154 mm NaCl 0,14 B) 120 mm NaCl 0,35 C) 100 mm NaCl 0,19 D) 80 mm NaCl 0,96 E) 70 mm NaCl 30,0 F) 60 mm NaCl 77,8 G) 40 mm NaCl 80,5 H) dest H2O 85,3 * Redovisa med diagram: % hemolys mot konc. osmotiskt aktiva partiklar. Hemolysgraden uttrycks i % av fullständig hemolys = absorbansen i det prov där blod blandats med dest. H2O. Resultatet kan jämföras med figur 1-8 i Berne & Levy, samt figur 6.9 i Klinisk Kemi, Laurell, 8:e upplagan (fig. 3.5 i 7:e upplagan). 22

* Klargör hur halterna av lösta ämnen är för isoton koksaltlösning, plasma, och ICV, genom att fylla i nedan (jämför tabeller 10-2 samt 10-3): Osmolaritet (osmol/l) Osmolalitet (osmol/kg H 2 O) Summaaktivitet (osmol/kg H 2 O) NaCl 0,9 % (w/v) plasma ICV för blodcell * Förklara mekanismer för hur hemolys uppkommer. * Vad är osmolaliteten utanför cellerna vid 50% hemolys? Under förutsättning att cellernas membran vore stelt och oelastiskt, vad skulle den osmotiska tryckskillnaden mellan cellernas insida och utsida vara vid 50% hemolys? Vid beräkningen, antag densitet 1 kg/l för saltlösningarna, samt antag att aktivitetsfaktorer för Na + samt Cl - i vattenlösningen utanför cellerna är 0,92. Intracellulär totalhalt av lösta (med hänsyn tagen till aktivitetsfaktorer) är 0,289 osmol/kg H 2 O, jfr tabell 10-2, ICV. I denna summa är nästan alla ämnen osmotiskt aktiva gentemot cellmembranet. Endast urea (0,004 osmol/kg H 2 O) är inte osmotiskt aktivt. * Röda blodkroppens form (diskus) samt elasticiteten hos dess cellmembran medger volymsökning, och i hypoton omgivning går vatten in i cellen. Beräkna utifrån hemolyskurvan, hur många ggr genomsnittscellen ökar sin volym innan den spricker? Bedöm även hemolysgraden av erytrocyter i följande lösningar. Abs 420 nm I) 0.5 ml blod blandas med 4,5 ml 0,154 M NaCl + 0,2 M urea 0,15 II) 0.5 ml blod blandas med 4,5 ml 0,31 M urea 83 * Förklara varför hemolys inträffar i den ena lösningen men ej i den andra. Vilka partiklar i lösningarna är osmotiskt aktiva? Vad har urean för inverkan? Vilka joner utgör de kvantitativt dominerande osmotiskt aktiva lösta ämnena intracellulärt? * Beräkna osmolaliteter för lösningarna I och II (antag densiteter 1 kg/l). Jämför med osmolalitet för röda blodkroppens intracellulära vätska (ICV). Är lösningarnas osmolalitet större/lika/ mindre än osmolalitet för ICV (är de hyper-/iso-/hypoosmolala)? Är lösningarna hyper-/iso- /hypotona? Förklara innebörden av begreppen isoosmolal resp. isoton lösning. 23

Extra arbetsuppgifter, osmos, tonicitet, hemolys Uppgifterna belyser olika koncentrationsangivelser (molalitet, osmolalitet). Vidare sambandet mellan fryspunkt och koncentration. Hur osmotiskt tryck uppkommer och hur det beräknas. Förstå vitsen med att använda aktivitetsbegreppet istället för vanlig konc-angivelse. Förstå tonicitetsbegreppet. 1. Följande uppgift ger Dig underlag för resonemang om: Hur molalitet beräknas. Vad osmolalitet är. Hur fryspunkt beräknas. Att en beräknad T stämmer bättre med verkligheten om aktiviteter användes istället för vanliga koncentrationsangivelser. Att mätning av T nyttjas på kliniken för bestämning av osmolalitet i plasma och urin. Hur osmotiskt tryck (tecknas stora pi, Π) beräknas. Att alla komponenter i en lösning ej automatiskt summeras vid beräkning av Π. Endast de som är osmotiskt aktiva gentemot det aktuella membranet. Att även beräkning av Π stämmer bättre med verklighetens uppmätta värden, då de baseras på aktiviteter. Observera att facit ingår i uppgiften. 1.1 Betrakta en lösning innehållande 0,154 M NaCl och 0.2 M urea. Antag att densiteten är 1 kg/l. Beräkna fryspunktsnedsättningen. Lösta ämnen (i en liter lösning) väger 9 + 12 g. H 2 O i en liter lösning väger 979 g. Molalitet (Na + ) : Molalitet (Cl - ) : Molalitet (urea) : 0,154 = 0,1573 mol per kg H 2 O 0,979 0,154 = 0,1573 mol per kg H 2 O 0,979 0,2 = 0,2043 mol per kg H 2 O 0,979 Osmolalitet = 0,1573 + 0,1573 + 0,2043 = 0,519 mol per kg H 2 O T = 1,86 x 0,519 = 0,965 C Nu mäter vi den faktiska fryspunktssänkningen. Den blev 0,912 C. 24

Hur stora är aktivitetsfaktorerna för de envärda jonerna om vi antar att f för den oladdade urean är 1? ((0,1573 x f x 2) + 0,2043) x 1,86 = 0,912 0,585 x f +0,380 = 0,912 f = 0,91 1.2. Vad blir det osmotiska trycket mellan denna lösning och en röd blodkropps innandöme? Använd molaliteter (osmol/kg H 2 O). Observera att urean exkluderas från beräkningen då den kan passera cellmembranet och alltså ej är osmotiskt aktiv. Temperatur 37 C. mellan lösningen och rent H 2 O : = (0,157 + 0,157) x 8,31 x 10 3 x 310 = 809 x 10 3 Pa mellan ICV och rent H 2 O kan beräknas då osmolalitet för ICV är 0,34 osmol/kg H 2 O. Utav denna osmolalitet utgörs dock 4 mosmol/kg H 2 O av urea, som ju är diffusibel och ej bidrager till osmotiskt tryck över ett cellmembran. mellan ICV och rent H 2 O blir alltså : (0,34-0,004) x R x T = 866 kpa mellan lösningen och ICV blir : 866-809 = 57 kpa 1.3. Enligt denna beräkning skulle alltså osmos att inträffa, och cellerna borde svälla. Vi vet dock att detta ej är sant. Gör nu om beräkningen av mellan lösningen och rent H 2 O, med hänsyn tagen till aktivitetsfaktorer (f är 0.91 för envärda joner i denna lösning). mellan lösningen och rent H2O blir då : = ((0,91 x 0,157) + (0,91 x 0,157)) x 8,31 x 10 3 x 310 = 736 kpa mellan ICV och rent H 2 O med hänsyn tagen till f kan beräknas då tabell 10-2 även anger ICV osmolalitet efter korrektion för aktivitetsfaktorer : (0,289-0,004) x R x T = 734 kpa mellan lösningen och ICV blir enligt denna sista beräkning nära noll (2 kpa). Detta stämmer bättre med verkligheten, någon osmos har ju ej inträffat. 25

2. Utred huruvida följande lösningar är hyper-, iso-, eller hypo-osmolala jämfört med en röd blodkropps intracellulära vätska. Alltså om lösningarna innehåller samma summakoncentration av lösta ämnen som intracellulär vätska. Ange även om lösningarna är hyper-, iso-, eller hypotona. Alltså huruvida en röd blodkropp kommer att bibehålla sin volym, krympa, eller svälla. Detta beror på summakonc. osmotiskt aktiva ämnen i lösningen, jämfört med vad som finns i ICV. Jämför med summakonc. för ICV med hänsyn tagen till aktivitetsfaktorer (0,29 osmol/kg H 2 O, se tabeller 10-3, 10-2). Antag för enkelhetens skull att aktivitetsfaktorer för alla lösta ämnen i lösningarna nedan är 1. a) Sukros, 0,29 mol/kg H 2 O b) Koksalt, 0,29 mol/kg H 2 O c) Urea, 0,29 mol/kg H 2 O d) En blandning av en del a samt en del b (sukros 0,145 mol/kg H 2 O, Na + 0,145 mol/kg H 2 O, Cl - 0,145 mol/kg H 2 O) e) En blandning av en del a samt en del c. (sukros 0,145 mol/kg H 2 O, urea 0,145 mol/kg H 2 O) f) En blandning av en del b samt en del c. (Na + 0,145 mol/kg H 2 O, Cl - 0,145 mol/kg H 2 O, urea 0,145 mol/kg H 2 O) Facit. 2a. Iso-osmolal, isoton 2b. Hyperosmolal, hyperton 2c. Iso-osmolal, hypoton 2d. Hyperosmolal, hyperton 2e. Iso-osmolal, hypoton 2f. Hyperosmolal, isoton. 3. En beredning av lokalbedövningsmedlet Xylokain (för injektion) innehåller den aktiva substansen Lidokain hydroklorid (5 mg/ml) samt koksalt (8 mg/ml). Molekylvikten för Lidokain hydroklorid är 269, och detta löser sig i vatten till en positiv Lidokain-jon och en kloridjon. Densitet är 1 kg/l. Vad är lösningens osmolalitet? Vad blir summa-aktiviteten, om f för alla joner är 0,92? Varför har man tillsatt koksalt till injektionslösningen? Facit. En liter injektionslösning innehåller 18,5 mmol Lidokain hydroklorid samt 0,137 mol NaCl. Osmolariteten blir 0,312 osmol/l. Lösta ämnen väger 13 g/l, vattnet i en liter lösning väger 0,987 kg. Osmolalitet blir således 0,316 osmol/kg H 2 O. Summa-aktivitet är 0,92 x 0,316 = 0,29 osmol/kg H 2 O. Alltså samma som för kroppsvätskorna (jfr tabell 10-2, figur 10-12), injektionslösningen är isoton. Man har tillsatt NaCl i den mängd som gör lösningen isoton, för att injektionslösningen skall vara kompatibel med kroppsvätskorna i osmotiskt hänseende. 26