Institutionen för biokemi och biofysik LAB 12 Preparation och analys av plasmid-dna från E.coli Basåret 2012 (finns på basårshemsida: www.kemi.su.se, välj Basår)
INTRODUKTION I denna laboration ska vi utnyttja några viktiga metoder som är vanliga inom genteknik. De moment du ska utföra är: isolering av plasmid-dna (plasmid + gen), klyvning av plasmid-dna med restriktionsenzymer och analys med agarosgelelektrofores. E. coli bakterierna innehåller en plasmid pgem-3zf där vi satt in en gen. Plasmid pgem-3zf är en kommersiellt tillgänglig plasmid som har inhandlats från ett företag. Den används ofta för att klona gener i E coli. En sak som gör plasmiden så användbar är att den innehåller ett stort antal klyvningsställen för restriktionsenzymer. Restriktionsenzymer känner igen specifika DNA sekvenser och klyver (klipper) DNA strängarna. Man har därför möjlighet att klippa upp/klyva DNA och därefter sätta in en ny gen, innan man åter ligerar (klistrar ihop) DNA. I vårt fall har vi satt in genen för AOX i klyvningsstället för EcoRI. Det innebär att det finns ett EcoRI klyvningställe precis innan och efter AOX DNA sekevens. Det finns desutom ett BglII klyvningsställe i mitten av AOX genen. För att kunna identifiera och bestämma storleken av DNA-fragment analyserar man dem med hjälp av agarosgelelektrofores där man parallellt med provet kör en standard med en blandning av DNAfragment med kända storlekar. Laborationen består av tre moment. A. Preparation av plasmid-dna. B. Klyvning av plasmid-dna med restriktionsenzymer. C. Analys av plasmid-dna med agarosgelelektrofores.
UTFÖRANDE A. Preparation av plasmid-dna Assistenter 1. Odla E. coli kulturer i LB-medium med ampicillin över natten. 2. Centrifugera ner 1.5 ml (till varje labbgrupp) av cellerna pa maximal hastighet och ta bort LB-mediet. 3. Sätt rören med de skördade E.coli cellerna på is. Studenter 4. Tillsätt 250 ul buffert P1 och resuspendera cellerna. 5. Tillsätt 250 ul buffert P2 och vänd provet upp och ner 5-6 ggr så att provet blandas. Buffert P2 (innhåller bla NaOH & SDS) spräcker (lyserar) E. coli cellerna. Låt provet stå i rumstemperatur 3.5 min. 6. Tillsätt 350 ul buffert N3 och vänd åter provet upp och ner 5-6 ggr. Buffert N3 gör att kromosomalt DNA aggregerar medan det mindre plasmid-dna fortfarande håller sig lösligt. 7. Centrifugera 10 min på maximalt varvtal. 8. Dekantera/häll över den lösliga delen (supernatanten), innehållande plasmid-dna, från steg 7 till den blå kolonnen. Gelen i kolonnen binder plasmid-dna. Andra molekyler som RNA och proteiner passerar rakt igenom kolonnen vid centrifugeringen i steg 9. 9. Centrifugera kolonnen 1 min på maximalt varvtal. Släng bort den lösning som centrifugerats igenom kolonnen. 10. Tillsätt 500 ul buffert PB till kolonnen och centrifugera kolonnen 1 min på maximalt varvtal. Släng bort den lösning som centrifugerats igenom kolonnen. 11. Tillsätt 750 ul buffert PE till kolonnen och centrifugera kolonnen 1 min på maximalt varvtal. Släng bort den lösning som centrifugerats igenom kolonnen. 12. Centrifugera kolonnen ytterligare 1 min på max varvtal för att vara säker på att all PE buffer försvinner. 13. Placera den blå kolonnen i ett rent provrör. Tillsätt 50ul vatten och låt kolonnen stå i rumstemperatur 1 min. Centrifugera kolonnen 1 min på max varvtal. Plasmid-DNAt lossnar/elueras från kolonnen. Plasmid-DNAt är isolerat!
B. Klyvning av plasmid-dna med restriktionsenzymer Assistenter Restriktionsenzym-mix (per grupp) Assistenterna tillhanda håller reaktions-mix A, B, C. A. BglII + Buffert B. EcoRI + Buffert C. EcoRI + BglII + Buffert Varje labgrupp ska ha tre rör (A, B och C), innehållande 14µl restriktionsenzym- mix. Agarosgeler Gjut 1% agarosgeler innehållande GelRed, en lösning, som gör DNA synligt i UV-ljus. Montera geler och häll på elforesbuffert så att agarosgelen är täckt av buffert Studenter 1. Tillsätt 4 µl av ditt isolerade plasmid-dna till vardera rör (A, B & C) med Restriktionsenzym-mix. Var noga när du tillsätter DNA så att det hamnar där det ska. Centrifugerar rören ett par sekunder på maximal hastighet så att all vätska hamnar i botten. 2. Inkubera proverna i ca 5 minuter på 37 C vattenbad. Under inkuberingen kommer restriktionsenzymerna att klyva plasmid-dna. C. Analys av plasmid-dna med agarosgelelektrofores 1. Centrifugera ett par sekunder på maximal hastighet. Detta görs för att ev. prov som dunstat och fastnat i locket inte ska gå förlorat. 2. Tillsätt 5 ul provpåsättningsbuffert (blå) till vardera prov. 3. Applicera med automatpipett 5 µl av respektive provblandning i var sin brunn, samt 6 µl molekylviktsblandning i en separat brunn. Två ev. tre grupper ska köra på samma agarosgel.
4. Koppla elektroforesapparaten till spänningsaggregatet. Proverna ska vandra mot anoden (+). Ställ in 80 Volt. Elektroforesen tar ca 45 min. Labassistenterna sköter hanteringen av den färdiga gelen. Steg 3 och 4. 5. Analys: Beräkna avståndet till brunnarna för samtliga band. Storleken på DNA referensfragmenten erhålles av assistenten.
REDOVISNING En laborationsrapport ska skrivas per grupp. Alla deltagarnas namn ska finnas med på rapporten. Rapporten ska skivas på dator och beskriva syfte och kortfattad teori för laborationen samt nedanstående uppgifter och svar på frågor. Den ska också innehålla slutsatser som; hur fungerade laborationen, blev resultatet som väntat. 1. Fotografi av gel. 2. Läs av storleken på de erhållna DNA-fragmenten i A, B, och C med hjälp av DNA-stegen (referens för storleken på ert klyvda DNA). Besvara följande frågor 1. Förklara hur ett restriktionsenzym fungerar. Vilka baspar känner de två restriktionsenzymerna du använt igen? 2. Förklara hur man gått tillväga när man satt in det extra DNA-fragmentet i plasmiden. 3. Hur fungerar GelRed, som gör att vi kan se DNA? 4. Varför finns det en gen som kodar för ampicillinresistens (Amp R ) i plasmiden? Rapporten ska lämnas in till assistenterna senast en vecka efter laborationstillfället. Ni kan även e- maila den.