PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. SK tester för användning med Autostainer Link 48. Innehållsförteckning

PD-L1 IHC 22C3 pharmdx SK006 50 tester för användning med Autostainer Link 48 Innehållsförteckning 1. Avsedd användning... 2 2. Sammanfattning och förklaring... 2 2.1 NSCLC...2 2.2 Melanom...2 3. Procedurprincip... 2 4. Medföljande material... 2 5. Material som behövs men inte ingår... 3 6. Försiktighetsåtgärder... 4 7. Förvaring... 4 8. Provberedning... 5 8.1 Paraffininbäddade snitt...5 8.2 Rekommenderad förvaring av skurna snitt...5 9. Reagensberedning... 5 10. Färgningsprocedur på Autostainer Link 48-lösningen... 5 11. Kvalitetskontroll... 6 12. Analysverifiering... 6 13. Tolkning av poängsättning... 6 13.1 NSCLC...6 13.2 Melanom...7 14. Utvärdering av objektglas... 8 15. Allmänna begränsningar... 9 16. Produktspecifika begränsningar... 10 17. Prestandautvärdering... 10 17.1 Icke-klinisk prestandautvärdering: Normala och neoplastiska vävnader...10 17.2 Klinisk prestandautvärdering: NSCLC...12 17.3 Icke-klinisk prestandautvärdering: NSCLC...15 17.4 Icke-klinisk prestandautvärdering: Melanom...17 18. Felsökning... 18 19. Referenser... 18 P03928SE_05/SK00621-2/2017.02 s. 1/19

PD-L1 IHC 22C3 pharmdx SK006 50 tester för användning med Autostainer Link 48 1. Avsedd användning För in vitro-diagnostik. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx är en kvalitativ immunhistokemisk analys som använder Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 avsedd för upptäckt av PD-L1-protein i formalinfixerad, paraffininbäddad (FFPE) vävnad med icke-småcellig lungcancer (NSCLC) och melanomvävnad med hjälp av EnVision FLEX visualiseringssystem på Autostainer Link 48. Icke-småcellig lungcancer (NSCLC) PD-L1-proteinuttryck bestäms enligt Tumor Proportion Score (TPS), d.v.s. procentandelen av livsdugliga tumörceller som uppvisar partiell eller fullständig membranfärgning oberoende av intensitet. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx indikeras som stöd för identifiering av NSCLC-patienter för behandling med KEYTRUDA (pembrolizumab). Tröskelvärden för uttryck som styr behandling under särskilda kliniska omständigheter finns på KEYTRUDA -produktetiketten. 2. Sammanfattning och förklaring Bindning av PD-1-liganderna PD-L1 och PD-L2 till receptor PD-1 på T-celler inhiberar proliferation av T-celler och cytokinproduktion. Uppreglering av PD-1-ligander förekommer i vissa tumörer och signaleringen genom den här reaktionsvägen kan bidra till att inhibera aktiva T-cellers immunövervakning av tumörer. KEYTRUDA är en humaniserad monoklonal antikropp som binder till PD-1-receptorn och blockerar interaktionen med PD-L1 och PD-L2 och lösgör banmedierad PD-1-inhibering av immunsvaret, inklusive immunsvar mot tumörer. I syngena mustumörmodeller resulterade blockering av PD-1-aktivitet i minskad tumörtillväxt (1). 2.1 NSCLC I den Merck Sharp & Dohme-sponsrade kliniska studien KEYNOTE-024 (KN024) undersöktes den kliniska validiteten för PD-L1 IHC 22C3 pharmdx avseende att identifiera PD-L1-uttryckande (TPS 50 %) tidigare obehandlade NSCLC-patienter som kanske svarar på KEYTRUDA-behandling. PD-L1-uttryckande NSCLC-patienter (TPS 50 %) som behandlats med KEYTRUDA uppvisade bättre resultat än vid vanlig kemoterapi. Information om KN024-studien finns i avsnittet Klinisk prestandautvärdering: NSCLC nedan. I den Merck Sharp & Dohme-sponsrade kliniska studien KEYNOTE-010 (KN010) undersöktes den kliniska validiteten för PD-L1 IHC 22C3 pharmdx avseende att identifiera PD-L1-uttryckande (TPS 1 %) tidigare behandlade NSCLC-patienter som kanske svarar på KEYTRUDA-behandling. PD-L1-uttryckande NSCLC-patienter (TPS 1 %) som behandlats med KEYTRUDA uppvisade bättre resultat än vid docetaxelbehandling. Information om KN010-studien finns i avsnittet Klinisk prestandautvärdering: NSCLC nedan. 2.2 Melanom PD-L1 IHC 22C3 pharmdx kan användas till att fastställa PD-L1-status hos melanompatienter som övervägs för behandling (2). 3. Procedurprincip PD-L1 IHC 22C3 pharmdx innehåller optimerad reagens och det protokoll som krävs för att slutföra en IHC-färgningsprocedur av FFPEvävnadsprover med Autostainer Link 48. Efter inkubering med den primära monoklonala antikroppen till PD-L1 eller NCR (Negative Control Reagent) inkuberas vävnadsprov med en Linker-antikropp till värdarten för den primära antikroppen och inkuberas därefter med en färdig visualiseringsreagens som består av sekundära antikroppsmolekyler och pepparrotsperoxidasmolekyler sammankopplade med en stomme av dextranpolymer. Enzymkonverteringen av den tillagda kromogenen resulterar i en fällning bestående av en synlig reaktionsprodukt vid antigenen. Färgen på den kromogena reaktionen modifieras av en kromogen förbättringsreagens. Vävnadsprovet kan därefter kontrastfärgas och förses med täckglas. Resultat tolkas med hjälp av ett ljusmikroskop. 4. Medföljande material Varje sats innehåller 19,5 ml med PD-L1 primär antikropp (cirka 3 µg/ml proteinkoncentration) och innehåller reagens för att utföra 500 tester i upp till 15 separata körningar. Materialet nedan räcker för 50 tester (50 objektglas inkuberade med Primary Antibody till PD-L1 och 50 objektglas inkuberade med motsvarande Negative Control Reagent, sammanlagt 100 objektglas). Antalet tester baseras på användningen av 2 x 150 µl per objektglas för varje reagens förutom DAB+ och Target Retrieval Solution. Satsen innehåller material för högst 15 individuella färgningskörningar. Kvantitet Beskrivning 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Buffrad lösning innehållande väteperoxid, rengöringsmedel och 0,015 mol/l natriumazid. P03928SE_05/SK00621-2/2017.02 s. 2/19

1 x 19,5 ml Primary Antibody: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3 Monoklonal mus-anti-pd-l1 (IgG 1 ) i en buffrad lösning innehållande stabiliseringsprotein och 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 15 ml Negative Control Reagent NEGATIVE CONTROL REAGENT Monoklonal kontroll-igg-antikropp från mus i en buffrad lösning innehållande stabiliseringsprotein och 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 34,5 ml Mouse LINKER LINKER, ANTI-MOUSE Sekundär musantikropp mot musimmunglobuliner i en buffrad lösning innehållande stabiliseringsprotein och 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextran bundet med peroxidasmolekyler och sekundära getantikroppsmolekyler mot kanin- och musimmunglobuliner i en buffrad lösning innehållande stabiliseringsprotein och ett antimikrobiellt medel. 15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Buffrad lösning innehållande väteperoxid och ett antimikrobiellt medel. 1 x 5 ml DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3 -diaminobenzidin tetrahydroklorid i organisk lösning. 1 x 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Kopparsulfat i vatten. 6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Buffrad lösning, ph 6,1, innehållande rengöringsmedel och ett antimikrobiellt medel. 15 objektglas PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Control Slides CONTROL SLIDES Varje objektglas innehåller snitt av två pelleterade, formalinfixerade paraffininbäddade cellinjer: NCI-H226* med måttligt PD-L1-proteinuttryck och MCF-7 med negativt PD-L1-proteinuttryck. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1-negativa NCI-H226: PD-L1-positiva * Dr. AF Gazdar och Dr. JD Minna vid NIH har bidragit till utvecklingen av NCI-H226 (ATCC-nummer: CRL-5826 ) (3). Obs! Alla inkluderade reagens är formulerade specifikt för att användas med den här satsen. För att testet ska fungera enligt specifikationen kan inga utbyten göras, förutom EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, (50x) (kod K8005). PD-L1 IHC 22C3 pharmdx har tagits fram särskilt för användning med Autostainer Link 48. Se användarhandböckerna för Autostainer Link 48 och PT Link för mer information. 5. Material som behövs men inte ingår PT Link Pre-treatment Module (kod PT100/PT101/PT200) Autostainer Link 48 (kod AS480) EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (kod K8007) P03928SE_05/SK00621-2/2017.02 s. 3/19

Hematoxylin (kod K8008) Destillerat eller avjoniserat vatten (vatten av reagenskvalitet) Timer Positiva och negativa vävnader för processkontroll (se avsnittet Kvalitetskontroll) Objektglas för mikroskop: Dako FLEX IHC objektglas för mikroskop (kod K8020) eller Fisherbrand Superfrost Plus laddade objektglas Täckglas Permanent monteringsmedium och hjälpreagens krävs för monteringstäckglas Ljusmikroskop (4x 40x objektivförstoring) 6. Försiktighetsåtgärder 1) För in vitro-diagnostik. 2) För yrkesmässigt bruk. 3) Denna produkt innehåller natriumazid (NaN 3 ), en kemikalie som är mycket giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan NaN 3, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten när det kastas bort så att inte metallazider ackumuleras i avloppet (4). 4) Primary Antibody, Negative Control Reagent, Linker och Visualization Reagent innehåller material med animaliskt ursprung. 5) Vävnadsprover och alla substanser utsatta för dem, både före och efter fixering, ska hanteras som om de kan överföra infektion och kasseras med rätt försiktighetsåtgärder (5). 6) Inkuberingstider, temperaturer eller metoder förutom de särskilt föreskrivna, kan ge felaktiga resultat. 7) Reagens har spätts optimalt. Ytterligare spädning kan leda till sämre antigenfärgning. 8) Visualization Reagent, Liquid DAB+ kromogen och förberedd DAB+ Substrate-Chromogen Solution kan påverkas negativt om de utsätts för starkt ljus. Förvara inte systemkomponenter och utför inte färgning i starkt ljus, som direkt solljus. 9) Paraffinrester kan leda till falska negativa resultat. 10) Användning av reagensvolymer andra än rekommenderade kan resultera i utebliven synlig PD-L1 immunreaktivitet. 11) Resultat från en liten studie visade ett liknande dynamiskt omfång av PD-L1-uttryck i primära och metastatiska vävnadsprovpar av NSCLC. Det är möjligt att det kan finnas olikheter mellan PD-L1-uttryck i primära tumörer jämfört med metastatiska förekomster hos samma patient. 12) Stora snitt av vävnadsprov kan behöva 3 x 150 µl av reagens. 13) Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste vara ordentligt utbildade i lämpliga arbetsprocedurer, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsinstruktioner. Ytterligare information finns i säkerhetsdatabladet (SDS). 14) Använd lämplig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud. 15) Oanvänd lösning måste kasseras enligt lokala, statliga och överstatliga föreskrifter. 16) Datablad för materialsäkerhet för yrkesanvändare kan erhållas på begäran. Fara DAB+ Chromogen: 1 5 % bifenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetraklorid H350 Kan orsaka cancer. H341 Misstänks kunna orsaka genetiska defekter. P201 Inhämta särskilda instruktioner före användning. P202 Använd inte produkten innan du har läst och förstått säkerhetsanvisningarna. P280 Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. P308 + P313 Vid exponering eller oro: Kontakta läkare. P405 Förvaras inlåst. P501 Kassera innehåll/behållare i enlighet med alla lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. Varning EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1 5 % citronsyra H319 Orsakar allvarlig ögonirritation. H411 Giftigt för vattenlevande organismer med långtidseffekter. P280 Använd ögon- eller ansiktsskydd. P273 Undvik utsläpp till miljön. P264 Tvätta händerna grundligt efter användning. P305 + P351 + P338 VID KONTAKT MED ÖGONEN: Skölj noggrant med vatten i flera minuter. Ta ut kontaktlinser om du har sådana och om det är enkelt att göra det. Fortsätt att skölja. P337 + P313 Om ögonirritationen kvarstår: Kontakta läkare. P501 Kassera innehåll/behållare i enlighet med alla lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. 7. Förvaring Förvara alla komponenter av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, inklusive kontrollobjektglas, mörkt vid 2 8 C när de inte används i Autostainer Link 48. Använd inte satsen efter utgångsdatumet som står på utsidan förpackningen. Användaren måste validera alla förvaringsförhållanden som avviker från de som specificerats i det här bipacksedeln. Det finns inga tydliga sätt att upptäcka instabilitet hos den här produkten. Därför bör positiva och negativa kontroller köras samtidigt med vävnadsprover från patient. P03928SE_05/SK00621-2/2017.02 s. 4/19

8. Provberedning Prov måste förberedas så att vävnaden bevaras för IHC-färgning. Standardmetoder för vävnadsbehandling ska användas för alla prover. 8.1 Paraffininbäddade snitt Paraffininbäddade vävnader fixerade i formalin lämpar sig för användning. Alternativa fixeringsmedel har inte validerats och kan ge upphov till felaktiga resultat. Fixeringstid på 12 72 timmar i 10 % neutralbuffrat formalin (NBF) rekommenderas, dock har en studie med begränsade prover visat att fixeringstider på 4 168 timmar i 10 % NBF inte ändrade upptäckt av PD-L1 systematiskt. Fixeringstider på 3 timmar kan resultera i skilda upptäckter av PD-L1. Prover bör blockeras till en tjocklek på 3 eller 4 mm, fixeras i formalin och torkas och klargöras i en serie av alkoholer och xylen, följt av infiltrering med smält paraffin. Paraffinets temperatur bör inte överskrida 60 C. FFPE-vävnadsblock som är äldre än 5 år kan resultera i förlust av PD-L1-immunreaktivitet. Vävnadsprover ska snittas i 4-5 µm. Efter snittning ska vävnadsproverna monteras på Dako FLEX IHC-mikroskopobjektglas (kod K8020) eller Fisherbrand Superfrost Plus-objektglas och sedan placeras i en ugn vid 58 ± 2 C i 1 timme. 8.2 Rekommenderad förvaring av skurna snitt För att bevara antigeniciteten ska vävnadssnitt som monterats på objektglas förvaras mörkt vid 2 8 C (i första hand) eller vid rumstemperatur (upp till 25 C). Förhållandena för förvaring och hantering av objektglas bör inte överskrida 25 C efter montering för att säkerställa vävnadens integritet och antigenicitet. 8.2.1 Rekommenderad förvaring av skurna NSCLC-snitt Skurna snitt måste färgas inom 6 månader om de förvaras vid 2 8 C (att föredra), eller vid 25 C. 8.2.2 Rekommenderad förvaring av skurna melanomsnitt Skurna snitt måste färgas inom 4 månader om de förvaras vid 2 8 C (att föredra), eller inom 2 månader om de förvaras vid 25 C. 9. Reagensberedning Följande reagens måste beredas innan färgning: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) Förbered en tillräcklig mängd 1x Target Retrieval Solution, Low ph genom att späda Target Retrieval Solution, Low ph (50x) 1:50 med destillerat eller avjoniserat vatten (vatten av reagenskvalitet). ph-värdet för 1x Target Retrieval Solution måste vara 6,1 ± 0,2. Om 1x Target Retrieval Solution har ett ph under 5,9 kan det leda till felaktiga resultat. En 30 ml-flaska med Target Retrieval Solution, Low ph, 50x utspädd 1:50 ger 1,5 L av 1x reagens, tillräckligt för att fylla en PT Link-tank som kan behandla upp till 24 objektglas per gång. Kassera 1x Target Retrieval Solution efter tre användningar och använd inte längre än fem dagar efter spädning. Ytterligare EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) finns tillgängligt under kod K8005. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Bered en tillräcklig mängd tvättbuffert genom att späda Wash Buffer (20x) 1:20 med destillerat eller avjoniserat vatten (vatten av reagenskvalitet) för tvättstegen. Förvara inte oanvänd 1x-lösning vid 2 8 C längre än en månad. Kassera bufferten om den är grumlig. Se användarhandboken för Autostainer Link 48 för mer information. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) finns tillgängligt som kod K8007. DAB+ Substrate-Chromogen Solution Lösningen ska blandas ordentligt före användning. Eventuell fällning som utvecklas i lösningen påverkar inte färgningens kvalitet. För att förbereda DAB+ Substrate-Chromogen Solution, lägg till 1 droppe Liquid DAB+ Chromogen per ml av DAB+ Substrate Buffer och bland. Förberedd Substrate-Chromogen är stabil i 5 dagar om den förvaras mörkt vid 2 8 C. Viktigt: Vid användning av en hel flaska DAB+ Substrate Buffer tillsätts 9 droppar DAB+ Chromogen. Trots att det står 7,2 ml på etiketten är det den användbara volymen och tar inte hänsyn till den döda volymen i flaskan. Färgen på Liquid DAB+ Chromogen kan variera mellan klar till brunlila. Detta kommer inte påverka produktens effekt. Späd enligt instruktionerna ovan. Om för stor mängd Liquid DAB+ Chromogen läggs till DAB+ Substrate Buffer kommer det att resultera i försämrad positiv signal. 10. Färgningsprocedur på Autostainer Link 48-lösningen Procedurnoteringar Före användning ska användaren läsa dessa instruktioner noggrant och vara förtrogen med alla komponenter och all instrumentering (se försiktighetsåtgärder). All reagens ska anta rumstemperatur (20 25 C) före immunfärgning. På samma sätt ska alla inkuberingssteg utföras vid rumstemperatur. Låt inte vävnadssnitt torka under färgningsproceduren. Torkade vävnadssnitt kan uppvisa icke-specifik färgning. Alla nödvändiga steg och inkuberingstider är förprogrammerade i programvaran Dako Link. Se användarhandböckerna för Autostainer Link 48 och PT Link för mer information om programmeringsprotokoll och laddning av objektglas och reagens. P03928SE_05/SK00621-2/2017.02 s. 5/19

Obs! De reagens och instruktioner som medföljer det här systemet har utformats för bästa möjliga resultat vid användning av rekommenderade reagens och material. Ytterligare spädning av reagens eller ändring av inkuberingstider eller temperaturer kan ge felaktiga eller motstridiga resultat. Färgningsprotokoll Välj färgningsprotokollet PD-L1 IHC 22C3 pharmdx från alternativen på menyn i Dako Link. Alla nödvändiga steg och inkuberingstider är förprogrammerade i Autostainer Link 48. Om lämpliga PD-L1 IHC 22C3 pharmdx-protokoll inte finns på servern kontaktar du den lokala tekniska kundtjänsten för att få dem. Steg 1: Avparaffinering, rehydrering och procedur för målåtervinning (3-i-1) Ytterligare information finns i användarhandboken för PT Link. Ställ in PT Link (kod PT100/PT101/PT200) Förvärmning och nedkylning till 65 C. Ställ in värmen på 97 C i 20 minuter. Fyll PT Link-tankarna med 1,5 L med Target Retrieval Solution, Low ph, 1x arbetslösning för att täcka vävnadssnitten. Förvärm Target Retrieval Solution till 65 C. Sänk ned Autostainer-ställ med monterade FFPE-vävnadssnitt i förvärmd Target Retrieval Solution, Low ph, (1x arbetslösning) i PT Link-tanken. Inkubera i 20 minuter vid 97 C. När målåtervinningsinkuberingen har slutförts och temperaturen sänkts till 65 C, ta bort Autostainer-ställen med objektglasen från PT Link-tanken och placera omedelbart Autostainer-ställen med objektglas i en tank (t.ex. PT Link Rinse Station, kod PT109) innehållande spädd, rumstempererad tvättbuffert (kod K8007). Lämna de inkuberade objektglasen i spädd, rumstempererad tvättbuffert i 5 minuter. Steg 2: Färgningsprocedur Efter avparaffinering, rehydrering och procedur för målåtervinning (3-i-1) placeras Autostainer-ställen med objektglas på Autostainer Link 48. Instrumentet kommer att utföra färgningsprocessen genom att applicera nödvändiga reagens, övervaka inkuberingstiden och skölja objektglasen mellan reagens. Reagenstiderna är förprogrammerade i programvaran Dako Link. Steg 3: Kontrastfärgning Objektglasen ska kontrastfärgas i 5 minuter med Hematoxylin (Link) (kod K8008). Inkuberingstiden med hematoxylin är förprogrammerad i protokollet. Steg 4: Montering Icke-vattenhaltigt, permanent monteringsmedium krävs. Obs! Blekning av färgade objektglas kan förekomma på grund av flera faktorer bl.a. kontrastfärgning, monteringsmaterial och - metoder samt objektglasens förvaringsförhållanden. Förvara objektglasen i mörkt i rumstemperatur för att minimera blekning (20 25 C). 11. Kvalitetskontroll Reagens i PD-L1 IHC 22C3 pharmdx har kvalitetskontrollerats genom immunhistokemi med den målåtervinning och de färgningsprocedurer som anges ovan. Avvikelser från de rekommenderade procedurerna för vävnadsfixering, bearbetning och inbäddning i användarens laboratorium kan ge upphov till signifikanta avvikelser i resultatet. Kvalitetskontroller ska ingå i varje färgningskörning. Kvalitetskontrollerna specificeras i tabell 1 and innefattar: ett H&E-färgat patientvävnadsprov, positiva och negativa kontrollvävnader från laboratoriet och objektglas med kontrollcellinje från Dako (6). För USA: se riktlinjerna för kvalitetskontroll från CAP:s (College of American Pathologists) ackrediteringsprogram för immunhistokemi. Se även riktlinjerna för CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry (6, 7, 8) för ytterligare information. 12. Analysverifiering Före initial användning av ett färgningssystem i en diagnostisk procedur bör användaren verifiera analysens funktion genom att testa den på en serie av vävnader från laboratorium med kända IHC-egenskaper som motsvarar kända positiva och negativa vävnader. Se kvalitetskontrollprocedurerna som redovisas i kvalitetskontrollavsnittet ovan. Kvalitetskontrollprocedurerna bör upprepas för alla nya partier med antikroppar eller vid ändringar av analysparametrarna. Felsökningsalternativ för eventuella problem, deras orsaker och föreslagna korrigeringsåtgärder beskrivs i tabell 13. 13. Tolkning av poängsättning Se den specifika indikationen för information om respektive tolkning av poängsättning. 13.1 NSCLC Alla livsdugliga tumörceller på hela objektglaset måste utvärderas och inkluderas i poängutvärderingen för PD-L1. Minst 100 livsdugliga tumörceller måste finnas i det PD-L1-färgade objektglaset för att provet ska anses vara adekvat för PD-L1-utvärdering. Utvärdering av objektglas bör utföras av en patolog med hjälp av ett ljusmikroskop. För utvärdering av den immunhistokemiska färgningen och poängsättningen lämpar sig 10 40x objektivförstoring. Eventuell märkbar membranfärgning av tumörcellsfärgning bör inkluderas i poängsättningen. PD-L1-proteinuttryck bestäms enligt Tumor Proportion Score (TPS), d.v.s. procentandelen av livsdugliga tumörceller som uppvisar partiell eller fullständig membranfärgning oberoende av intensitet. P03928SE_05/SK00621-2/2017.02 s. 6/19

Poängsätt partiell eller komplett cellmembranfärgning ( 1+) som märks distinkt från cytoplasmisk färgning. Cytoplasmisk färgning bör anses icke-specifik och ingår inte i utvärderingen av färgintensiteten. Normala celler och tumörassocierade immunceller såsom infiltrerande lymfocyter och makrofager ska inte inkluderas i poängen för bestämningen av PD-L1-positivitet. Tumörprover färgade med NCR måste ha 0 specifik färgning och 1+ bakgrundsfärgning. Provet bör anses ha PD-L1-uttryck om TPS 1 % av de livsdugliga tumörcellerna uppvisar membranfärgning oberoende av intensitet. Provet bör anses ha högt PD-L1-uttryck om TPS 50 % av de livsdugliga tumörcellerna uppvisar membranfärgning oberoende av intensitet. Tumörproportionspoäng PD-L1-uttrycksnivåer TPS < 1 % TPS = 1 49 % TPS 50 % PD-L1-uttrycksstatus Inget PD-L1-uttryck PD-L1-uttryck Högt PD-L1-uttryck Element som inkluderas och/eller exkluderas vid bestämning av tumörproportionspoäng anges i tabellen nedan. Element Tumörceller Immunceller Annat Inkluderade i TPS-poängen för NSCLC Övertygande partiell eller fullständig cellmembranfärgning (i varje intensitet) av livsdugliga tumörceller Inte inkluderade Inte inkluderade Exkluderade från TPS-poängen för NSCLC Exkludera cytoplasmatiska färgningar Exkludera alla färgningar av immunceller, t.ex.: Mononukleära inflammatoriska celler (stora lymfocyter, monocyter, lungmakrofager) Plasmaceller Neutrofiler Exkludera alla färgningar av: Normala celler intill tumörceller Stromala celler (fibroblaster) Nekrotiska celler och/eller cellrester Antrakotiskt pigment För varje färgningskörning ska objektglasen undersökas i den ordning som anges i tabell 1 för att bestämma färgningskörningens validitet och möjliggöra utvärdering av vävnadsprovets färgning. Se PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Interpretation Manual för ytterligare instruktioner. 13.2 Melanom Alla livsdugliga tumörceller på hela objektglaset måste utvärderas och inkluderas i poängutvärderingen för PD-L1. Minst 100 livsdugliga tumörceller måste finnas i det PD-L1-färgade objektglaset för att provet ska anses vara adekvat för PD-L1-utvärdering. Utvärdering av objektglas bör utföras av en patolog med hjälp av ett ljusmikroskop. För utvärdering av den immunhistokemiska färgningen och poängsättningen lämpar sig 10 40x objektivförstoring. PD-L1-proteinuttryck fastställs med hjälp av Melanoma Score (MEL-poäng), vilket är förhållandet mellan tumör och associerade immunceller som uttrycker PD-L1 i någon intensitet (svag, måttlig eller stark färgning) i förhållande till alla livskraftiga tumörceller och PD-L1-positiva associerade immunceller. MEL-poängen rapporteras som: MEL-poäng MEL-poäng 0 MEL-poäng 1 MEL-poäng 2 MEL-poäng 3 MEL-poäng 4 MEL-poäng 5 % färgade celler 0 % < 1 % 1 % < 10 % 10 % < 33 % 33 % < 66 % 66 % Partiell eller fullständig membranfärgning av tumörceller ska inkluderas i MEL-poängen. Cytoplasmatisk färgning av tumörceller ska betraktas som icke-specifik färgning och ingår inte i utvärderingen av färgintensiteten. Partiell eller fullständig cellmembranfärgning och/eller cytoplasmatisk färgning av tumörassocierade immunceller ska inkluderas i MEL-poängen. Tumörassocierade immunceller är mononukleära inflammatoriska celler som interkalerar inom, eller angränsar till, inneslutna tumörer. P03928SE_05/SK00621-2/2017.02 s. 7/19

OBS! Brun melaninpigmentering kan förekomma vid tolkning av prover från melanompatienter. En melaninhalt vid baslinjen i både tumörceller och makrofager (melanofager) kan förekomma och leda till tolkningssvårigheter. Melanin ska exkluderas vid poängsättning av cellmembranfärgning. Vi rekommenderar starkt att du jämför det PD-L1-färgade objektglaset med ett sekventiellt snitt som färgats med NCR för att identifiera och exkludera en melaninhalt. Om en starkt förhöjd melaninhalt utesluter poängsättning av cellmembranfärgning av tumörceller kan utvärderingen av PD-L1-uttrycket bli obestämd. Tumörprover färgade med NCR måste ha 0 specifik färgning och 1+ bakgrundsfärgning. Element som inkluderas och/eller exkluderas vid bestämning av MEL-poäng anges i tabellen nedan. Element Inkluderade i MEL-poäng för melanom Exkluderade från MEL-poäng för melanom Tumörceller Immunceller Annat Övertygande partiell eller fullständig cellmembranfärgning (i varje intensitet) av livsdugliga tumörceller Membranfärgning och/eller cytoplasmatisk färgning (vid varje intensitet) av immunceller eller mononukleära inflammatoriska celler (MIC) i inneslutna tumörer och intill stödjande stroma (tumörinfiltrerande), såsom: Stora lymfocyter (lymfocytaggregat) Monocyter Inte inkluderade Exkludera cytoplasmatiska färgningar Exkludera alla färgningar av: Immunceller inom stroma distinkta från inneslutna tumörer Plasmaceller Neutrofiler Exkludera alla färgningar av: Normala celler intill tumörceller Stromala celler (fibroblaster) Nekrotiska celler och/eller cellrester Endogent melanin För varje färgningskörning ska objektglasen undersökas i den ordning som anges i tabell 1 för att bestämma färgningskörningens validitet och möjliggöra utvärdering av vävnadsprovets färgning. Se PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Interpretation Manual för ytterligare instruktioner. 14. Utvärdering av objektglas Tabell 1. Rekommenderad ordning för utvärdering av objektglas Prover Förklaring Krav 1. H&E (från laboratorium) En hematoxylin- och eosinfärgning (H&E-färgning) av vävnadsprovet utvärderas först för att bedöma vävnadens histologi och bevarandekvalitet. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx och H&E-färgning bör utföras på seriesnitt från samma paraffinblock som provet. Vävnadsproverna ska vara intakta och välbevarade och de ska bekräfta tumörtypen. Ett objektglas med kontrollcellinje ska färgas med Primary Antibody till PD-L1 i varje färgning. 2. Objektglas med kontrollcellinje (från Dako) 3. Objektglas med positiv kontrollvävnad (från laboratorium) Objektglas med kontrollcellinje färgad med PD-L1 primär antikropp från PD-L1 IHC 22C3 pharmdx bör undersökas för att se till att alla reagens fungerar korrekt. Objektglaset med kontrollcellinje innehåller den PD-L1-positiva cellinjepelleten och den PD-L1- negativa cellinjepelleten. Därefter undersöks objektglasen med positiv kontrollvävnad som färgats med både PD-L1 primär antikropp och Negative Control Reagent. Objektglasen verifierar att fixeringsmetoden och epitopåtervinningsprocessen är korrekta. Kända positiva vävnadskontroller bör endast användas för övervakning av korrekt resultat från bearbetade vävnader och testreagens, inte som hjälp i formulering av en specifik diagnos i patientvävnadsprov. NCI-H226 (PD-L1-positiv kontrollcellinje) acceptanskriterier: Cellmembransfärgning av 70 % av celler vid 2+ normal färgningsintensitet. Icke-specifik färgning < 1+ intensitet. MCF-7 (PD-L1-negativ kontrollcellinje) acceptanskriterier: Ingen specifik färgning. Icke-specifik färgning < 1+ intensitet. Notera att färgning av fåtal celler i cellpelleten MCF-7 kan förekomma. Följande acceptanskriterier gäller: förekomst av totalt 10 celler med tydlig plasmamembranfärgning eller cytoplasmisk färgning med 1+ intensitet inom MCF-7-cellpelletens gränser är godtagbart. Om ingen av kontrollcellinjerna uppfyller dessa kriterier bör alla resultat med patientproverna anses ogiltiga. Kontrollerna bör vara biopsiprover/kirurgiska prover av samma tumörtyp som patientprovet, fixerade, bearbetade och inbäddade så snart som möjligt på samma sätt som patientproverna. Använd intakta prover för att tolka färgningsresultat eftersom nekrotiska eller degenererade celler ofta färgas icke-specifikt. Vävnaderna som väljs till den positiva vävnadskontrollen bör ge svag till måttlig positiv färgning med PD-L1 för att underlätta upptäckt av små skillnader i provernas sensitivitet. Två kontrollobjektglas med positiv vävnad ska inkluderas i varje färgningskörning. Objektglas färgat med PD-L1: Förekomst av brun plasmamembranfärgning ska observeras. Icke-specifik färgning bör vara 1+. P03928SE_05/SK00621-2/2017.02 s. 8/19

4. Objektglas med negativ kontrollvävnad (från laboratorium) 5. Kontrollvävnad från tonsill (valfritt) (från laboratorium) 6. Objektglas med patientvävnad färgad med Negative Control Reagent 7. Objektglas med patientvävnad färgad med PD-L1 primär antikropp Objektglasen med negativ kontrollvävnad (som är känt PD- L1-negativ) som färgats med både PD-L1 primär antikropp och Negative Control Reagent ska därefter undersökas för att verifiera specificiteten hos den primära antikroppens märkning av målantigenen. Alternativt kan negativa delar av den positiva kontrollvävnaden användas som negativ kontrollvävnad, men detta bör verifieras av användaren. Använd mänsklig tonsillvävnad fixerad, bearbetad och inbäddad på ett liknande sätt som patientprovet som ytterligare kontrollmaterial för att verifiera sensitivitet, specificitet och icke-specifik bakgrundsfärgning från analysen. Undersök patientprov som färgats med Negative Control Reagent från PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Negative Control Reagent använd istället för den primära antikroppen och underlättar tolkningen av specifik färgning vid antigenen. Undersök hela objektglasen med patientvävnad som färgats med PD-L1 primär antikropp från PD-L1 IHC 22C3 pharmdx sist. Se sammanfattning och förklaring, begränsningar och prestandaegenskaper för specifik information om immunreaktivitet från PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Objektglas färgat med Negative Control Reagent: ingen membranfärgning. Icke-specifik färgning bör vara 1+. Om de positiva vävnadskontrollerna inte uppvisar lämplig positiv färgning bör resultaten från testvävnaderna anses ogiltiga. Kontrollerna bör vara biopsiprover/kirurgiska prover av samma tumörtyp som patientprovet, fixerade, bearbetade och inbäddade så snart som möjligt på samma sätt som patientproverna. Två kontrollobjektglas med negativ vävnad ska inkluderas i varje färgningskörning. Objektglas färgat med PD-L1: Ingen membranfärgning i tumörceller. Ickespecifik färgning bör vara 1+. Objektglas färgat med Negative Control Reagent: ingen membranfärgning. Icke-specifik färgning bör vara 1+. Om specifik cellmembranfärgning förekommer på objektglasen med negativ kontrollvävnad bör resultat från patientprov anses ogiltiga. Stark positiv färgning bör upptäckas i portioner av kryptepitelceller och svag till måttlig färgning av follikulära makrofager i germinalcentren. Negativ färgning bör uppträda i endoteler, fibroblaster samt ytepiteler. Avsaknad av cellmembranfärgning verifierar den specifika märkningen från målantigenen av den primära antikroppen. Icke-specifik färgning bör vara 1+. Intensiteten av positiv färgning ska bedömas med hänsyn till eventuell ickespecifik färgning som observerats på patientens objektglas med Negative Control Reagent i samma körning. Liksom för alla immunhistokemiska tester betyder ett negativt resultat att antigenen inte upptäcktes, och inte nödvändigtvis att antigenen inte fanns i de celler eller den vävnad som analyserades. Alla livsdugliga tumörceller på hela det PD-L1-färgade patientobjektglaset måste utvärderas och inkluderas i poängutvärderingen för PD-L1. Minst 100 livsdugliga tumörceller måste finnas för att provet ska anses vara adekvat för PD-L1-utvärdering. I avsnitt 13 finns vägledning om tolkning av poängsättning avseende PD-L1-uttryck. 15. Allmänna begränsningar 1) Immunhistokemi är en diagnostisk process i flera steg som kräver specialistutbildning för val av lämpliga reagens, vävnadsurval, fixering, bearbetning och beredning av IHC-objektglasen och tolkning av färgningsresultaten. 2) Vävnadsfärgning är beroende av hantering och bearbetning av vävnaden före färgning. Felaktig fixering, nedfrysning, upptining, tvättning, torkning, uppvärmning, snittning eller kontaminering med andra vävnader eller vätskor kan orsaka artefakter, antikroppsinfångning eller falskt negativa resultat. Inkonsekventa resultat kan bero på variationer i fixerings- och inbäddningsmetoder, eller på naturliga oregelbundenheter i vävnaden. 3) Överflödig eller ofullständig kontrastfärgning kan leda till inkorrekt tolkning av resultaten. 4) Den kliniska tolkningen av positiv färgning eller avsaknad därav måste utvärderas med hänsyn till klinisk presentation, morfologi och andra histopatologiska kriterier. Den kliniska tolkningen av färgning eller avsaknad därav måste kompletteras av morfologiska undersökningar eller korrekta kontroller samt andra diagnostiska tester. En kvalificerad patolog som är förtrogen med antikropparna, reagensen och metoderna som används måste ta ansvar för tolkningen av det färgade preparatet. Färgning måste utföras i ett auktoriserat laboratorium under överinseende av en patolog som ansvarar för att granska de färgade objektglasen och för att se till att positiva och negativa kontroller är korrekta. 5) Vävnader från personer infekterade med hepatit B-virus och med hepatit B-ytantigen (HBsAg) kan uppvisa icke-specifik färgning med pepparrotsperoxidas (8). 6) Reagens kan uppvisa oväntade reaktioner i tidigare otestade vävnadstyper. Sannolikheten för oväntade reaktioner även i testade vävnadstyper kan inte fullständigt elimineras på grund av biologisk variation av antigenuttryck i neoplasma eller andra patologiska vävnader. Kontakta Dakos tekniska support med dokumenterade oväntade reaktioner. 7) Falskt positiva resultat kan uppstå på grund av icke-immunologisk bindning av proteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan även orsakas av pseudoperoxidas aktivitet (erytrocyter) och endogen peroxidasaktivitet (cytokrom C) (8). 8) De reagens och instruktioner som medföljer det här systemet har utformats för bästa möjliga resultat. Ytterligare spädning av reagens eller ändring av inkuberingstider eller temperaturer kan ge felaktiga eller motstridiga resultat. P03928SE_05/SK00621-2/2017.02 s. 9/19

16. Produktspecifika begränsningar 1) Falskt negativa resultat kan orsakas av försämring av antigenet i vävnaderna med tiden. Prover ska färgas inom den rekommenderade förvaringstiden för skurna snitt (se avsnitt 8.2). 2) För optimala och reproducerbara resultat kräver PD-L1-proteinet förbehandling med målåtervinning när vävnaderna är rutinfixerade (neutralbuffrat formalin) och paraffininbäddade. 3) Ersätt inte reagens från olika lotnummer från den här produkten eller från satser från andra tillverkare. Det enda undantaget är EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph 50x, som vid behov finns tillgängligt som kod K8005. 4) Färgade kontrollcellinjer ska endast användas för validering av färgningskörningen och inte användas för att poängsätta färgreaktionen i vävnadssnitt. 5) Användning av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx på vävnad med andra fixeringsmedel än formalin har inte verifierats. 6) Användningen av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx i finnålsaspirat har inte validerats. 7) Användning av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx på avkalkade vävnader har inte validerats och rekommenderas inte. 17. Prestandautvärdering 17.1 Icke-klinisk prestandautvärdering: Normala och neoplastiska vävnader Normala vävnader: Tabell 2 sammanfattar immunreaktiviteten från Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 på den rekommenderade panelen med normala vävnader. Plasmamembranfärgning observerades på immunceller och celler av epiteliskt ursprung. Cytoplasmisk färgning noteras i vissa celltyper men registrerades inte som positiv färgning. Alla vävnader formalinfixerades och paraffininbäddades samt färgades med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx enligt instruktionerna i produktbladet. Inga oväntade resultat observerades i de testade celltyperna eller vävnadstyperna. Den observerade färgningen stämde överens med rapporterad litteratur för PD-L1 IHC-uttryck i normala vävnader (9, 10). Tabell 2: Sammanfattning av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx normal vävnadsreaktivitet Vävnadstyp (antal testade) Positiv plasmamembranfärgning: Vävnadselement Positiv cytoplasmatisk färgning: Vävnadselement Icke-specifik färgning Benmärg (3) 3/3 Megakaryocyter 3/3 Megakaryocyter 0/3 Binjure (3) 0/3 1/3 Medullära celler 0/3 Bisköldkörtel (3) 1/3 Körtelepitel 0/3 0/3 Bröst (3) 0/3 0/3 0/3 Bukspottkörtel (3) 0/3 0/3 0/3 Cerebellum (3) 0/3 0/3 0/3 Cerebrum (3) 0/3 0/3 0/3 Cervix (3) 1/3 Epitel 0/3 0/3 Esofagus (3) 0/3 0/3 0/3 Hud (3) 0/3 0/3 0/3 Hypofys (3) 1/3 Anterior hypofys 1/3 Anterior hypofys 0/3 1/3 Posterior hypofys 1/3 Posterior hypofys Lever (3) 1/3 Makrofager 0/3 0/3 1/3 Heptatocyter Livmoder (3) 0/3 0/3 0/3 Lunga (3) 3/3 Alveolära makrofager 0/3 0/3 Mage (3) 2/3 Lymfocyter 1/3 Magkörtlar 0/3 1/3 Magkörtlar Mesotelceller (2) 0/2 0/2 0/2 Mjälte (3) 2/3 Makrofager 0/3 0/3 Muskel, hjärta (3) 0/3 0/3 0/3 Muskel, skelett (3) 0/2 0/2 0/2 Nerv, perifer (3) 0/3 1/3 Bindväv/kärl 0/3 Njure (3) 1/3 Tubulär epitel 0/3 0/3 Prostata (2) 2/2 Epitel 0/2 0/2 Sköldkörtel (3) 0/3 0/3 0/3 Spottkörtel (3) 0/3 0/3 0/3 Testikel (3) 0/3 0/3 0/3 Tjocktarm (3) 2/3 Makrofager 0/3 0/3 Tonsill (3) 3/3 Kryptepitel 0/3 0/3 2/3 Germinalcentrum (makrofager) Tunntarm (3) 0/3 0/3 0/3 Tymus (3) 3/3 Medullär epitel 0/3 0/3 Äggstock (3) 0/3 0/3 0/3 Neoplastiska vävnader: Tabell 3 sammanfattar immunreaktiviteten från Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 på en panel med neoplastiska vävnader. Plasmamembranfärgning observerades på immunceller och celler av epiteliskt ursprung. Cytoplasmisk färgning noteras i vissa celltyper men registrerades inte som positiv färgning. Alla vävnader formalinfixerades och paraffininbäddades samt färgades med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx enligt instruktionerna i produktbladet. Inga oväntade resultat observerades i de testade tumörproverna. Den observerade färgningen stämde överens med rapporterad litteratur för PD-L1 IHCuttryck i neoplastisk vävnad (9 12). Tabell 3: Sammanfattning av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx neoplastisk vävnadsreaktivitet Tumörtyp Placering PD-L1 positiv/total (N=159) Appendix 0/1 Bröst, DCIS 0/2 Bröst, invasiv duktal 0/7 Adenokarcinom Bröst, invasiv duktal metastasering till lymfkörtlar 0/1 Bukspottkörtel 0/2 Bukspottkörtel, duktal 0/3 P03928SE_05/SK00621-2/2017.02 s. 10/19

Tumörtyp Placering PD-L1 positiv/total (N=159) Cervix, endocervikal typ 0/1 Esofagus 0/1 Gallblåsa 1/5 GI, metastasering till lunga 0/1 Huvud och hals, hårda gommen 0/1 Kolon 0/5 Livmoder, endometrium 0/3 Livmoder, klarcell 0/1 Lunga 1/4 Mage, mucinös 0/1 Magsäck 0/6 Prostata 0/5 Sköldkörtel, follikulär 0/1 Sköldkörtel, follikulär-papillär 0/1 Sköldkörtel, papillär 0/3 Spottkörtel/öronspottkörtel 0/2 Tjocktarm, metastasering till lever 0/1 Tjocktarm, mucinös 0/1 Tunntarm 0/2 Äggstock 0/1 Äggstock, endometrioid 0/1 Äggstock, mucinös 0/1 Äggstock, serös 0/1 Ändtarm 0/4 Adrenokortikalt karcinom Binjure 0/1 Astrocytom Cerebrum 0/3 Basalcellskarcinom Hud 0/1 Embryonalt karcinom Testikel 0/1 Ependymom Hjärna 0/1 Feokromocytom Binjure 0/1 Glioblastom Hjärna 0/1 Hepatoblastom Lever 0/1 Hepatocellulärt karcinom Lever 0/5 Kolon 0/1 Interstitialom Tunntarm 0/1 Ändtarm 0/1 Karcinom Öron, näsa, hals 0/1 Kondrosarkom Ben 0/1 Kordom Bäckenhåla 0/1 Leiomyosarkom Mjuk vävnad, bröstvägg 0/1 Urinblåsa 0/1 Lymfom Anaplastisk stor cell Lymfkörtel 0/1 Diffus B-cell Lymfkörtel 0/4 Hodgkin Lymfkörtel 2/2 Icke-Hodgkin Lymfkörtel 1/1 Medulloblastom Hjärna 0/1 Medullärt karcinom Sköldkörtel 0/1 Melanom Näshåla 0/1 Ändtarm 0/1 Meningiom Hjärna 0/2 Mesoteliom Peritoneum 0/1 Neuroblastom Retroperitoneum 0/1 Neurofibrom Mjuk vävnad, ländryggen 0/1 Njurcellskarcinom Klarcell Njure 0/6 Papillär Njure 0/1 Osteosarkom Ben 0/2 Primitiv neuroektodermal tumör (PNET) Retroperitoneum 0/1 Mjuk vävnad, embryonal 0/1 Rabdomyosarkom Prostata 0/1 Retroperitoneum 0/1 Seminom Testikel 0/2 Kolon 0/1 Signetringcellskarcinom Metastatiskt tjocktarmssignetringcellskarcinom till 0/1 äggstock Cervix 2/5 Esofagus 0/7 Hud 0/2 Skivepitelcellskarcinom Huvud och hals 0/2 Livmoder 0/1 Lunga 1/2 Metastatisk esofagal skvamöscellskarcinom till lymfkörtel 0/1 P03928SE_05/SK00621-2/2017.02 s. 11/19

Tumörtyp Placering PD-L1 positiv/total (N=159) Småcelligt karcinom Lunga 0/1 Spermatocytom Testikel 0/2 Synovialsarkom Bäckenhåla 0/1 Tymom Mediastinum 1/1 Ö-cellstumör Bukspottkörtel 0/1 Övergångsepitelkarcinom Njure 0/1 Urinblåsa 0/6 17.2 Klinisk prestandautvärdering: NSCLC KEYNOTE-024: Kontrollerad prövning av behandlingsnaiva NSCLC-patienter Säkerheten och effektiviteten av pembrolizumab undersöktes i KEYNOTE-024, en kontrollerad multicenterstudie för behandling av tidigare obehandlad metastatisk NSCLC. Patienterna hade PD-L1-uttryck med 50 % tumörproportionspoäng (Tumor Proportion Score, TPS) baserat på PD-L1 IHC 22C3 pharmdx (14). Patienterna randomiserades (1:1) till att få 200 mg pembrolizumab var 3:e vecka (n = 154) eller analytikerns val av platinainnehållande kemoterapi (n = 151, däribland pemetrexed + karboplatin, pemetrexed + cisplatin, gemcitabin + cisplatin, gemcitabin + karboplatin eller paklitaxel + karboplatin. Icke-skvamösa patienter kunde få underhållsbehandling med pemetrexed). Patienterna behandlades med pembrolizumab tills oacceptabel toxicitet eller sjukdomsprogression inträdde. Behandlingen kunde fortsätta efter sjukdomsprogression om patienten var kliniskt stabil och ansågs dra klinisk nytta enligt analytikern. Från studien exkluderades patienter med EGFR- eller ALK-genoma tumöravvikelser, autoimmun sjukdom som krävde systemisk behandling inom 2 år före eller efter behandlingen, ett medicinskt tillstånd som krävde immunsuppression eller som hade fått mer än 30 Gy bröststrålning under de senaste 26 veckorna. Bedömning av tumörstatus utfördes var 9:e vecka. Kemoterapipatienter som upplevde oberoende verifierad sjukdomsprogression fick överföras till en behandlingsregim med pembrolizumab. Bland de 305 patienterna i KEYNOTE-024 var baslinjedata: medianålder 65 år (54 % var 65 år eller äldre), 61 % var män, 82 % var vita och 15 % var asiater. ECOG-prestandastatus var 0 och 1 för 35 % respektive 65 %. Sjukdomskarakteristika var skvamös (18 %) och icke-skvamös (82 %), M1 (99 %) och hjärnmetastaser (9 %). Det primära effektmåttet var progressionsfri överlevnad (PFS) enligt blindad, oberoende central granskning (BICR) med hjälp av Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, version 1.1 (RECIST 1.1). Sekundära effektmått var total överlevnad (OS) och objektiv responsfrekvens (ORR) enligt BICR med hjälp av RECIST 1.1. Tabell 4 sammanfattar de viktigaste effektåtgärderna för hela ITT-populationen (intent to treat). Tabell 4: Effektivitetsresultat i KEYNOTE-024 Ändpunkt KEYTRUDA 200 mg var 3:e vecka n=154 Kemoterapi n=151 PFS* Antal (%) patienter med händelse 73 (47 %) 116 (77 %) Riskförhållande (95 % CI) 0,50 (0,37, 0,68) --- p-värde < 0,001 --- Medianvärde i månader (95 % CI) 10,3 (6,7, e/t) 6,0 (4,2, 6,2) OS Antal (%) patienter med händelse 44 (29 %) 64 (42 %) Riskförhållande (95 % CI) 0,60 (0,41, 0,89) --- p-värde 0,005 --- Medianvärde i månader (95 % CI) Ej uppnått (e/t, e/t) Ej uppnått (9,4, e/t) Objektiv responsfrekvens* ORR % (95 % CI) 45 % (37, 53) 28 % (21, 36) Fullständig respons % 4 % 1 % Partiell respons % 41 % 27 % Responsduration Median i månad (omfång) Ej uppnått (1,9+, 14,5+) % med duration 6 månader 88 % 59 %# 6,3 (2,1+, 12,6+) * Bedömt enligt BICR med hjälp av RECIST 1.1 Riskförhållande (KEYTRUDA jämfört med kemoterapi) baserat på stratifierad Cox proportional hazard-modell Baserat på stratifierat log-ranktest Baserat på patienter med en bästa total respons som bekräftad fullständig eller partiell respons Baserat på Kaplan Meier-metoden, inkluderar 43 patienter med respons under 6 månader eller längre # Baserat på Kaplan Meier-metoden, inkluderar 16 patienter med respons under 6 månader eller längre e/t = ej tillgängligt P03928SE_05/SK00621-2/2017.02 s. 12/19

Figur 1: Kaplan Meier-kurva för total överlevnad i KEYNOTE-024 100 90 80 70 Total överlevnad (%) Overall Survival (%) 60 50 40 30 20 10 Behandling Treatment arm KEYTRUDA Kemoterapi Chemotherapy 0 0 3 6 9 12 15 18 21 Time in Months Antal Number i riskzonen Tid i månader at Risk KEYTRUDA KEYTRUDA: 154 136 121 82 39 11 2 0 Kemoterapi Chemotherapy: 151 123 106 64 34 7 1 0 KEYNOTE-010: Kontrollerad prövning av NSCLC-patienter som tidigare behandlats med kemoterapi Den kliniska fördelen av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx undersöktes i KEYNOTE-010, en oblindad, randomiserad klinisk multicenterstudie som utfördes för att utvärdera säkerheten och effektiviteten av KEYTRUDA hos patienter med framskriden NSCLC som tidigare behandlats med platinabaserade cellgifter (15). Patienterna hade PD-L1-uttryck med 1 % TPS baserat på en CTA-version (clinical trial assay) av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Patienter med aktiverad mutation i EGFR eller ALK-translokation hade sjukdomsprogression också med godkänd behandling mot dessa mutationer innan de fick pembrolizumab. Patienterna randomiserades (1:1:1) till att få 2 (n=344) eller 10 mg/kg (n=346) pembrolizumab var 3:e vecka eller 75 mg/m 2 (n=343) docetaxel var 3:e vecka tills oacceptabel toxicitet eller sjukdomsprogression inträdde. Från prövningen exkluderades patienter med autoimmun sjukdom, ett medicinskt tillstånd som krävde immunsuppression eller som hade fått mer än 30 Gy bröststrålning under de senaste 26 veckorna. Bedömning av tumörstatus utfördes var 9:e vecka. De primära effektmåtten var OS och PFS bedömda enligt BICR med hjälp av RECIST 1.1. Baserat på CTA deltog totalt 1 033 NSCLC-patienter i studien. För att utvärdera den kliniska användbarheten av PD-L1 IHC 22C3 pharmdx testades arkiverade kliniska prover retrospektivt i ett referenslaboratorium i USA med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Av de 1 033 patienterna testades tumörvävnad från 529 patienter retrospektivt med testet PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Vävnadsprover från 413 patienter hade PD-L1-uttryck ( 1 % av livsdugliga tumörceller med membranfärgning oberoende av intensitet) och prover från 94 patienter hade PD-L1-uttryck (< 1 % av livsdugliga tumörceller med membranfärgning oberoende av intensitet). Av dessa 413 patienter med PD-L1-uttryck innehöll prover från 163 patienter höga PD-L1-uttryck ( 50 % av livsdugliga tumörceller med membranfärgning oberoende av intensitet). Överensstämmelsen mellan CTA och PD-L1 IHC 22C3 pharmdx visas i tabell 5. Tabell 5: CTA kontra PD-L1 IHC 22C3 pharmdx överensstämmelse Överensstämmelsevärden PD-L1 Tröskelvärde Procentuell negativ överensstämmelse (95 % konfidensintervall (CI)) CTA kontra PD-L1 IHC 22C3 Procentuell positiv överensstämmelse (95 % konfidensintervall (CI)) TPS 1 % 94,5 % (91,4 96,6 %) 80,0 % (76,9 82,8 %) pharmdx TPS 50 % 98,3 % (97,1 99,0 %) 73,2 % (67,9 77,9 %) Bland randomiserade patienter med PD-L1-uttryck enligt PD-L1 IHC 22C3 pharmdx var demografi och andra baslinjedata väl balanserade mellan behandlingsarmarna. Medianåldern var 63 år (44 % var 65 år eller mer). Merparten av patienterna var vita (77 %) och män (58 %). ECOG-prestandastatus vid baslinjen var 0 (29 %) eller 1 (71 %). 78 % av patienterna var tidigare/nuvarande rökare. 22 % av patienterna hade skvamös histologi, och 69 % hade icke-skvamös histologi. Baslinjen och de demografiska egenskaperna var också väl balanserade mellan pembrolizumab- och docetaxelarmarna i den totala kliniska studien. Effektresultaten sammanfattas i tabellerna 6 och 7. KEYTRUDA uppvisade långvariga kliniska fördelar hos NSCLC-patienter med PD-L1-uttryck (TPS 1 %), vilket förstärktes hos patienter med högt PD-L1-uttryck (TPS 50 %), enligt bestämning med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Fördelarnas omfattning var jämförbar med den i den totala kliniska prövningen. Tabellerna nedan sammanfattar viktiga effektmått i den totala populationen med PD-L1-uttryck (TPS 1 %) och i delmängden med högt PD-L1-uttryck (TPS 50 %) för den totala kliniska studien (TPS 1 % med CTA) och i populationen med PD-L1-uttryck enligt PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Kaplan Meier-kurva för OS (TPS 1 %), enligt bestämning med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx) visas i figur 2. Effektresultaten var likartade för KEYTRUDA-armarna 2 mg/kg och 10 mg/kg. P03928SE_05/SK00621-2/2017.02 s. 13/19

Tabell 6: Behandlingssvar på KEYTRUDA hos tidigare behandlade NSCLC-patienter: Övergripande klinisk studie och PD- L1 IHC 22C3 pharmdx-positiva patienter: PD-L1 TPS 1 % Ändpunkt KEYTRUDA KEYTRUDA Docetaxel 2 mg/kg var 3:e vecka 10 mg/kg var 3:e vecka 75 mg/m 2 var 3:e vecka Klinisk prövning PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Klinisk prövning PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Klinisk prövning PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Antal patienter 344 140 346 142 343 131 OS Dödsfall (%) 172 (50 %) 59 (42 %) 156 (45 %) 59 (42 %) 193 (56 %) 67 (51 %) Riskförhållande* 0,71 0,54 0,61 0,57 (95 % CI) (0,58, 0,88) (0,37, 0,78) (0,49, 0,75) (0,39, 0,82) --- --- p-värde < 0,001 < 0,001 < 0,001 0,00115 --- --- Medianvärde i månader (95 % CI) 10,4 (9,4, 11,9) 11,8 (9,6, e/t) 12,7 (10,0, 17,3) 12,0 (8,7, e/t) 8,5 (7,5, 9,8) 7,5 (6,3, 9,9) PFS Händelser (%) 266 (77 %) 97 (63 %) 255 (74 %) 103 (73 %) 257 (75 %) 94 (72 %) Riskförhållande* 0,88 0,68 0,79 0,79 (95 % CI) (0,73, 1,04) (0,50, 0,92) (0,66, 0,94) (0,59, 1,06) --- --- p-värde 0,068 0,00578 0,005 0,05767 --- --- Medianvärde i månader (95 % CI) 3,9 (3,1, 4,1) 4,9 (4,1, 6,2) 4,0 (2,6, 4,3) 4,0 (2,2, 4,6) 4,0 (3,1, 4,2) 3,8 (2,2, 4,2) Total responsfrekvens ORR % 18 % 24 % 18 % 20 % 9 % 5 % (95 % CI) (14, 23) (17, 32) (15, 23) (14, 28) (7, 13) (2, 11) * Riskförhållande (KEYTRUDA jämfört med docetaxel) baserat på stratifierad Cox proportional hazard-modell Baserat på stratifierat log-ranktest Bedömt enligt BICR med hjälp av RECIST 1.1. Alla respondenter hade en partiell respons Tabell 7: Behandlingssvar på KEYTRUDA hos tidigare behandlade NSCLC-patienter: Övergripande klinisk studie och PD- L1 IHC 22C3 pharmdx-positiva patienter: PD-L1 TPS 50 % Ändpunkt KEYTRUDA KEYTRUDA Docetaxel 2 mg/kg var 3:e vecka 10 mg/kg var 3:e vecka 75 mg/m 2 var 3:e vecka Klinisk prövning PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Klinisk prövning PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Klinisk prövning PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Antal patienter 139 56 151 60 152 47 OS Dödsfall (%) 58 (42 %) 18 (32 %) 60 (40 %) 19 (32 %) 86 (57 %) 25 (53 %) Riskförhållande* (95 % CI) 0,54 (0,38, 0,77) 0,45 (0,24, 0,84) 0,50 (0,36, 0,70) 0,29 (0,15, 0,56) --- --- p-värde < 0,001 0,00541 < 0,001 < 0,001 --- --- Medianvärde i månader (95 % CI) PFS 14,9 (10,4, e/t) Ej uppnått (9,3, e/t) 17,3 (11,8, e/t) Ej uppnått (8,3, e/t) 8,2 (6,4, 10,7) 7,2 (4,4, 8,3) Händelser (%) 89 (64 %) 33 (59 %) 97 (64 %) 34 (57 %) 118 (78 %) 33 (70 %) Riskförhållande* (95 % CI) 0,58 (0,43, 0,77) 0,47 (0,28, 0,80) 0,59 (0,45, 0,78) 0,41 (0,24, 0,70) --- --- p-värde < 0,001 0,00221 < 0,001 < 0,001 --- --- Medianvärde i månader (95 % CI) 5,2 (4,0, 6,5) 5,9 (4,2, 9,0) 5,2 (4,1, 8,1) 4,8 (2,8, e/t) 4,1 (3,6, 4,3) 3,9 (2,0, 4,3) Total responsfrekvens ORR % 30 % 37 % 29 % 28 % 8 % 4 % (95 % CI) (23, 39) (25, 52) (22, 37) (18, 41) (4, 13) (1, 15) * Riskförhållande (KEYTRUDA jämfört med docetaxel) baserat på stratifierad Cox proportional hazard-modell Baserat på stratifierat log-ranktest Bedömt enligt BICR med hjälp av RECIST 1.1. Alla respondenter hade en partiell respons P03928SE_05/SK00621-2/2017.02 s. 14/19