PLATELIA TM TOXO IgG TMB 96 TESTER 72741

PLATELIA TM TOXO IgG TMB 96 TESTER 72741 KIT FÖR KVALITATIV/KVANTITATIV DETEKTION AV ANTIKROPPAR MOT TOXOPLASMA GONDII IgG I HUMANT SERUM ELLER PLASMA GENOM IMMUNOLOGISK ENZYMANALYS IVD För in vitro-diagnostik Alla reagens tillverkas och marknadsförs i enlighet med ett fullständigt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till slutlig marknadsföring av produkt. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer med acceptanskriterierna. Handlingar som hör samman med produktion och kontroll av varje enskilt parti sparas inom vårt företag.

INNEHÅLLSFÖRTECKNING 1 ANVÄNDNINGSOMRÅDE...............................123 2 KLINISK BETYDELSE....................................123 3 TESTPRINCIP.........................................124 4 INNEHÅLL..........................................124 5 FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER OCH VARNINGAR................126 6 NÖDVÄNDIG MEN EJ BIFOGAD MATERIAL..................128 7 BEREDNING OCH FÖRVARING AV REAGENS................129 8 PROVER............................................130 9 TESTFÖRFARANDE.....................................130 10 BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTAT...............132 11 TESTRESULTAT OCH BEGRÄNSNINGAR.....................134 12 REFERENSER.........................................138 122

1 ANVÄNDNINGSOMRÅDE Platelia TM Toxo IgG TMB är ett in vitro-diagnostiskt testkit för kvalitativ och kvantitativ bestämning av antikroppar mot Toxoplasma gondii IgG i humant serum eller plasma. 2 KLINISK BETYDELSE T. gondii är en protozo som orsakar infektion hos många olika arter av däggdjur och fåglar. Toxoplasmos, som ofta förekommer hos människa och djur, är oftast en tyst infektion. Prevalensen för denna infektion har fastställts genom serologiska tester och kan variera inom en population beroende på ursprungsland och demografi. Toxoplasmos under graviditet förknippas med allvarliga medfödda abnormiteter (i synnerhet nedsatt hjärnfunktion) och ibland dödfödsel. Påvisande av Toxo IgG-antikropp hos kvinnor före konception tillförsäkrar att fostret skyddas mot möjlig toxoplasmos under graviditeten. Det är vanligt att personer som har drabbats av förvärvat immunbristsyndrom (aids) eller personer som av annan anledning har nedsatt immunförsvar är mottagliga för allvarlig toxoplasmosinfektion. Dessa infektioner beror huvudsakligen på en reaktivering av T. gondii-cystor som förekommit redan före HIV-infektionen. Det kan vara komplicerat att ställa en specifik diagnos på T. gondii-infektion och det är sällsynt att parasiten kan isoleras. Serologisk konfirmation av T. gondii-antikroppar tyder på exponering för parasiten och har blivit en allmänt accepterad metod för att bestämma immunstatus och infektionsbenägenhet. Screening av flera isotyper gör det möjligt att datera T. gondii och sätta in lämplig behandling vid en aktuell infektion eller ge profylaktiska rekommendationer som till exempel anvisningar om hygien/kost till gravida kvinnor eller kemoprofylax till immunosupprimerade personer. 123

3 TESTPRINCIP Testet använder en immunologisk enzymanalysteknik med fast fas som kallas indirekt ELISA. Det T. gondii-antigen som mikroplattan coatas med,härstammar från ultraljudsbehandlad tachyzoit som anrikats med membranproteiner. Konjugatet består av en peroxidasmärkt monoklonal antikropp, specifik för humana gammakedjor (IgG). Steg ett Spädda prover pipetteras i brunnar, coatade med T. gondii-antigen på mikroplattan. Under inkubering i en timme vid 37 C binder T. gondiiantikroppar i provet till brunnarna, coatade med T. gondii-antigen på mikroplattan. Efter inkubering tas obundna antikroppar och serumproteiner bort genom tvätt. Steg två Konjugat (peroxidasmärkt monoklonal antikropp, specifik för humana gammakedjor) tillsätts i mikroplattans brunnar. Under en andra inkubering:en timme vid 37 C binder den märkta monoklonala antikroppen till IgG antikropps-t. gondii-antigen-komplexen som är bundna till mikroplattans brunnar. Obundet konjugat avlägsnas genom tvätt. Steg tre Förekomsten av immunkomplex (T. gondii Ag, anti-t. gondii IgG, anti IgG konjugat) påvisas genom tillsats av en lösning, innehållande peroxidassubstrat och kromogen, vilket initierar en framkallningsreaktion. Steg fyra Efter 30 minuters inkubering i rumstemperatur,stoppas den enzymatiska reaktionen genom tillsats av syra, H 2 SO 4 1N. Den optiska densiteten, som avläses med hjälp av en spektrofotometer inställd på 450/620 nm, är proportionell mot mängden T. gondii IgG-antikroppar i provet. Värdet omvandlas till IU/mL med hjälp av en standardkurva. Serumkalibratorerna (R4a, R4b, R4c) är kalibrerade mot WHO:s standard (TOXM 185). 4 INNEHÅLL Alla reagens som ingår i testet är enbart avsedda för in vitro-diagnostiskt bruk. 124

Märk-ning Typ av reagens Innehåll R1 Microplate Mikroplatta: 12 remsor med vardera 8 brytbara 1 platta brunnar, coatade med T.gondii-antigen (RH-stam). R2 Concentrated Koncentrerad tvättlösning (10x): 1 flaska Washing RIS-NaCl-buffert ph 7,4, 1 % Tween 20. 100 ml Solution Konserveringsmedel: 0,01 % thimerosal. R3 Calibrator 0 Kalibrator 0: Humant serum icke-reaktivt för anti-t. 1 flaska gondii antikroppar och icke-reaktivt för hepatit B-ytantigen 1ml (HBs Ag), antikroppar mot humant immunbristvirus (HIV1- HIV2) och antikroppar mot hepatit C (HCV). Konserveringsmedel: <0,01 % thimerosal R4a Calibrator 6 Kalibrator 6 IU/ml: TRIS-NaCl-buffert (ph 8 ± 0,2), humant 1 flaska serum reaktivt för antikroppar mot anti-t. gondii och icke-reaktivt för 1 ml hepatit B-ytantigen (HBs Ag), antikroppar mot humant immunbristvirus (HIV1-HIV2) och antikroppar mot hepatit C (HCV), bovint serumalbumin, glycerol E 102 och E 122. Konserveringsmedel: <0,01 % thimerosal och <0,5 % Proclin 300. R4b Calibrator 60 Kalibrator 60 IU/ml: TRIS-NaCl-buffert (ph 8 ±0,2), humant 1 flaska serum reaktivt för antikroppar mot anti-t. gondii och icke-reaktivt för 1 ml hepatit B-ytantigen (HBs Ag), antikroppar mot humant immunbristvirus (HIV1-HIV2) och antikroppar mot hepatit C (HCV), bovint serumalbumin, glycerol, E 102 och E 122. Konserveringsmedel: <0,01 % thimerosal och <0,5 % Proclin 300. R4c Calibrator 240 Kalibrator 240 IU/ml: TRIS-NaCl-buffert (ph 8 ± 0,2), humant 1 flaska serum reaktivt för antikroppar mot anti-t. gondii och icke-reaktivt för 1 ml hepatit B-ytantigen (HBs Ag), antikroppar mot humant immunbristvirus (HIV1-HIV2) och antikroppar mot hepatit C (HCV), bovint serumalbumin, glycerol, E102 och E122. Konserveringsmedel: <0,01 % thimerosal och <0,5% Proclin 300. R6 Conjugate Konjugat: Murin monoklonal antikropp mot humana gammakedjor 1 flaska (50x) (IgG) märkt med pepparrotsperoxidas; koncentrerad (50x). 0,6 ml R7 Diluent Prov- eller konjugat-spädningsvätska: 2 flaskor TRIS-NaCl-buffert (ph 7,7 ±0,15), bovint serumalbumin, 80 ml 0,1% Tween 20 och fenolrött. Konserveringsmedel: <0,01 % thimerosal. R8 TMB Substratbuffert: 1 flaska Substrate Citronsyra- och natriumacetatlösning ph 4,0, innehållande 60 ml Buffer 0,015 % H 2 O 2 och 4 % DMSO. R9 Chromogen: Kromogen: 1 flaska TMB Solution Lösning innehållande tetrametylbensidin (TMB). 5 ml R10 Stopping Stopplösning: 1 flaska Solution 1N svavelsyralösning 28 ml Självhäftande film 4 125

5 FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER OCH VARNINGAR Försiktighetsåtgärder Resultatens kvalitet är beroende av att god laboratoriesed (GLP) tillämpas: Använd ej reagens efter passerat bäst före-datum. Blanda ej reagens från olika partier inom en bestämd testkörning. Obs! Du kan använda andra partier än de som ingår i testet om samma parti används inom en viss testkörning: tvättlösning (R2, 10x blåfärgad), substratbuffert (R8,TMB buf. blåfärgad), kromogen (R9, TMB sol.grönfärgad) och stopplösning (R10, 1N rödfärgad). Dessa reagens kan användas tillsammans med vissa andra av våra produkter. Kontakta vår avdelning för teknisk service för mer information. Låt alla reagens anta rumstemperatur under ca 30 minuter före användning. Rekonstituera noggrant alla reagens och undvik kontamination. Utför ej testet i närvaro av reaktiva ångor (syraångor, alkaliska ångor, aldehydångor) eller damm som skulle kunna ändra konjugatets enzymatiska aktivitet. Använd glasvaror som noggrant har diskats och sköljts med avjoniserat vatten, eller ännu hellre, engångsmateriel. Se till att mikroplattan ej hinner torka mellan tvättprocedur och reagenstillsats. Den enzymatiska reaktionen är mycket känslig för metalljoner. Därför får ingen metall komma i kontakt med de olika konjugat- eller substratlösningarna. Framkallningslösningen (substratbuffert och kromogen) måste vara färglös. Om en blå färg framträder inom några minuter efter rekonstitueringen är detta en indikation på att reagenset inte kan användas och måste ersättas. Denna lösning kan beredas i rena engångstråg av plast eller i glasbehållare som först har tvättats med 1N HCl och därefter sköljts noggrant med destillerat vatten och torkats. Förvara lösningen i mörker. Använd en ny pipettspets för varje prov. Tvätt av mikroplattan är ett kritiskt steg i detta förfarande. Följ det rekommenderade antalet tvättcykler och se till att alla brunnar är helt fyllda och därefter helt tömda. Felaktig tvätt kan leda till felaktiga resultat. 126

Använd aldrig samma behållare för fördelning av konjugat- och framkallningslösning. Kontrollera noggrannheten för pipetter och annan utrustning och att de fungerar korrekt. Ändra ej i testförfarandet. HÄLSO- OCH SÄKERHETSANVISNINGAR Alla reagens i kitet är avsedda för in vitro-diagnostik. Använd engångshandskar vid reagenshantering. Munpipettera ej! Material av humant ursprung som använts vid reagensberedning har testats och befunnits icke-reaktivt för hepatit B-ytantigen (HBsAg), antikroppar mot hepatit C-virus (HCV) och antikroppar mot humant immunbristvirus (anti-hiv1 och anti-hiv2). Eftersom ingen testmetod med säkerhet kan garantera frånvaron av smittsamma ämnen, ska reagens av humant ursprung och patientprover hanteras som potentiellt smittsamma. Betrakta allt material som har varit i direkt kontakt med prover och reagens av humant ursprung, liksom tvättlösningar, som smittfarligt material. Undvik spill! Spill måste sköljas med blekmedel som spätts till 10 %. Om den smittfarliga lösningen är en syra måste spill först neutraliseras med natriumbikarbonat och därefter renas med blekmedel och torkas upp med absorberande papper. Material som används för rengöring kastas i en behållare för smittfarligt avfall. Prover, reagens av humant ursprung,liksom smittfarligt material och smittfarliga produkter måste omhändertas efter sanering enligt följande: - antingen sänkas ned i blekmedel vid en slutlig koncentration på 5 % natriumhypoklorid i 30 minuter - eller autoklaveras vid 121 C i minst 2 timmar. Autoklavering i minst en timme i 121 C är den bästa metoden för att inaktivera HIV-virus och HB-virus. 127

VARNING! STÄLL INGA LÖSNINGAR INNEHÅLLANDE NATRIUMHYPOKLORID I AUTOKLAVEN. VARNING! Vissa reagens innehåller: * Pro Clin 300 <0,5 %: IRRITERANDE R43: Kan ge allergi vid hudkontakt. S28/37: Vid hudkontakt tvätta genast med mycket tvål och vatten. Xi-irriterande Använd lämpliga skyddshandskar. Hantering och avlägsnande av kemiska produkter ska genomföras enligt rutiner för god laboratoriesed (GLP). Undvik all hud- och slemhinnekontakt med substratbuffert, kromogen eller stopplösning (risk för förgiftning, irritation eller brännskador). Ett säkerhetsdatablad kan erhållas på begäran. 6 - NÖDVÄNDIG MEN EJ BIFOGAD MATERIAL Vortexmixer. Avläsare för mikroplattor med 450 nm och 620 nm filter (*). Vattenbad eller motsvarande inkubator för mikroplattor, termostatreglerad för 37±1 C (*). Behållare för smittförande avfall. Natriumhypoklorid (blekmedel) och natriumbikarbonat. Destillerat eller avjoniserat vatten. Graderade mätglas med volymerna 25, 50, 100 och 1 000 ml. Engångs Latexhandskar. Skyddsglasögon. Absorberande papper. Automatiska eller halvautomatiska, justerbara eller förinställda pipetter eller multipipetter för mätning och fördelning av 10 till 1 000 µl respektive 1, 2 och 10 ml. Manuell, halvautomatisk eller automatisk tvättanordning för mikroplattor (*). Engångsrör. (*) Begär gärna mer information om utrustning som vår tekniska avdelning rekommenderar. 128

7 BEREDNING OCH FÖRVARING AV REAGENS Kit ska förvaras vid +2 8 C och är då hållbart till det utgångsdatum som anges på förpackningen. Obs! Låt reagenserna uppnå rumstemperatur (+18 30 C) före användning. 1) Bruksfärdiga reagens Reagens 1 (R1): mikroplatta Varje platta innehåller 12 remsor med 8 brytbara brunnar och är förpackad i en försluten foliebelagd påse. Klipp upp påsen med en sax eller skär upp den med en skalpell 0,5-1 cm ovanför markering. Lägg omedelbart tillbaka oanvända remsor i påsen. Återförslut påsen noga och förvara den vid +2 8 C. Remsorna är då hållbara i 1 månad. Reagens 3 (R3), reagens 4a (R4a), reagens 4b (R4b), reagens 4c (R4c), reagens 10 (R10): Reagenserna är hållbara till det sista förbrukningsdatum som anges på etiketten om de förvaras vid +2 8 C (gäller även öppnad förpackning). 2) Reagens som ska rekonstitueras Reagens 2 (R2): tvättlösning, koncentrerad 10 x Späd 1:10 med destillerat vatten för färdig brukslösning (R2d). Bered 350 ml för en platta med 12 remsor om tvätt sker manuellt. Kan efter spädning förvaras i 2 veckor vid +2 8 C. Den koncentrerade lösningen kan förvaras vid +2 25 C. Konjugatlösning: reagens 6 (R6) + reagens 7 (R7) Bered konjugatarbetslösning (R6d) till en mikroplatta genom att späda 0,5 ml av 50x konjugatkoncentrat i 25 ml spädningsvätska (R7). Blanda väl. Dela dessa volymer med 10 för att erhålla den volym som behövs för en remsa med 8 brunnar. Använd konjugatarbetslösningen (R6d) inom 60 minuter efter beredning. Enzymatisk framkallningslösning: reagens 8 (R8) + reagens 9 (R9) Späd kromogen (R9) 1:11 med substratbuffert (R8) (t.ex. 1 ml reagens R9 +10 ml reagens R8). Berett reagens kan förvaras mörkt i upp till 6 timmar i rumstemperatur (+18 30 C). 129

8 PROVTAGNING 1. Serum eller plasma (EDTA, citrat eller heparin) är rekommenderade provtyper. 2.Lägg märke till följande rekommendationer gällande hantering, bearbetning och förvaring av blodprover. Ta alla blodprover med venpunktion och vidtag sedvanliga försiktighetsåtgärder. Låt serumprover koagulera fullständigt före centrifugering. Rören ska alltid vara förslutna. Separera serum eller plasma från koagel eller erytrocyter och förvara i väl förslutet rör efter centrifugering. Prover kan förvaras vid +2 8 C om screening sker inom 7 dagar. Om analysen ej slutföres inom 7 dagar, eller vid transport, ska proverna frysas i 20 C eller kallare. Tina prover högst tre gånger. Prover som har varit frysta ska blandas ordentligt innan test utföres. 3. Prover som innehåller upp till 90 g/l albumin, 100 mg/l bilirubin, lipemiska prover som innehåller upp till motsvarande 36 g/l triolein (triglycerid) och hemolyserade prover som innehåller upp till 10 g/l hemoglobin påverkar ej resultaten. 4. Värm ej proverna. 9- TESTFÖRFARANDE Följ noggrant angivet förfarande. Validera testresultaten med hjälp av kalibratorerna för varje serie bestämningar. Tillämpa god laboratoriesed. 1. Fastställ noggrannt provfördelnings- och identifieringsprotokoll. 2. Förbered tvättlösningen (R2d) (se avsnitt 7). 3. Ta ut bricka och remsor (R1) ur skyddsförpackningen. 4. Tvätta brunnarna en gång med tvättlösning (R2d). Vänd mikroplattan upp och ned och slå lätt mot absorberande papper för att ta bort resterande vätska. 5. Späd testserum genom att tillsätta 10 µl prov till 1 ml spädningsvätska (R7). Kalibratorerna 0, 6, 60 och 240 IU/ml (R3, R4a, R4b och R4c) späds på samma sätt så att en spädning på 1/101 erhålls. Blanda spädda prover med vortexmixer. 130

6. Vid manuellt utförande av testet tillsätts 200 µl av spädda kalibratorer och prover i brunnarna enligt nedan. Brunn 1A: 200 µl kalibrator 0 IU/ml (R3) spädd 1/101. Brunn 1B: 200 µl kalibrator 6 IU/ml (R4a) spädd 1/101. Brunn 1C: 200 µl kalibrator 60 IU/ml (R4b) spädd 1/101. Brunn 1D: 200 µl kalibrator 240 IU/ml (R4c) spädd 1/101. Brunn 1E,1F,1G etc.: 200µl prov,spätt 1/101. 7. Täck när det är möjligt mikroplattan med plastfilm. Tryck fast filmen noggrant över hela plattan så att det är tätt. Inkubera mikroplattan i ett termostatkontrollerat vattenbad eller i en inkubator för mikroplatta vid 37±1 C i 1 timme ± 5 minuter. 8.Bered konjugatarbetslösning (R6d) 15 minuter innan den första inkuberingstiden går ut. Till 1 mikroplatta späds 0,5 ml 50x konjugatkoncentrat (R6) ut i 25 ml spädningsvätska (R7). Blanda väl (se avsnitt 7). 9.Ta bort plastfilmen. Aspirera samtliga brunnars innehåll till en behållare för miljöfarligt avfall (innehållande natriumhypoklorid). Tvätta alla brunnar tre gånger med tvättlösningen (R2d). Vänd mikroplattan upp och ned och slå lätt mot ett läskpapper så att eventuell överskottslösning försvinner (se avsnitt 10). 10.Fördela omedelbart 200 µl av konjugatarbetslösningen (R6d) i samtliga brunnar. Lösningen måste skakas varsamt före användning. 11.Täck mikroplattan med plastfilm. Tryck fast filmen ordentligt över hela plattan så att det sluter tätt. Inkubera mikroplattan i ett termostatkontrollerat vattenbad eller i en inkubator för mikroplatta vid 37±1 C i 1 timme ± 5 minuter. 12.Ta bort plastfilmen, töm alla brunnar genom aspirering och tvätta fyra gånger enligt beskrivningen ovan. Vänd mikroplattan upp och ned och slå lätt mot absorberande papper för att ta bort resterande vätska. 13.Tillsätt snabbt 200 µl homogeniserad enzymframkallningslösning (R8 + R9) i varje brunn. Låt reaktionen framkallas i mörker under 30 minuter i rumstemperatur (+18-30 C). Använd ingen självhäftande folie under denna inkubering. 14.Tillsätt 100 µl stopplösning (R10) i samma takt och ordningsföljd som för framkallningslösningen. 131

15.Torka försiktigt av plattans undersida. Avläs optisk densitet vid 450/620 nm med hjälp av en avläsare för mikroplattor inom 30 minuter efter stoppad reaktion (remsorna måste alltid skyddas från ljus före avläsning). 16.Kontrollera för samtliga resultat att mätresultat, platta och protokoll överensstämmer. 10 BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTAT 132 1) Uppgifter för kalibrering Förekomst av och kvantitet IgG-antikroppar mot T.gondii i testprovet bestäms genom att testprovets optiska densitet (OD) jämförs med ett standardintervall. Kalibratorerna 6, 60, 240 UI/ml i kitet är kalibrerade mot WHO:s standardserum (TOX M 185). Vissa skillnader i titer kan dock observeras för samma serum om det testas med olika serologiska metoder. Denna skillnad beror på det faktum att den T. gondii som används för de olika metoderna innehåller löslig membranantigen i varierande proportioner. 2) Kvalitetskontroll Inkludera alla kalibratorerna vid varje analysomgång. För att analysen ska kunna valideras måste följande villkor uppfyllas: Optiska densitetsvärden: - OD R3 0,200 - OD R4c 1,000 Kvot: OD R4a / OD R3 2 Om dessa villkor inte är uppfyllda bör analysen omköras. 3) Fastställande av standardkurva a) Rita standardkurva Vid manuell analys av data: Använd ett millimeterpapper och plotta ODvärden för kalibratorer (R3, R4a, R4b, R4c) på den vertikala axeln (yaxeln). Plotta motsvarande koncentration i IU/mL på den horisontella axeln (x-axeln). Dra en anpassad kurva genom de fyra punkterna. b) Beräkning av koncentration i IU/ml Om OD-värdet för provet ligger inom intervallet för OD R4a och OD R4c letar du upp motsvarande OD-värde för provet på y-axeln. Dra sedan en horisontell linje mot standardkurvan. Dra en vertikal linje ned till x-axeln i den punkt där linjen korsar standardkurvan. Läs av koncentrationen i IU/mL på x-axeln.

Observera: Om OD-värdet för ett prov med en spädning på 1/101 är >OD R4c bör provet spädas 1/1010 med R7 och analysen upprepas. Det beräknade IU/mL-värdet ska därefter multipliceras med 10. 4) Utvärdering av resultat Bestämning av IgG anti-t.gondii med Platelia Toxo IgG TMB visar patientens immunstatus. Titer < 6 IU/mL Icke-signifikant antikroppsnivå med denna metod = ingen immunitet. 6 IU/mL Titer och 9 IU/mL Icke-signifikant antikroppsnivå med denna metod = resultatet från ett enstaka serumprov ger ej tillräckligt bevis för att fastställa patientens immunstatus mot T. gondii. Enligt rekommendationer i Frankrike, ska nya tester utföras på ett andra prov med hjälp av två olika metoder. 9 IU/mL < Titer 240 IU/mL Signifikanta antikroppsnivåer = långvarig immunitet eller tidig fas av serokonversion. Titer > 240 IU/mL Höga antikroppsnivåer = nyligen inträffad serokonversion eller kvardröjande hög immunitetsnivå, vilket observeras hos vissa personer. Begränsningar Diagnos av aktuell parasitinfektion kan endast fastställas med en kombination av kliniska och serologiska data som underlag. Resultatet av ett enstaka serumprov utgör ej tillräckligt bevis för diagnos av en nyligen förvärvad infektion. Endast en markant ökning av anti- T. gondii IgG-antikroppstiter i två serumprov som tagits med minst tre veckors mellanrum och testats vid samma körning kan diagnostiseras som en aktuell infektion, men bör snarare ses som ett tecken på aktuell parasitinfektion. Om T. Gondii IgM-antikroppar återfinns bör detta också utvärderas som en del av serologisk uppföljning av personer med eventuell T. gondii-infektion, då anti-t. Gondii IgG-antikroppar kan uppkomma något senare än anti-t. gondii IgM-antikroppar. 5) Ofta förekommande problem Icke validerade eller icke repeterbara reaktioner orsakas ofta av följande: Bristfällig tvätt av brunnarna. 133

Kontaminering av negativa prov med serum eller plasma med hög antikroppstiter. Kontaminering av framkallningslösning med oxidationsmedel (blekmedel, metalljoner ). Kontaminering av stopplösning. 6) Beräkningsexempel Obs! Följande uppgifter är endast exempel och får ej användas i stället för faktiska resultat. Resultat Brunnens OD Koncentration innehåll (450/620 nm) (IU/ml) R3 (negativ) 0,121 0 R4a 0,615 6 R4b 1,466 60 R4c 2,099 240 Serum 1 ( sp.1/101) 0,108 Negativt Serum 2 ( sp.1/101) 0,675 7 IU/ml Serum 3 ( sp.1/101) 0,808 12 IU/ml Serum 4 ( sp.1/101) 2,080 231 IU/ml Serum 5 ( sp.1/101) 1,283 43 IU/ml *För 1/1010 spädning, slutlig koncentration = IU/ml x 10 Validering av testet - Optisk densitet Kvot. OD R3 0,200. OD R4a / OD R3 2. OD R4c 1,000 11 TESTRESULTAT OCH BEGRÄNSNINGAR Studier utfördes på prover som tagits i rör utan tillsats, rör med serumseparator, rör med koagelaktivator och rör med olika antikoagulantia (EDTA, heparin och citrat). 1.Prestanda De prestandaegenskaper för Platelia TM Toxo IgG TMB som sammanfattas nedan har fastställts med hjälp av färska serumprover från gravida kvinnor, immunosupprimerade patienter eller friska blodgivare samt med frusna, känt positiva eller negativa serumprover. 134

Jämförande studier Totalt 787 slumpvis utvalda prover från gravida kvinnor testades med Platelia TM Toxo IgG TMB-test och med ett annat kommersiellt EIA-test. Ett direkt agglutinations-test användes för att bestämma avvikande resultat. Tveksamma resultat från 23 prover uteslöts från beräkningar av relativ specificitet och känslighet samt relativ överensstämmelse. Platelia Toxo IgG TMB Resultat Negativt Positivt Totalt Annat EIA-test Negativt 488 0 488 Positivt 5 271 276 Totalt 493 271 764 Resultat från prospektiv studie (studieställe 1) Relativ specificitet 488/488 100% (99,0 100,0) Relativ känslighet 271/276 98.2% (95,6 99,3) Relativ 759/764 99.3% överensstämmelse - (98,8 99,9) Specificitetsstudier Specificiteten för Platelia TM Toxo IgG TMB-testet utvärderades vid 2 oberoende studieställen. De tester som användes för serumkarakterisering var kommersiella EIA-tester. Testets specificitet bestämdes med utgångspunkt från denna karakterisering. En direkt agglutinations-test användes för att bestämma avvikande resultat. Tveksamma resultat uteslöts från följande specificitetsberäkningar: - studieställe 1: 99,8 % (403/404) - studieställe 2: 100 % (488/488) Totalt: 99,9 % (891/892) Känslighetsstudier: Känsligheten för Platelia TM Toxo IgG TMB-testet utvärderades vid 2 oberoende studieställen. De analyser som användes för serumkarakterisering var kommersiella EIA-tester. Testets känslighet bestämdes med utgångspunkt från denna karakterisering. Ett direkt agglutinations-test användes för att bestämma avvikande resultat. Tveksamma resultat uteslöts från följande känslighetsberäkningar: 135

- Studieställe 1: 100 % (196/196) - Studieställe 2: 98,2 % (271/276) Totalt: 98,9 % (467/472) Serokonversions- (studieställe 1 och 2) eller post-infektions- (studieställe 1) paneler från: 84 serumprover från 33 gravida kvinnor (studieställe 1) 48 serumprover från 14 gravida kvinnor (studieställe 2) testades med Platelia TM Toxo IgG TMB. De tester som användes för serumkarakterisering var kommersiella EIA-tester. Ett direkt agglutinationstest användes för att bestämma avvikande resultat. Vid studieställe 1 ger Platelia TM Toxo IgG TMB-testet ett positivt resultat tidigare än det andra EIA-testet i 5 fall. Vid studieställe 2 ger det andra EIA-testet, som inte är detsamma som det föregående, ett positivt resultat tidigare än Platelia TM Toxo IgG TMB i 6 fall. Prevalens Prevalensen för en positiv reaktion på anti-t. Gondii IgG-antikroppar hos populationen varierar mycket mellan olika länder. I området omkring Paris (Frankrike) är andelen positiva prov 67,6 % bland en till synes frisk blodgivarpopulation: FREKVENS 80 70 60 50 40 30 20 10 0 68 69 PROVFÖRDELNINGSHISTOGRAM N = 216 0 10 1 1 3 2 5 0 0 0 <2 [2-4[ [4-6[ [6-8[ [8-10[ [10-20[ [20-40[ [40-80[ [80-160[ TITER IU/ml 30 32 34 31 23 65 22 17 19 [160-240[ PLATELIA Toxo IgG TMB EIA-test > 240 0 136

2.Precision Reproducerbarhet inom testet: 3 positiva och 1 negativt prov testades 30 gånger i samma serie. Prov Negativ Positiv 1 Positiv 2 Positiv 3 kvot Titre UI/mL Medelvärde 0,25 11 38 110 Standard -avvikelse 0,02 0,83 1,35 9,53 Variations -koefficient 6,29 7,57 3,55 8,64 Reproducerbarhet mellan tester: 3 positiva och 1 negativt prov testades i tre replikat 5 olika dagar av 2 laboratorietekniker. Prov Négatif Positiv 1 Positiv 2 Positiv 3 Ratio Titre UI/mL Medelvärde 0,22 11,8 39,2 127,5 Standard -avvikelse 0,08 1,65 5,14 14,13 Variations -koefficient 34,11 13,90 13,10 11,08 137

3.Relevanta interferenser 141 prover med nedanstående karakteristika som potentiellt kunde resultera i icke-specifika reaktioner studerades. Specificitet=99,29 % (140/141). Prov positivt Reaktivt Kommentar för CMV IgG 5 1 Negativt vid andra försök CMV IgM 5 0 VZV IgM 10 0 VZV IgG 9 0 Påssjuka IgG 7 0 Påssjuka IgM 3 0 Mässling IgG 7 0 Mässling IgM 7 0 EBV IgG 8 0 EBV IgM 9 0 Röda hund IgG 5 0 Röda hund IgM 5 0 HSV IgG 5 0 HSV IgM 5 0 HIV 15 0 Myelom 8 0 RF 15 0 ANA 10 0 HAMA 3 0 Total 141 1

12 REFERENCES 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, 1433-1443. 2. BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immuno-deficiency virus-infected patients (1988-1995). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, 575-581. 3. BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S285. 4. DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxo-plasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 18, 271-275. 5. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315. 6. DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group. Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIVinfected patients.aids 1996; 10, 1521-1527. 7. DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J.: Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; 107-03, 227-234. 8. DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988). 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2900-2906. 10. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913. 11. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G.: Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti- Toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol. 1997 ; 35, 1972-1977. 12. LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K. : Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, 155-158. 13. LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158. 14. LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 799-805. 15. LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, 211-222. 16. NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. : Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 258-262. 17. PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing serum samples for Toxo-plasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 45-49. 18. REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; 191-332. 19. SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108: 660-663.

20. SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A. : Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, 262-269. 21. SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: 977-983. 22. SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 63-69. 23. SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: 401-407 24. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115. 25. WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7, 299-316.

SAMMANFATTNING AV TESTFÖRFARANDET 1. Ställ in inkubatorns termostat på 37±1 C. 2.Späd kromogen R9 1:11 med substratbuffert R8 (enzymframkallningslösning). 3. Späd tvättlösning R2 (10 x koncentration) 1:10 i destillerat vatten. 4. Tvätta alla brunnar 1 gång med spädd tvättlösning (R2d). 5. Späd kalibratorer och prover till 1:101 med R7. 6. Fördela 200 µl vardera av spädda kalibratorer och prover i brunnarna enligt nedanstående schema. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 E5 B R4a E6 C R4b E7 D R4c E8 E E1 E9 F E2 E10 G E3 E11 H E4 E12 7. Inkubera i 1 timme vid 37 C. 8. Bered konjugatarbetslösning (R6 +R7). 9. Aspirera och tvätta sedan 3 gånger med spädd tvättlösning (R2d). 10.Fördela 200 µl konjugatarbetslösning i samtliga brunnar. 11.Inkubera i 1 timme vid 37 C. 12.Aspirera och tvätta sedan 4 gånger med spädd tvättlösning (R2d). 13.Fördela 200 µl enzymframkallningslösning (R8+R9) i samtliga brunnar. 14.Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur (+18 30 C) i mörker. 15.Fördela 100 µl stopplösning (R10) i samtliga brunnar. 16.Avläs absorbansen vid 450/620 nm med en spektrofotometer. 139

0459 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 05/2006 Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 881002