PLATELIA TOXO IgM TMB 96 TESTS 72751

Transkript

1 PLATELIA TOXO IgM TMB 96 TESTS KIT FÖR KVALITATIV DETEKTION AV ANTIKROPPAR MOT TOXOPLASMA GONDII IgM I HUMANT SERUM ELLER PLASMA GENOM IMMUNOLOGISK ENZYMANALYS IVD För in vitro-diagnostik Alla reagens tillverkas och marknadsförs i enlighet med ett fullständigt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till slutlig marknadsföring av produkt. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer med acceptanskriterierna. Handlingar som hör samman med produktion och kontroll av varje enskilt parti sparas inom vårt företag.

2 INNEHÅLLSFÖRTECKNING 1 ANVÄNDNINGSOMRÅDE KLINISK BETYDELSE TESTPRINCIP INNEHÅLL FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER OCH VARNINGAR NÖDVÄNDIG MEN EJ BIFOGAD MATERIAL BEREDNING OCH FÖRVARING AV REAGENS PROVER TESTFÖRFARANDE SYSTEMANPASSNINGAR BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTAT TESTRESULTAT OCH BEGRÄNSNINGAR REFERENSER

3 1 ANVÄNDNINGSOMRÅDE Platelia Toxo IgM TMB är ett in vitro-diagnostiskt testkit för kvalitativ bestämning av antikroppar mot Toxoplasma gondii IgM i humant serum eller plasma. 2 KLINISK BETYDELSE T. gondii är en protozo som orsakar infektion hos många olika arter av däggdjur och fåglar. Toxoplasmos, som ofta förekommer hos människa och djur, är oftast en tyst infektion. Prevalensen för denna infektion har fastställts genom serologiska tester och kan variera inom en population beroende på ursprungsland och demografi. Toxoplasmos under graviditet förknippas med allvarliga medfödda abnormiteter (i synnerhet nedsatt hjärnfunktion) och ibland dödfödsel. Påvisande av Toxo IgG-antikropp hos kvinnor före konception tillförsäkrar att fostret skyddas mot möjlig toxoplasmos under graviditeten. Det är vanligt att personer som har drabbats av förvärvat immunbristsyndrom (aids) eller personer som av annan anledning har nedsatt immunförsvar är mottagliga för allvarlig toxoplasmosinfektion. Dessa infektioner beror huvudsakligen på en reaktivering av T. gondii-cystor som förekommit redan före HIV-infektionen. Det kan vara komplicerat att ställa en specifik diagnos på T. gondii-infektion och det är sällsynt att parasiten isoleras. Serologisk konfirmering av T. gondii-antikroppar tyder på exponering för parasiten och detta har blivit allmänt accepterat som en metod att bestämma immunstatus och infektionsbenägenhet. Screening av flera isotyper gör det möjligt att datera T. gondii och sätta in lämplig behandling vid en aktuell infektion eller också att ge profylaktiska rekommendationer,som till exempel anvisningar om hygien/kost till gravida kvinnor eller kemoprofylax till immunförsvagade personer. 123

4 3 TESTPRINCIP Testet använder principen för en immunologisk enzymanalys av dubbel sandwich -typ med fast fas, varvid IgM-antikroppar binds till mikroplattans brunnar som är coatade med antikroppar mot human m- kedja (IgM). Peroxidasmärkt monoklonal antikropp, specifik för T. gondii är riktad mot ett ytantigenprotein på PM 30000, ett av de viktigaste målen för det humorala immunsvaret. Steg ett Spädda prover tillsätts coatade brunnar på mikroplattan. Under inkubering i en timme i 37 C binds IgM-antikroppar förekommande i provet till den fasta fasen. Återstående antikroppar (inbegripet eventuella IgG-antikroppar) och andra serumproteiner avlägsnas genom tvätt. Steg två En lösning innehållande T. gondii antigen och konjugat (monoklonal antikropp mot T. gondii märkt med pepparrotsperoxidas) tillsätts i varje brunn. Antikroppar mot T. gondii IgM i provet som bundit till den fasta fasen binder till T. gondii antigen-konjugatkomplexet. Överskottet av T. gondii antigen och konjugat avlägsnas genom tvätt. Steg tre Förekomsten av immunkomplex (anti IgM, anti-t. gondii IgM, T. gondii Ag, anti-t. gondii Ag konjugat) påvisas genom tillsats av en lösning, innehållande peroxidassubstrat och kromogen som, initierar en framkallningsreaktion. Steg fyra Efter 30 min. inkubering i rumstemperatur (18-30 C) stoppas den enzymatiska reaktionen genom tillsats av en syra, H 2 SO 4 1N. Den optiska densiteten, som avläses med hjälp av en spektrofotometer inställd på 450/620 nm, är proportionell mot mängden T. gondii IgMantikroppar i provet. Förekomsten av T. gondii IgM-antikroppar i ett enskilt prov bestäms genom att provets optiska densitet jämförs med gränsvärdeskontrollserumets optiska densitet. 124

5 4 INNEHÅLL Alla reagens som ingår i testet är enbart avsedda för in vitro-diagnostiskt bruk. Märkning Typ av reagens Innehåll R1 Microplate Mikroplatta: 1 platta 12 remsor med vardera 8 brytbara brunnar, coatade med antikroppar mot humant IgM. R2 Concentrated Tvättlösning: TRIS-NaCl-buffert ph 7,4, 1% Tween 1 flaska Washing 20, koncentrerat (10x). 100 ml Solution Konserveringsmedel: 0,01 % thimerosal. R3 Negative Icke-reaktiv kontroll: TRIS-NaCl-buffert (ph 8 ±0,2), 1 flaska Control bovint serumalbumin, glycerol, E102 och E122. 1ml Konserveringsmedel: <0,5 % Proclin 300. R4a Cut-off Gränsvärdeskontroll: Humant serum-igm, lågreaktivt 1 flaska Control för T. gondii Ag och icke-reaktivt för hepatit B-ytantigen 1 ml (HBs Ag), antikroppar mot humant immunbristvirus (HIV1-HIV2) och antikroppar mot hepatit C (HCV). Konserveringsmedel: <0,01% thimerosal R4b Positive Positiv kontroll: TRIS-NaCl-buffert (ph 8 ±0,2), humant serum- 1 flaska Control IgM reaktivt för T. gondii Ag och icke-reaktivt för hepatit B-ytantigen 1 ml (HBs Ag), antikroppar mot humant immunbristvirus (HIV1-HIV2) och antikroppar mot hepatit C (HCV), bovint serumalbumin, glycerol, E102 och E122. Konserveringsmedel: <0,01 % thimerosal och <0,5% Proclin 300. R6a Antigen T. gondii antigen: 2 flaskor Inaktiverad T. gondii antigen (RH-sträng); frystorkad. qs 7 ml R6b Conjugate Konjugat : Murin monoklonal antikropp mot T. 1 flaska (50x) gondii (P30) konjugerad med pepparrotsperoxidas; 0,4 ml koncentrerad (50x). R7 Diluent Prov- eller konjugat spädningsvätska: 2 flaskor TRIS-NaCl-buffert (ph 7,7 ±0,15), bovint 80 ml serumalbumin, 0,1% Tween 20 fenolrött. Konserveringsmedel: <0,01 % thimerosal. R8 TMB Substratbuffert: 1 flaska Substrate Lösning av citronsyra och natriumacetat ph 4,0, 60 ml Buffer innehållande 0,015 % H 2 O 2 och 4 % DMSO. R9 Chromogen Kromogen: 1 flaska TMB Solution Lösning innehållande tetrametylbensidin (TMB). 5 ml R10 Stopping Stopplösning: 1 flaska Solution 1N svavelsyralösning 28 ml Självhäftande film 4 125

6 5 FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER OCH VARNINGAR Försiktighetsåtgärder Resultatens kvalitet är beroende av att god laboratoriesed (GLP) tillämpas: Använd ej reagens efter passerat bäst före-datum. Blanda ej reagens från olika partier inom en bestämd testkörning. KOMMENTAR: Du kan använda andra partier än de som ingår i testet om samma parti används inom en viss testkörning: tvättlösning (R2, märknings-id: 10x blåfärgad), substratbuffert (R8, märknings-id: TMB buf. blåfärgad), kromogen (R9, märknings-id: TMB sol. grönfärgad) och stopplösning (R10 märknings-id: 1N rödfärgad). Dessa reagens kan användas tillsammans med vissa andra av våra produkter. Kontakta vår avdelning för teknisk service för mer information. Låt alla reagens anta rumstemperatur under ca 30 minuter före användning. Rekonstituera noggrant reagenserna och undvik kontamination. Utför ej testet i närvaro av reaktiva ångor (syra, alkaliska, aldehyd) eller damm som skulle kunna ändra konjugatets enzymatiska aktivitet. Använd glasvaror som noggrant har diskats och sköljts med avjoniserat vatten, eller ännu hellre, engångsmateriel. Se till att brunnarna ej hinner torka mellan tvättprocedur och reagenstillsats. Den enzymatiska reaktionen är mycket känslig för metalljoner. Därför får ingen metall komma i kontakt med de olika konjugat- eller substratlösningarna. Framkallningslösningen (substratbuffert och kromogen) måste vara färglös. Om en blå färg framträder inom några minuter efter rekonstitueringen är detta en indikation på att reagenset inte kan användas och måste ersättas. Denna lösning kan beredas i rena engångstråg av plast eller i glasbehållare som först har förtvättats med 1N HCl och därefter sköljts noggrant med destillerat vatten och torkats. Förvara lösningen i mörker. Använd en ny pipettspets för varje prov. Tvätt av mikroplattan är ett kritiskt steg i detta förfarande. Följ det rekommenderade antalet tvättcykler och se till att alla brunnar är helt fyllda och därefter helt tömda. Felaktig tvätt kan leda till felaktiga resultat. 126

7 Använd aldrig samma behållare för fördelning av konjugat- och framkallningslösning. Kontrollera noggrannhet och funktion av pipetter och annan utrustning. Ändra ej i testförfarandet. Hälso- och säkerhetsanvisningar Alla reagens i kitet är avsedda för in vitro-diagnostik. Använd engångshandskar vid reagenshantering. Munpipettera ej! Material av humant ursprung som använts vid reagensberedning har testats och befunnits icke-reaktivt för hepatit B-ytantigen (HBsAg), antikroppar mot hepatit C-virus (HCV) och antikroppar mot humant immunbristvirus (anti-hiv1 och anti-hiv2). Eftersom ingen testmetod med säkerhet kan garantera frånvaron av smittsamma ämnen, ska reagens av humant ursprung och patientprover hanteras som potentiellt smittsamma. Betrakta allt material som har varit i direkt kontakt med prover och reagens av humant ursprung, liksom tvättlösningar, som smittfarligt material. Undvik att spilla prover eller lösningar som innehåller prover. Spill måste sköljas med blekmedel som spätts till 10 %. Om den smittfarliga lösningen är en syra måste spill först neutraliseras med natriumbikarbonat och därefter renas med blekmedel och torkas upp med absorberande papper. Materialet som används för rengöring måste kastas i en behållare för smittfarligt avfall. Prover, reagens av humant ursprung liksom smittfarligt material och smittfarliga produkter måste omhändertas efter sanering enligt följande: - antingen blötläggas i blekmedel vid en slutlig koncentration på 5 % natriumhypoklorid i 30 minuter - eller autoklaveras vid 121 C i minst 2 timmar. Autoklavering i minst en timme i 121 C är den bästa metoden för att inaktivera HIV-virus och HB-virus. VARNING! KÖR INGA LÖSNINGAR INNEHÅLLANDE NATRIUMHYPOKLORID I AUTOKLAV. 127

8 VARNING! Vissa reagens innehåller: * Pro Clin 300 <0,5 %: IRRITERANDE R43: Kan ge allergi vid hudkontakt. S28/37: Vid hudkontakt tvätta genast med mycket tvål och Xi-irriterande vatten. Använd lämpliga skyddshandskar. Hantering och avlägsnande av kemiska produkter ska genomföras enligt rutiner för god laboratoriesed (GLP). Undvik all hud- och slemhinnekontakt med substratbuffert, kromogen eller stopplösning (risk för förgiftning, irritation eller brännskador). Ett säkerhetsdatablad kan erhållas på begäran. 6 - NÖDVÄNDIG MEN EJ BIFOGAD MATERIAL Vortexmixer. Avläsare för mikroplattor med 450 nm och 620 nm filter (*). Vattenbad eller motsvarande inkubator för mikroplattor, inställd med termostat på 37±1 C (*). Behållare för smittförande avfall. Natriumhypoklorid (blekmedel) och natriumbikarbonat. Destillerat eller avjoniserat vatten. Graderade mätglas med volymerna 25, 50, 100 och ml. Engångshandskar av Latex. Skyddsglasögon. Absorberande papper. Automatiska eller halvautomatiska, justerbara eller förinställda pipetter eller multipipetter för mätning och fördelning av 10 till µl respektive 1, 2 och 10 ml. Manuell, halvautomatisk eller automatisk tvättanordning för mikroplattor (*). Engångsrör. (*) Begär gärna mer information om den utrustning som vår tekniska avdelning rekommenderar. 7 BEREDNING OCH FÖRVARING AV REAGENS Kitet ska förvaras vid +2 8 C och är då hållbart till det utgångsdatum som anges på förpackningen. Obs! Låt reagenserna uppnå rumstemperatur ( C) före användning. 128

9 1) Bruksfärdiga reagens Reagens 1 (R1): mikroplatta Varje bricka som innehåller 12 remsor med 8 brytbara brunnar är förpackad i en försluten foliebelagd påse. Klipp upp påsen med en sax eller skär upp den med en skalpell 0,5-1 cm ovanför markeringen. Lägg omedelbart tillbaka oanvända remsor i påsen. Återförslut påsen noga och förvara den vid +2 8 C. Remsorna är då hållbara i 1 månad. Reagens 3 (R3), reagens 4a (R4a), reagens 4b (R4b), reagens 10 (R10): Reagenserna är hållbara till det sista förbrukningsdatum som anges på etiketten om de förvaras vid +2 8 C (gäller även öppnad förpackning). 2) Reagens som ska rekonstitueras Reagens 2 (R2): tvättlösning, koncentrerad 10 x Späd 1:10 med destillerat vatten för att få en färdig lösning (R2d). Bered 350 ml för en platta med 12 remsor om tvätt sker manuellt. Kan efter spädning förvaras i 2 veckor vid +2 8 C. Den koncentrerade lösningen kan förvaras i C. Reagens 6a (R6a) : T. gondii antigen Rekonstituera frystorkat antigen (R6a) före användning genom tillsats av 7 ml spädningsvätska (R7) till en flaska antigen. Den rekonstituerade antigenlösningen R6a-w måste vara fullständigt klar. Obs! Grumlighet indikerar att reagens ej kan användas. Använd utspädd T. gondii antigen (R6a-w) inom 30 minuter efter beredning. Dela upp oanvänd antigenlösning i portioner om 1,1 ml och förvara i 20 C i högst 3 månader. Portionerna får inte frysas om. Reagens 6b (R6b): Koncentrerat konjugat Bered utspätt konjugat (R6b-w) till en mikroplatta genom att späda 0,3 ml 50x koncentrerat konjugat R6b i 15,0 ml spädningsvätska (R7). Blanda väl. Dela dessa volymer med 10 för att erhålla de kvantiteter som behövs för en remsa med 8 brunnar. Använd utspädd konjugat (R6b-w) inom 30 minuter efter beredning. 129

10 Konjugatlösning: Reagens 6a-w (R6a-w) + reagens 6b-w (R6b-w) Bered konjugatlösning (antigen-konjugat) genom att tillsätta lika volymer rekonstituerad T. gondii antigen (R6a-w) till arbetskonjugatlösningen (R6b-w). Till en platta tillsätts 12 ml R6a-w till 12 ml R6b-w; blanda väl. Använd konjugatlösningen inom 4 timmar efter beredning. Dela dessa volymer med 12 för att erhålla den volym som behövs för en remsa med 8 brunnar. Enzymatisk framkallningslösning: reagens 8 (R8) + reagens 9 (R9) Späd kromogen (R9) 1:11 i substratbuffert (R8) (t.ex.: 1 ml reagens R ml reagens R8). Efter spädning kan reagenserna förvaras mörkt i 6 timmar vid rumstemperatur ( C). 8 PROVTAGNING 1. Serum eller plasma (EDTA, citrat eller heparin) är rekommenderade provtyper. 2. Lägg märke till följande rekommendationer om hantering, bearbetning och förvaring av blodprover. Ta alla blodprover med venpunktion och vidtag sedvanliga försiktighetsåtgärder. Låt serumprover koagulera fullständigt före centrifugering. Rören ska alltid vara förslutna. Separera serum eller plasma från koaglet eller erytrocyterna och förvara i väl förslutet rör efter centrifugering. Proverna kan förvaras vid +2 8 C om screeningen sker inom 7 dagar. Om analysen ej kommer att slutföras inom 7 dagar, eller vid transport, ska proverna frysas vid 20 C eller kallare. Tina prover högst tre gånger. Prover som har varit frysta ska blandas ordentligt efter upptining innan testet utförs. 3. Prover som innehåller upp till 90 g/l albumin, 100 mg/l bilirubin, lipemiska prover som innehåller upp till motsvarande 36 g/l triolein (triglycerid) och hemolyserade prover som innehåller upp till 10 g/l hemoglobin påverkar inte resultaten. 4. Värm inte proverna. 130

11 9- TESTFÖRFARANDE Följ noggrant angivet förfarande. Validera testresultaten med hjälp av kontrollerna för varje serie bestämningar. Tillämpa god laboratoriesed. 1. Fastställ prov- och identifieringsprotokoll noggrant. 2. Bered tvättlösningen (R2d) (se avsnitt 7). 3. Ta ut brickan och remsorna (R1) ur skyddsförpackningen. 4. Tvätta mikrotiterplattans brunnar en gång med tvättlösningen (R2d). Vänd mikroplattan upp och ned och slå försiktugt mot absorberande papper för att ta bort resterande vätska. 5. Späd testserum genom att tillsätta 10 µl prov till 1 ml spädningsvätska (R7). Kontrollerna späds på samma sätt så att spädningen blir 1/101. Blanda på vortexmixer. 6. Vid manuellt utförande av testet tillsätts 200 µl av de utspädda kontrollerna och proverna i brunnarna enligt nedan: Brunn 1A: 200 µl icke-reaktiv kontroll (R3). Brunn 1B: 200 µl gränsvärdeskontroll (R4a). Brunn 1C: 200 µl gränsvärdeskontroll (R4a). Brunn 1D: 200 µl positiv kontroll (R4b). Brunn 1E,1F,1G etc.: 200 µl prov. 7. Täck,när det är möjligt mikroplattan med plastfilm. Tryck fast filmen noggrant över hela plattan så att det blir tätt. Inkubera sedan mikroplattan i ett termostatkontrollerat vattenbad eller i en inkubator för mikroplatta vid 37±1 C i 1 timme ± 5 minuter. 8. Bered konjugatlösning (R6a-w + R6b-w) genom att tillsätta samma volym spätt konjugat (R6b-w) och rekonstituerad T. gondii-antigenlösning (R6a-w) 15 minuter före den första inkubationsperiodens slut. Blanda väl. (se avsnitt 7). 9. Ta bort plastfilmen. Aspirera samtliga brunnars innehåll till en behållare för miljöfarligt avfall (innehållande natriumhypoklorid). Tvätta mikroplattan tre gånger med tvättlösningen (R2d). Vänd mikroplattan upp och ned och slå lätt mot ett läskpapper så att eventuell överskottslösning försvinner (se avsnitt 10). 10.Fördela 200 µl av konjugatlösningen i samtliga brunnar. Konjugatlösningen ska skakas lätt före användning. 11.Täck när det är möjligt mikroplattan med plastfilm. Tryck fast filmen noggrant över hela plattan. Inkubera sedan mikroplattan i ett termostatkontrollerat vattenbad eller i en inkubator för mikroplatta vid 37±1 C i 1 timme ± 5 minuter. 131

12 12.Ta bort plastfilmen, töm alla brunnar genom aspirering och tvätta fyra gånger enligt beskrivningen ovan. Vänd mikroplattan upp och ned och slå lätt mot absorberande papper för att ta bort resterande vätska. 13.Tillsätt snabbt 200 µl homogeniserad enzymframkallningslösning (R8 + R9) i varje brunn. Låt reaktionen framkallas i mörker under 30 minuter i rumstemperatur ( C). Använd ingen självhäftande film under denna inkubering. 14.Tillsätt 100 µl stopplösning (R10) med samma fördelningssekvens och fördelningstakt som för framkallningslösningen. 15.Torka försiktigt av plattans undersida. Avläs den optiska densiteten vid 450/620 nm med hjälp av en mikrotiteravläsare inom 30 minuter efter det att reaktionen stoppats (remsorna måste alltid skyddas från ljus före avläsning). 16.Kontrollera för samtliga resultat att mätresultat, platta och protokoll för provfördelning och -identifiering överensstämmer. 10 SYSTEMANPASSNINGAR Tvätt : Följ noggrant det beskrivna tvättförfarandet för bästa möjliga testresultat. - LP35 tvättförfaranden: Validera tvättparametern när LP35 har slagits på. Välj ett testnummer mellan 1 och 20 och validera. Välj basprocedur nummer 086 och läge för plattor. Tvättaren återgår till tvättläge när justeringarna har utförts. - Andra tvättapparater: Ta kontakt med oss för anpassningar och specialförfaranden. Avläsning Alla beräkningar, validering av testet och tolkning av resultat utförs automatiskt med hjälp av våra avläsare för mikroplattor försedda med 450 och 620 nm filter. Andra instrument Ta kontakt med oss för anpassningar och specialförfaranden. 132

13 11 BERÄKNING OCH UTVÄRDERING AV RESULTAT 1) Kvalitetskontroll Inkludera alla kalibratorer vid varje analysomgång. För att analysen ska kunna valideras måste följande villkor uppfyllas: Optiska densitetsvärden: - OD R3 0,1 - OD R4b 1,0 Kvoter: - OD R4a / OD R3 3,0 - OD R4b / OD R4a 1,8 Om dessa villkor ej är uppfyllda bör testkörningen göras om. 2) Beräkning av gränsvärde, provkvot och provindexfixering Gränsvärdet ODMR4a utgör medelvärdet av de optiska densitetsvärdena hos gränskontroll R4a. För resultatet kan även följande kvot användas: - Provkvot = Prov OD / ODMR4a Om provets optiska densitet är högre än gränsvärdet ODMR4a kan även följande fixeringsindex användas för resultatet: - Provindexfixering = (OD - ODMR4a) / (OD R4b - ODMR4a)*10 133

14 3) Utvärdering av resultat Med OD-gränsvärde Med Resultat Utvärdering/ provkvot rekommendationer Provets OD < OD M R4a x 0,80 Provkvot <0,8 Icke-reaktivt Troligen ingen primär infektion prov orsakad av T. gondii Provets OD OD M R4a x 0,80 Provkvot 0,8 Osäkert Resultatet bör verifieras med ett Provets OD < OD M R4a Provkvot < 1 prov andra serumprov efter dagar Kvantitativ undersökning av anti-t. gondii IgG antikroppar behövs Provets OD OD M R4a Provkvot 1 Reaktivt Resultatet ska konfirmeras efter prov dagar på ett andra serumprov Kvantitativ undersökning av T. gondii IgG antikroppar behövs Fixeringsindex möjliggör en semi-kvantitativ värdering av resultaten av två serumprov från samma patient. Ett fixeringsindex mellan 0 och 1 innebär att provet är osäkert. Förfarandets begränsningar Diagnos av aktuell parasitinfektion kan endast fastställas med en kombination av kliniska och serologiska data som underlag. Resultatet av ett enstaka serumprov är ej ett tillräckligt bevis för diagnos av en nyligen förvärvad infektion. Endast en markant ökning av anti- T. gondii IgG-antikroppstiter i två serumprov som tagits med minst tre veckors mellanrum och testats vid samma körning med Platelia Toxo IgG TMB kan diagnostiseras som en aktuell infektion, men bör snarare ses som ett tecken på aktuell parasitinfektion. Förekomst av IgM-antikroppar mot T. gondii är inte något bevis för en färsk infektion, eftersom IgM kan finnas kvar i många månader, ibland år efter infektionen. Vid detektion av IgM bör en kvantitativ undersökning av IgG utföras tillsammans med ett andra test på prov som tas efter två till tre veckor. Om provtagning sker för tidigt vid en primär T. gondii infektion, kan anti-t. gondii eventuellt ej ha nått påvisbara nivåer. I så fall ska ett andra serumprov begäras två veckor senare och testet upprepas. 134

15 4) Ofta förekommande problem Icke validerade eller icke repeterbara reaktioner orsakas ofta av följande: Bristfällig tvätt av brunnarna. Kontaminering av negativa prov med serum eller plasma med hög antikroppstiter. Kontaminering av framkallningslösning med oxidationsmedel (blekmedel, metalljoner ). Kontaminering av stopplösning. 5) Beräkningsexempel Obs! Följande uppgifter är endast exempel och får inte användas i stället för faktiska resultat. Resultat Kontroller och OD Provkvot Fixeringsindex Resultat patientprov 450 nm nm för prov R3 0,028 R4a 0,691 R4a 0,700 R4b 1,494 Sérum n 1 0,109 0,15 - Négatif Sérum n 2 1,096 1,57 5,0 Positif Sérum n 3 2,096 3,01 17,5 Positif Validering av test - Optiska densitetsvärden:. OD R3 0,100. OD R4b 1,000 - Kvoter:. OD R4a / OD R3 3. OD R4b / OD R4a 1,8 Beräkning av gränsvärdet. ODMR4a = 12 TESTRESULTAT OCH BEGRÄNSNINGAR Studier utfördes på prover som tagits i torra rör, rör med serumseparator, rör med koagelaktivator och rör med olika antikoagulantia (EDTA, heparin och citrat). 135

16 1.Prestanda De prestandaegenskaper för Platelia Toxo IgM TMB som sammanfattas nedan har fastställts med hjälp av färska serumprover från gravida kvinnor eller immunförsvagade patienter samt med frusna, känt positiva eller negativa serumprover. Jämförande studier Totalt 607 slumpvis utvalda prover testades med Platelia Toxo IgM TMB-test och med ett annat kommersiellt EIA-test. De osäkra resultaten definierades som positiva enligt följande beräkningar av relativ specificitet och känslighet. Platelia Toxo IgM TMB Resultat Negativ Tveksam Positiv Totalt Annat EIA-test Negativ Tveksam Positiv Totalt Resultat från prospektiv studie (studieställe 1) Relativ specificitet 557/562 99,1% (97,8 99,7) Relativ känslighet 41/45 91,1% (77,9 97,1) Relativ 587/607 96,7% överensstämmelse - (95,28 98,13) Tveksamma 2/607 0,33% 136 Specificitetsstudier: Specificiteten för Platelia Toxo IgM TMB-test utvärderades vid 2 oberoende studieställen. Den analys som användes för serumkarakterisering var ett kommersiellt EIA-test. Testets specificitet bestämdes med utgångspunkt från denna karakterisering. Ett agglutinationstest användes för att bestämma avvikande resultat. De osäkra resultaten definierades som positiva enligt följande specificitetsberäkningar: - studieställe 1: 100 % (263/263) - studieställe 2: 100 % (557/557) Totalt: 100% (820/820)

17 Känslighetsstudier: Känsligheten för Platelia Toxo IgM TMB-test utvärderades vid 2 oberoende studieställen. Den analys som användes för serumkarakterisering var ett kommersiellt EIA-test. Testets känslighet bestämdes med utgångspunkt från denna karakterisering. Ett agglutinationstest användes för att bestämma avvikande resultat. De osäkra resultaten definierades som positiva enligt följande känslighetsberäkningar: - Studieställe 1: 100 % (80/80) - Studieställe 2: 100 % (100/100) Totalt: 100% (180/180) Serokonversions- (studieställe 1 och 2) eller post-infektions- (studieställe 1) paneler från: 97 serumprover (studieställe 1) 48 serumprover från 14 patienter (studieställe 2) testades med Platelia Toxo IgM TMB. Känsligheten är 100 % i denna population. Prevalens Prevalensen av en positiv reaktion för anti-t. gondii IgM antikroppar hos populationen från Paris-området är 7,4 % (Frankrike): Frekvens [0-0,1[ [0,1-0,2[ 171 [0,2-0,3[ FÖRDELNINGSHISTOGRAM Prospektiv studie på 607 serumprov [0,3-0,4[ [0,4-0,5[ [0,5-0,8[ [0,8-0,7[ [0,7-0,8[ Platelia Toxo IgM TMB EIA-test [0,8-0,9[ [0,9-1[ >1 Kvot serum/gränsvärde 137

18 2.Precision Reproducerbarhet inom test: 3 positiva och 1 negativt prov testades 30 gånger i samma serie. Variationskoefficienterna för positiva prov är under 2 %. Prov Negativ Positiv 1 Positiv 2 Positiv 3 Medelvärde 0,06 1,17 1,81 2,92 Standardavvikelse 0,01 0,02 0,03 0,03 Variationskoefficient 11,23 1,51 1,74 1,15 Reproducerbarhet mellan test: 3 positiva och 1 negativt prov testades i triplikat 5 olika dagar av 2 laboratorietekniker. Variationskoefficienterna för positiva prov är under 3 %. Prov Negativ Positiv 1 Positiv 2 Positiv 3 Medelvärde 0,06 1,19 1,83 2,96 Standardavvikelse 0,01 0,027 0,05 0,08 Variationskoefficient 10,92 2,28 2,98 2, Relevanta interferenser 239 prover med följande karakteristika som potentiellt kunde resultera i icke-specifika reaktioner studerades. Känt positivt prov för Antal falskt positiva resultat HIV 63 0 EBV IgM 9 0 EBV IgG 10 0 HSV IgM 10 0 HSV IgG 10 0 VZV IgG 10 0 VZV IgM 10 0 Mässling IgM 10 0 Mässling IgG 10 0 Påssjuka IgM 8 0 Påssjuka IgG 10 0 Röda hund IgM 5 0 Röda hund IgG 5 0 CMV IgM 5 0 CMV IgG 5 0 RH-faktor 37 0 HAMA 2 0 ANA 10 0 Myelom 10 0 Total 239 0

19 1 - REFERENCES 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups. Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immuno-deficiency virus-infected patients ( ). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxoplasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 318, DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L.SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group. Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIV-infected patients.aids 1996; 10, DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J. Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; , DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988) 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. Incidence of Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti- Toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol ; 35,

20 12. LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K. Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, LECOLIER B. and PUCHEU. Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E. Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, LUFT B.J. and REMINGTON J.S. Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E. Performance of European laboratories testing serum samples for Toxoplasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, REMINGTON J.S. and DESMONTS G. Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; SABIN A.B., and FELDMAN H.A. Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108: SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A. Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 63-69

21 23. SULZER A.J. and HALL EC. Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, WONG S.Y. and REMINGTON J.S. Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7,

22 SAMMANFATTNING AV TESTFÖRFARANDET 1. Ställ in inkubatorns termostat på 37±1 C. 2. Späd kromogen R9 1:11 med substratbuffert R8 (enzymframkallningslösning). 3. Späd tvättlösning R2 (10 x koncentration) 1:10 i destillerat vatten. 4. Tvätta alla brunnar 1 gång med spädd tvättlösning (R2d). 5. Späd kalibratorer och prover till 1:101 med R7. 6. Fördela 200 µl vardera av spädda kalibratorer och prover i brunnarna enligt nedanstående schema A R3 E5 B R4a E6 C R4a E7 D R4b E8 E E1 E9 F E2 E10 G E3 E11 H E4 E12 7. Inkubera i 1 timme vid 37 C. 8. Bered T. gondii Ag-lösning (R6a-w) och konjugatlösning (R6b-w) samt därefter konjugatarbetslösning (R6a-w + R6b-w). 9. Aspirera och tvätta sedan 3 gånger med tvättarbetslösning (R2d). 10.Fördela 200 µl konjugatarbetslösning i samtliga brunnar. 11.Inkubera i 1 timme vid 37 C. 12.Aspirera och tvätta sedan 4 gånger med tvättarbetslösning (R2d). 13.Fördela 200 µl enzymframkallningslösning (R8+R9) i samtliga brunnar. 14.Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur ( C) i mörker. 15.Fördela 100 µl stopplösning (R10) i samtliga brunnar. 16.Avläs absorbansen vid 450/620 nm med en spektrofotometer. 140

23 - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) - EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) - CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) IVD - For in vitro diagnostic use - Catalogue number - Pour diagnostic in vitro REF - Référence catalogue - Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro-diagnostikum - Bestellnummer - Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo - Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro diagnostik - Katalognummer - In vitro diagnose - Katalognummer - Manufacturer EC REP - Authorised Representative - Fabricant - Représentant agréé - Fabricante - Representante autorizado - Hersteller - Bevollmächtigter - Produttore - Distributore autorizzato - Fabricante - Representante Autorizado - Tillverkad av - Auktoriserad representant - Fremstillet af - Autoriseret repræsentant LOT - Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD - Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ - Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD - Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT - Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG - Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD - Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag - Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD - Storage temperature limitation - Consult Instruction for use - Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi - Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso - Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung - Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso - Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo - Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning - Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug i 162

24 The other languages which are required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent. Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles auprès de votre représentant Bio-Rad local. Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad. Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad Niederlassung. Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad. As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima de si. Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din lokala Bio-Rad-representant. De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør. 163

25