Kvantitativ analys av Aggregatibacter actinomycetemcomitans Betydelse av JP2 och icke-jp2 genotyp för utveckling av fästeförlust

Kvantitativ analys av Aggregatibacter actinomycetemcomitans Betydelse av JP2 och icke-jp2 genotyp för utveckling av fästeförlust Ronja Jonsson Examensarbete, 15 hp Biomedicinsk analytikerprogrammet, 180 hp VT 2017

Institutionen för Klinisk mikrobiologi Biomedicinsk laboratorievetenskap Biomedicinsk analytikerprogrammet Examensarbete, 15 hp Kursansvarig: Ylva Hedberg Fransson ylva.hedberg.fransson@umu.se Examensarbetets engelska titel Quantitative Analyses of Aggregatibacter actinomycetemcomitans - Significance of JP2 and Non-JP2 Genotype for Development of Attachment Loss Handledare Anders Johansson, Institution för Odontologi, Umeå Universitet Läraropponent: Examinator: Ylva Hedberg Fransson Mari Norgren Datum för godkännande: 2017 06 14

Abstrakt Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) är en liten gramnegativ bakterie som är starkt förknippad med en aggressiv form av parodontit och drabbar unga, i övrigt, friska personer. Bakteriens förmåga att frisätta virulensfaktorer varierar mellan olika genotyper hos Aa. JP2 genotyp av Aa har ett högt uttryck av leukotoxin, vilket beror på en deletion i leukotoxinets promotorområde. Förekomsten av JP2 genotyp och utveckling av aggressiv parodontit har identifierats i flera longitudinella studier, men ingen har tittat på koncentrationens betydelse för utveckling av fästeförlust. Syftet var att kvantifiera koncentrationen av Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp i prover från unga individer i Ghana, i relation till sjukdomsstatus och skolbakgrund, offentlig eller privat skola. Prover med subgingival plack från 173 friska individer analyserades med kvantitativ realtids-pcr (qpcr) och resultaten sattes i relation till skolbakgrund och sjukdomsstatus hos individerna efter en två års uppföljningsstudie. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan koncentrationerna av Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp i relation till sjukdomsstatus och skolbakgrund, men en tydlig trend som låg i linje med tidigare studier kunde ses. Med qpcr detekterades Aa i alla prover, vilket inte konventionell PCR och odling kunde. Koncentrationen av Aa var generellt sett högre i de prov där Aa kunde detekteras med konventionell PCR och odling. Slutsatsen var att höga koncentrationer av JP2 genotyp visade en tydlig trend för utveckling av fästeförlust ( 3 mm), samt att individer som gick på offentlig skola hade en större risk för exponering av höga koncentrationer av Aa. Nyckelord Aggregatibacter actinomycetemcomitans, JP2 genotyp, icke-jp2 genotyp, aggressiv parodontit, kvantitativ realtids-pcr, tandfästeförlust 3

Introduktion Parodontit är en kronisk inflammatorisk oral sjukdom som orsakar fästeförlust, vilket innebär nedbrytning av tandstödjevävnad och alveolärt ben. Inflammationen beror på samspelet mellan värden och flera olika bakteriearter. Sjukdomsförloppet är generellt långsamt, men utan behandling kan infektionen leda till akuta parodontala abscesser och tandlossning (1). Parodontit är den vanligaste bakteriella infektionen hos människor och påverkar miljontals individer runt om i världen (1, 2). Individer med parodontit har även en ökad risk för systemiska sjukdomar så som endokardit och arterioskleros (2). Det finns två olika former av parodontit, kronisk- och aggressiv parodontit. Skillnaden är att aggressiv parodontit har ett påskyndande sjukdomsförlopp och debuterar oftast hos unga i övrigt friska individer (3). En bakterie som starkt förknippas med aggressiv parodontit är Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) (4-7). Aa är en gramnegativ stav, 0,4 0,5 μm x 1,0 1,5 μm, som är fakultativt anaerob och saknar rörlighet. Den finns hos de flesta människor och ingår i den orala normalfloran. Aa uttrycker två exotoxiner; cytolethal distending toxins (CDT) och leukotoxin (LtxA). I alla typer av värdceller blockerar CDT proliferationen i G2/M-fasen och orsakar apoptos. LtxA kodas, tillsammans med typ I-sekretionsystem, av ett operon som består av fyra kodande gener; ltxc, ltxa, ltxb och ltxd samt en promotor uppströms. LtxA binder till hematopoetiska celler och aktiverar apoptos hos polymorfonukleära leukocyter och makrofager, vilket resulterar i immunosuppression (8). Uttrycket av exotoxinerna varierar hos Aa och betydelsen av CDT är ännu något otydlig, däremot har det visat sig att ett högt uttryck av LtxA spelar en stor roll för utvecklingen av fästeförlust (1). Det finns en stor genetisk variation hos Aa som innebär att förmågan att uttrycka och frisätta virulensfaktorer varierar mellan olika Aa-bakterier (9). Aa kan delas in i tre fylogenetiska grupper; 1) serotyp b, 2) serotyp c och 3) serotyp a, d, e och f stammar. Hos de flesta individer finns endast en av serotyperna, men vissa kan även bära på kombinationer av dessa (1). Vissa serotyper är vanligare hos vissa människor, detta beror på etnicitet och var i världen individerna bor (10). Vilken serotyp Aa tillhör, är inte en indikator för dess virulens och förmåga att orsaka fästeförlust (1). I serotyp b-stammar finns JP2 genotyp av Aa som är en mycket virulent klon. Denna genotyp har en deletion på 530-baspar i ltxa-promotorn vilket medför hög leukotoxinaktivitet och är starkt förknippad med aggressiv parodontit (7, 9, 11, 12). Epidemiologiska studier visar att JP2 genotyp har utvecklat en tydlig värdtropism, med stark genetisk koppling till den afrikanska befolkningen med tyngdpunkt hos individer i norra och västra delarna av Afrika (7, 9). Den har dock även påträffats hos individer med nordeuropeisk härkomst och hos individer med afrikanskt ursprung i andra delar av världen (13, 14). Genetisk karakterisering av bakterieisolat tyder på att alla JP2 genotyper härstammar från en gemensam förfader från norra Afrika och indikerar en möjlig värdtropism, alternativt att bakterien har ett strikt vertikalt överföringsmönster (14, 15). Aa förmåga att fästa till tandytan, undkomma värdens immunförsvar och utsöndra virulensfaktorer är avgörande för utvecklingen av fästeförlust. Sambandet mellan förekomst av JP2 genotyp och aggressiv 4

parodontit har identifierats från två olika longitudinella studier från unga individer i både Ghana och Marocko. Dessa studier har lokaliserat förekomsten av Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp med hjälp av konventionell PCR, samt att proverna från Ghana verifierades med odling (7, 9). Ingen av dessa studier har gjort kvantitativa analyser vilket krävs för att förstå variationen och koncentrationens betydelse för Aa och utvecklingen av fästeförlust, det är dock troligt att höga koncentrationer av Aa ökar risken för fästeförlust. Syftet var att kvantifiera koncentrationen JP2 och icke-jp2 genotyp av Aa i relation till utveckling av fästeförlust, aggressiv parodontit och skolbakgrund. 5

Material och metoder Studerad population och mikrobiella prover I en tidigare studie från 2012 (baslinjen) deltog 500 skolungdomar, medelvärde 13,5 år, SD ± 1,5, från åtta offentliga och tre privata skolor i Ablekuma South Sub-Metro distriktet i Greater Accra, Accra, Ghana. De olika skolorna och de studerade individerna speglade en blandning av migranter från alla delar av Ghana samt individernas socioekonomiska bakgrund. Individerna fick svara på frågor och genomgå klinisk bedömning för utvärdering av fästeförlust. De lämnade även prover på subgingival plack som togs med pappers points från tandköttet i anslutning till fyra utvalda platser runt gingivalranden. Sjukdomsstatus för individerna bestämdes till frisk samt fästeförlust och där brytpunkten för fästeförlust bestämdes till 3 mm i en eller flera tandköttsfickor (16). Två år senare gjordes en uppföljningsstudie på 397 av de 500 individerna, då ytterligare kliniska bedömningar för progression av fästeförlust gjordes (9). I denna studie användes prover från 173 av 315 individer som vid baslinjen var friska, resultaten jämfördes med skolbakgrund och individernas sjukdomsutveckling från de tidigare studierna. Kvantitativ PCR För stabilisering av DNA späddes proverna med 1 µl TE (10 mm Tris, 1 mm EDTA, ph 8,0). Proverna analyserades två gånger med olika reaktionsblandningar, JP2 eller icke-jp2 genotyp (17). Inför varje kvantitativ real-tids PCR (qpcr) blandades 7 µl mastermix med 3 µl prov. Mastermixen för analys av icke-jp2 genotyp innehöll 5 µl Kapa SYBR Green KK4702 (Kapa Biosystems, Kapstaden, Sydafrika), 1 µl primermix (5 µm Non-JP2F 142 (5 -CGC AAG TGC CAT AGT TAT CCA CT-3 ) och 5 µm Non- JP2R 143 (5 -TCG TCT GCG TAA TAA GCA AGA GAG-3 )) och 1 µl MGB-probelösning (0,2 µm MGBstamlösning, 5 -FAM-ATA TTG TAG ACA TCG CCC-MGB-3 ) för varje enskilt prov. Mastermixen för analys av JP2 genotyp innehöll 5 µl Kapa SYBR Green KK4702 (Kapa Biosystems), 1 µl primermix (5 µm JP2-F3 140 (5 -TCT ATG AAT ACT GGA AAC TTG TTC AGA AT-3 ) och 5 µm JP2-R2 141 (5 -GAA TAA GAT AAC CAA ACC ACA ATA TCC-3 )) och 1 µl TAMRA-probelösning (0,2 µm TAMRAstamlösning, 5 -FAM-ACA AAT CGT TGG CAT TCT CGG CGA A-TAMRA-3 ) för varje enskilt prov. Till varje qpcr-analys användes fyra negativa kontroller, milliq H2O, och dubbel uppsättning av standardlösning (10-10 8 celler/ml). Proverna analyserades med samma inställning för båda reaktionsblandningarna i Corbett Research Rotor-Gene 6000 Rotary Analyze (QIAGEN, Valencia, CA, USA); denaturering 10 min vid 95 C, 45 cykler, 10 sek vid 95 C, 40 sek vid 58 C, 1 sek vid 72 C. Statistiska analyser Resultaten från JP2 och icke-jp2 genotyp adderades för samtliga prov så att den totala mängden Aa i provet vid baslinjen erhölls. Beskrivande statistik, F- och T-test för Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp analyserades utifrån individernas skolbakgrund samt sjukdomsstatus från uppföljningsstudien. Även qpcr förmåga att detektera koncentrationen av Aa sattes i relation till konventionella metoders detektering av bakterieförekomst. Signifikansnivån bestämdes till p-värde <0,05. De statistiska analyserna utfördes med Microsoft Office Excel 2016, Windows. 6

Risken att utveckla fästeförlust vid exponering av olika koncentrationer av Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp samt den relativa risken för höga koncentrationer av Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp i relation till skolbakgrund beräknades som förhållandet exponerade individer genom oexponerade individer, med hjälp av högsta kvartilen och lägsta kvartilen. För JP2 genotyp innefattade den oexponerade gruppen en större andel prover (51%), detta för att inte behöva sortera ut prover bland de JP2-negativa. Den relativa risken (RR), dess standardavvikelse samt 95% konfidensintervall (KI) beräknades med Relative risk calculator och ett värde större än ett talade om att det fanns en ökad risk (18). Etiska överväganden Etiskt godkännande har erhållits från Noaguchi Memorial Institute för medicinsk forskning, Ghana University, Accra, Ghana (2009-08-17, IRB: 0001276) och Umeå universitetets etiska kommitté (2008-06-23, dnr: 06-100M), Umeå. Innan deltagandet i studien lämnades undertecknade samtycken från barnens föräldrar eller vårdnadshavare. Personer som identifierades med aggressiv parodontit informerades om deras status och hänvisades till tandläkarskolan på Ghana University för behandling. Inga invasiva ingrepp utfördes i studien, endast dokumentation av kliniska registreringar gjordes. 7

Resultat Fördelning av individer mellan sjukdomsstatus och skolbakgrund I denna studie analyserades 173 friska individer från baslinjen, av dem gick 96 (55,5%) i offentlig skola och 77 (44,5%) i privat skola. Efter två år hade 47 (27,2%) utvecklat fästeförlust och bland dessa var det 34 (72,3%) som gick på offentlig skola och 13 (27,7%) på privat skola. Av de 96 individerna som gick på offentlig skola så utvecklade 34 (35,4%) fästeförlust samtidigt som det var 13 av 77 (16,9%) som utvecklade fästeförlust i de privata skolorna (Tab. 1). Detektion av Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp Aa detekteras med qpcr i alla 173 prover från 1 cell/ml till 127 913 x 10 6 celler/ml, medelvärde 1 381 x 10 6 celler/ml. Även icke-jp2 genotyp detekterades i alla prover där koncentrationen varierade från 1 cell/ml till 11 702 x 10 6 celler/ml, medelvärde 626 x 10 6 celler/ml. Däremot kunde JP2 genotyp endast detekteras i 85 (49,1%) prover. Spridningen mellan värdena för JP2 genotyp var från 0 till 127 812 x 10 6 celler/ml, medelvärde 755 x 10 6 celler/ml (Tab. 2). Aa detekterades med qpcr i 173 prover jämfört med analys med konventionell PCR i kombination med odling, där Aa detekterades i 81 prover. Koncentrationen av Aa var generellt sett högre i de prov där Aa kunde detekteras med konventionell metodologi (Fig. 1). Koncentration av Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp i relation till sjukdomsstatus Medelkoncentration av Aa var fem gånger högre hos de 47 individer som vid uppföljningsstudien utvecklat fästeförlust än hos de friska individerna. De individer som utvecklat fästeförlust vid uppföljningsstudien hade en JP2 genotyp koncentration som vid baslinjen var ca 400 gånger högre än hos de som inte utvecklat fästeförlust. Medelkoncentrationen av icke-jp2 genotyp var lika vid baslinjen hos alla individer som vid uppföljningsstudien antigen var friska eller hade utvecklat fästeförlust (Fig. 2). Ingen signifikant skillnad kunde ses mellan koncentrationerna av Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp vid baslinjen i relation till sjukdomsstatus vid uppföljningsstudien. Bland de 173 individer som var friska vid baslinjen hade de individer som exponerats med höga koncentrationer av JP2 genotyp en ökad risk (RR=1,7; 95% KI [0,92-3,09]) att utveckla fästeförlust. Aa och icke-jp2 genotyp gav ingen ökad risk (Tab. 3). Koncentration av Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp i relation till offentlig och privat skola De 96 individer som gick på offentliga skolor exponeras i genomsnitt för högre koncentrationer; fem gånger högre koncentration av Aa, två gånger högre koncentration av icke-jp2 genotyp och 126 gånger högre koncentration av JP2 genotyp än de 77 individer som gick på privata skolor (Fig. 3). Ingen signifikant skillnad kunde ses mellan koncentrationerna av Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp i relation till offentlig och privat skola. 8

Individerna som gick på offentlig skola hade en ökad risk att bära på höga koncentrationer av Aa (RR=1,1; 95% KI [0,59 2,06]) och JP2 genotyp (RR=1,2; 95% KI [0,84 1,74]). Det fanns ingen ökad risk att bära på höga koncentrationer av icke-jp2 genotyp om individen gick på offentlig skola (Tab. 3). 9

Diskussion Longitudinella studier korrelerar oftast risken för att drabbas av sjukdom i närvaro av en viss faktor en tid innan sjukdomen bryter ut. När det gäller aggressiva former av parodontit har det visats att de individer som är infekterade med Aa vid baslinjen har en signifikant ökad risk att utveckla fästeförlust, jämfört med individer där bakterien inte kunde detekteras (7, 9). I denna studie undersöktes betydelsen av koncentrationen av Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp hos individen i relation till sjukdomsrisk. Den kvantitativa analysen visade att individer med höga koncentrationer av JP2 genotyp hade en ökad risk för utveckling av fästeförlust, men ingen signifikant skillnad kunde ses. Detta berodde dels på koncentrationens stora spridning och ett litet studiematerial, däremot sågs en tydlig trend, som låg i linje med andra studier där förekomsten av JP2 genotyp har analyserats i relation till fästeförlust (7, 9). Materialet från denna studie multiplicerades med tre för att bedöma hur ett större studiematerial kunde påverka signifikansen. Detta resulterade i samma spridningsmått som tidigare men ett p-värde <0,05, vilket indikerar att ett större material krävs vid eventuella fortsatta studie inom detta område. Enligt resultaten i denna studie ökade inte risken för utveckling av fästeförlust vid höga koncentrationer av Aa och icke-jp2 genotyp. Icke-JP2 hade till och med ett RR <1, vad detta beror på är oklart. Det kan vara ett slumpmässigt fel, eftersom ingen signifikant skillnad kunde ses. I en tidigare studie sågs ett möjligt samband mellan minskad sjukdomsutveckling och förekomsten av JP2 och icke-jp2 genotyp i samexistens (7). Detta kan bero på att genotyperna konkurrerar om samma ekologiska nisch och denna konkurrens skulle kunna studeras närmare vid jämförelse av andelen mellan de olika genotyperna och sjukdomsförloppets fortskridande. Trenden visade att individer i offentlig skola hade högre koncentrationer av Aa än de som gick på privata skolor. Detta tyder på att det finns en socioekonomisk skillnad som påverkar risken för att utveckla fästeförlust i ung ålder. Anledning till skillnaden mellan individernas skolbakgrund kan vara att de som går på privata skolor har bättre levnadsförhållande, socialt anseende och tillgång till fler resurser så som tandvård. Individerna från offentlig skola kommer oftast från större familjer (16), vilket kan öka risken för smittspridning. Hur Aa sprids och infekterar andra individer är oklart. Vissa studier pekar på att Aa smittar små barn via horisontell- eller/och vertikal överföring. Att Aa smittas horisontellt mellan vuxna individer verkar i dagsläget inte vara en trolig faktor, däremot kan syskon det vill säga små barn smitta horisontellt mellan varandra eller att Aa-positiv förälder smittar sina barn genom vertikal överföring (19). En annan möjlig faktor som medför ökad risk för höga koncentrationer av Aa hos individer från offentliga skolor är tillgången till hygienartiklar. Större variation i tillgång till redskap för rengöring av tänderna ses hos individerna från offentlig skola. Av de individer som gick i privat skola hade alla tillgång till tandborste, medan det är vanligare att individer på offentliga skolor använder tuggpinne (16). Det har visat sig att tuggpinnar från växten Guava innehåller ämnen som neutraliserar LtxA vilket hindrar Aa biologiska aktivitet. Detta ökar möjligheten till framtida planer för förebyggande och behandling av individer med aggressiva former av parodontit, samt att denna växt är lättillgänglig och billig för den enskilde individen (20). 10

För att diagnostisera aggressiv parodontit orsakad av Aa och dess genotyper är det viktigt att det finns kliniskt relevanta metoder. I dag används odling och konventionell PCR för detektion, men användandet av qpcr skulle kunna innebära många fördelar för diagnostiken. En stor fördel är att arbetstid och arbetsmomenten minskar vid qpcr eftersom odling, isolering och verifiering inte är nödvändigt. Att qpcr mäter koncentrationen i proverna möjliggör detektion i prover som med konventionella metoder inte är möjliga. Detta kan bidra till kliniska problem eftersom det blir svårare att avgöra vilka prover som visar relevanta resultat som har betydelse för sjukdomsutveckling. Konklusionen var att höga koncentrationer av JP2 genotyp visade en tydlig trend på ökad risk för utveckling av fästeförlust ( 3 mm) och aggressiv parodontit, störst risk att utsättas för höga koncentrationer av JP2 genotyp fanns hos individer på offentliga skolor. Det var ingen koppling mellan höga koncentrationer av icke-jp2 genotyp och ökad risk för att utveckla fästeförlust. 11

Tack tillägnas Jag vill tacka min handledare Anders Johansson på institutionen för Odontologi vid Umeå universitet för bra handledning, samt ge ett tack till Rolf Claesson för assistans med de laborativa momenten. 12

Referenser 1 Henderson B, Ward JM, Ready D. Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans: a triple A* periodontopathogen? Periodontol 2000. 2010;54(1):78-105. doi: 10.1111/j.1600-0757.2009.00331.x. 2 Åberg CH, Kelk P, Johansson A. Aggregatibacter actinomycetemcomitans: Virulence of its leukotoxin and association with aggressive periodontitis. Virulence. 2015;6(3):188-195. doi: 10.4161/21505594.2014.982428. 3 Internetodontologi. Parodontit, aggressiv. http://www.internetodontologi.se/dyn_main.asp?page=94 (2017-05-08). 4 Van der Velden U, Abbas F, Van Steenbergen TJ, De Zoete OJ, Hesse M, De Ruyter C, De Laat VH et al. Prevalence of periodontal breakdown in adolescents and presence of Actinobacillus actinomycetemcomitans in subjects with attachment loss. J Periodontol. 1989;60(11):604-610. doi: 10.1902/jop.1989.60.11.604. 5 Van der Velden U, Abbas F, Armand S, Loos BG, Timmerman MF, Van der Weijden GA, Van Winkelhoff AJ et al. Java project on periodontal diseases. The natural development of periodontitis: risk factors, risk predictors and risk determinants. J Clin Periodontol. 2006;33(8):540-548. doi: 10.1111/j.1600-051X.2006.00953.x. 6 Fine DH, Markowitz K, Furgang D, Fairlie K, Ferrandiz J, Nasri C, McKiernan M et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans and its relationship to initiation of localized aggressive periodontitis: longitudinal cohort study of initially healthy adolescents. J Clin Microbiol. 2007;45(12):3859-3869. doi: 10.1128/JCM.00653-07. 7 Haubek D, Ennibi OK, Poulsen K, Vaeth M, Poulsen S, Kilian M. Risk of aggressive periodontitis in adolescent carriers of the JP2 clone of Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans in Morocco: a prospective longitudinal cohort study. Lancet. 2008;371(9608):237-242. doi: 10.1016/S0140-6736(08)60135-X. 8 Johansson A. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin: a powerful tool with capacity to cause imbalance in the host inflammatory response. Toxins (Basel). 2011;3(3):242-259. doi: 10.3390/toxins3030242. 9 Höglund Åberg C, Kwamin F, Claesson R, Dahlén G, Johansson A, Haubek D. Progression of attachment loss is strongly associated with presence of the JP2 genotyp of Aggregatibacter actinomycetemcomitans: a prospective cohort study of a young adolescent population. J Clin Periodontol. 2014;41(3):232-241. doi: 10.1111/jcpe.12209. 10 Rylev M, Kilian M. Prevalence and distribution of principal periodontal pathogens worldwide. J Clin Periodontol. 2008;35(8 Suppl):346-361. doi: 10.1111/j.1600-051X.2008.01280.x. 13

11 Hritz M, Fisher E, Demuth DR. Differential regulation of the leukotoxin operon in highly leukotoxic and minimally leukotoxic strains of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect Immun. 1996;64(7):2724 2729. 12 Brogan JM, Lally ET, Poulsen K, Kilian M, Demuth DR. Regulation of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin expression: analysis of the promoter regions of leukotoxic and minimally leukotoxic strains. Infect Immun. 1994;62(2):501-508. 13 Claesson R, Lagervall M, Hoglund Aberg C, Johansson A, Haubek D. Detection of the highly leucotoxic JP2 clone of Aggregatibacter actinomycetemcomitans in members of a Caucasian family living in Sweden. J Clin Periodontol. 2011;38(2):115-121. doi: 10.1111/j.1600-051X.2010.01643.x. 14 Haubek D, Poulsen K, Kilian M. Microevolution and patterns of dissemination of the JP2 clone of Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans. Infect Immun. 2007;75(6):3080-3088. doi: 10.1128/IAI.01734-06. 15 Haubek D. The highly leukotoxic JP2 clone of Aggregatibacter actinomycetemcomitans: evolutionary aspects, epidemiology and etiological role in aggressive periodontitis. APMIS Suppl. 2010;(130):1-53. doi: 10.1111/j.1600-0463.2010.02665.x. 16 Åberg CH, Kwamin F, Claesson R, Johansson A, Haubek D. Presence of JP2 and non-jp2 genotypes of Aggregatibacter actinomycetemcomitans and attachment loss in adolescents in Ghana. J Periodontol. 2012;83(12):1520-1528. doi: 10.1902/jop.2012.110699. 17 Yoshida A, Ennibi OK, Miyazaki H, Hoshino T, Hayashida H, Nishihara T, Awano S, et al. Quantitative discrimination of Aggregatibacter actinomycetemcomitans highly leukotoxic JP2 clone from non-jp2 clones in diagnosis of aggressive periodontitis. BMC Infect Dis. 2012;12:253. doi: 10.1186/1471-2334-12-253. 18 Medcalc, easy-to-use statistical software. Free statistical calculator. https://www.medcalc.org/calc/relative_risk.php. (2017-05-19). 19 Asikainen S, Chen C. Oral ecology and person-to-person transmission of Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis. Periodontol 2000. 1999;20:65-81. 20 Kwamin F, Gref R, Haubek D, Johansson A. Interactions of extracts from selected chewing stick sources with Aggregatibacter actinomycetemcomitans. BMC Res Notes. 2012;5:203. doi: 10.1186/1756-0500-5-203. 14

Tabell 1. Fördelning av prover i relation till sjukdomsutveckling och skolbakgrund. Samt förmågan att detektera Aa med hjälp av kvantitativ PCR eller konventionell PCR och odling. Baslinjen Uppföljningsstudie Frisk Frisk Fästeförlust a Antal prover 173 126 47 Offentlig skola 96 62 34 Privat skola 77 64 13 Kvantitativ PCR A. actinomycetemcomitans 173 126 47 Icke-JP2 173 126 47 JP2 85 55 30 Konventionell PCR och odling A. actinomycetemcomitans 81 44 37 a) Brytpunkt för fästeförlust 3 mm 15

Tabell 2. Beskrivande statistik för Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp fördelning i relation till fästeförlust och skolbakgrund, ingen signifikant skillnad kunde ses. Aa Icke-JP2 JP2 Medelvärde (x10 6 celler/ml) ± SD (x10 6 celler/ml) Medelvärde (x10 6 celler/ml) ± SD (x10 6 celler/ml) Medelvärde (x10 6 celler/ml) ± SD (x10 6 celler/ml) Status Frisk 647 1 841 640 1 842 7 54 Fästeförlust a 3 348 18 603 588 1 188 2 760 18 639 Skola Offentlig 2 117 13 115 765 1 921 1 352 13 044 Privat 463 1 329 453 1 330 11 69 a) Brytpunkt för fästeförlust 3 mm 16

Tabell 3. Relativa risken för utveckling av fästeförlust vid exponering av höga koncentrationer av Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp samt individers risk att bära på högre koncentrationer i relation till offentlig och privat skola. Relativ risk a, b 95% Kl p-värde Sjukdomsstatus c Aa 1,000 0,561-1,782 1,000 icke-jp2 0,933 0,516-1,689 0,820 JP2 d 1,685 0,919-3,090 0,091 Skola Aa 1,103 0,591-2,057 0,759 icke-jp2 1,000 0,526-1,901 1,000 JP2 d 1,207 0,839-1,737 0,311 a) RR=1 b) Förhållandet mellan koncentrationen i högsta kvartilen (n=45) mot koncentrationen i lägsta kvartilen (n=45) hos alla prover (n=173) c) Brytpunkt för fästeförlust 3 mm d) Lägsta kvartilen (n=88) 17

2 500 2 000 Aa-medelkoncentration analyserad med qpcr (x10 6 celler/ml) 1 500 1 000 500 0 Detekterad Ej detekterad Konventionell PCR och odling Figur 1. Medelvärde för koncentrationen av Aa detekterat med qpcr i jämförelse mellan prover där Aa detekterats eller inte detekteras med konventionell PCR och odling. 18

4 000 Aa-medelkoncentration analyserad med qpcr (x10 6 celler/ml) 3 500 3 000 2 500 2 000 1 500 1 000 500 0 Aa Icke-JP2 JP2 Frisk Fästeförlust Figur 2. Koncentrationens betydelse av Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp vid baslinjen i relation till utveckling av fästeförlust hos unga i övrigt friska individer (n=173) i Ghana efter en två års period. 19

2 500 Aa-medelkoncentration analyserad med qpcr (x10 6 celler/ml) 2 000 1 500 1 000 500 0 Aa Icke-JP2 JP2 Offentlig Privat Figur 3. Medelvärdet av koncentrationen Aa, JP2 och icke-jp2 genotyp hos unga individer (n=173) i Ghana utifrån skolbakgrund, offentlig (n=96) och privat (n=77) skola. 20