FoU rapport Identifikation av specialiserade bakterier som bryter ner skeppsvrak i Östersjön

Transkript

1 INSTITUTIONEN FÖR MARINA VETENSKAPER FoU rapport 2018 Identifikation av specialiserade bakterier som bryter ner skeppsvrak i Charlotte Gjelstrup Björdal Projektledare Institutionen för marina vetenskaper 1 (14) Carl Skottsbergs gata 22 B, Box 461, Göteborg (växel)

2 Ansvarig institution Institutionen för Marina Vetenskaper Göteborgs Universitet Inst. för marina vetenskaper Carl Skottbergs gata 22 B Box Göteborg Medverkande discipliner Tvärvetenskaplig forskning som inkluderar molekylärbiolog, mikrobiolog, och träkonservering Projektledare Charlotte Gjelstrup Björdal, Professor Marina vetenskaper, Göteborgs Universitet, Carl Skottsbergs Gata 22B SE Gothenburg, Sweden charlotte.bjordal@marine.gu.se Projektmedarbetare Marina Panova, Docent, Molekylärbiolog, (f. 1973) Anna Godhe, Professor, Marin ekologi, (f. 1967) Charlotte Björdal, Professor, Kulturvård konservering, specialist arkeologiskt trä, (f. 1961) Projektperiod Projektnummer (14)

3 Sammanfattande resultat Detta tvärvetenskapliga forskningsprojekt syftar till att identifiera de bakterier som bryter ner vårt arkeologiska kulturarv av trä i marin miljö. Såväl unika skeppsvrak som historiska boplatser längs Sveriges kuster är måltavlor för dessa specialiserade bakterier. Deras förmåga att bryta ner trä i extrema syrefattiga miljöer upptäcktes på 1980-talet och sen dess har man försökt att identifiera dem för att lära sig mer om nerbrytningsprocessen och hur man kan hindra eller minska deras angrepp. Projektet har använt av dagens avancerade molekylärbiologiska tekniker för att få fram DNA sekvenser som kan avslöja identiteten på de så-kallade erosionsbakterierna. Projektet har haft olika delmål som var och en har haft sina utmaningar. 1. Att skaffa färska arkeologiska träprover med aktiva bakterieangrepp 2. Selektion av lämpliga bakterieangripna områden i trämaterialet 3. Extraktion av DNA från utvalda träprover 4. DNA sekvensering 5. Analyser av sekvensdata Arkeologiskt trämaterial från och Svarta Havet (som referensprov) blev noggrant undersökt med ljusmikroskop och områden i veden med aktiva bakterieangrepp kunde identifieras. I dessa områden togs under sterila förhållanden ut små träprover för DNA extraktion. Erosionsbakteriernas aktivitet i de små träproverna verifierades med hjälp av elektron mikroskopi. För att extrahera tillräcklig med DNA av god kvalité från proverna, var projektet tvunget att vidareutveckla befintliga extraktionsmetoder. När de kvalitativa och kvantitativa kraven var uppfyllda, skickades DNA för sekvensering till Science for Life Laboratory - NGI i Stockholm. Den stora mängd sekvensdata som skickades tillbaka till projektet blev sedan analyserat via Mothur pipeline, och jämfört mot ett genetiskt referensbibliotek (SILVA). Vårt främste mål i denna förstudie var att utveckla välfungerande metodik för att få så djup fylogenetisk tillhörighet som möjligt på de bakterier som var aktiva inne i träet där tränedbrytningen ägde rum. Efter omfattande analysarbete fann vi att många av de dominerande typerna av bakterier var olika mellan proverna, och mellan de två geografiska områdena. Några få var gemensamma. En sortering baserad på morfologisk, biokemisk aktivitet och tillhörighet i marin/akvatisk miljö konkluderade att erosionsbakterier troligen kan finns inom flera olika bakteriegrupper och att Proteobacteria, Planctomycetes, Patescibacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Chloroflexi, Spirochaetes, Atribacteria Firmicutes samt en grupp av oklassificerade bakteria är troliga kandidater. 3 (14)

4 Bakgrund och syfte med projektet s bräckta vatten skapar unika förhållanden för bevarande av arkeologiskt trämaterial. Skeppsmasken, som i de flesta salta marina miljö världen över penetrerar och förstör träet på kort tid, finns inte i och man har därför lite slarvigt ansett att våra skeppsvrak står hela och opåverkade på havets botten. Undersökningar visar dock att så inte är fallet eftersom det finns både marina svampar och bakterier i den bräckta miljön som bryter ner trämaterialet. Värt att notera är att bakterierna har förmågan att bryta ner träet även när miljön är näst intill anaerob (syrefri). Processen är dock mycket långsam och smygande (Björdal 2012a). Det arkeologiska trämaterial som råkar hamna i sedimenten har visat sig mer skyddad från de mikrobiella angrepp än träet som stickar upp från havsbottens yta. I kombination med strömmar och sedimentförflyttning kan en nedbruten och svag träyta snabbt slipas ner så att ornamentik, färglager och arbetsspår försvinner. Sen svenska forskare på 1980-talet upptäckte att specialiserade bakterier bryter ner arkeologiskt trä i vattendränkta syrefattiga miljöer, har det gjorts flera försök världen över för att identifiera dem. Eftersom det visade sig att dessa bakterier inte kunde isoleras eller odlas på traditionellt sätt har man haft väldigt svårt att nå framgångar. Även DNA baserade analyser som genomfördes tidigt på 2000-talet har inte heller lett till identifiering av de så kallade erosionsbakterierna (EB). Från resultaten har man dock förstått att trämaterial i marin miljö kan betraktas som en egen biotop med många olika bakterier både i biofilm på träets yta (Palla, Mancuso et al. 2013, Kalenitchenko, Bris et al. 2017)(Pop Ristova, Bienhold et al. 2017) och inne i träet (Helms, Martiny et al. 2004, Landy, Michell et al. 2008) Mer kunskap om erosionsbakteriernas identitet och funktion är nödvändig för att stoppa eller minska nedbrytningen av vårt kulturarv. Kunskaper om bakteriernas tillhörighet och deras biokemiska möjligheter för att bryta ner trä kommer att förse oss med nya möjligheter för att skräddarsy skyddande miljöer in situ, och därmed följa UNESCO`s rekommendation om att i första hand kunna bevara och skydda vårt marina kulturarv på plats, - där det hittats (UNESCO 2001). Därför bidrar vårt projekt till att bevara det arkeologiska kulturarv som exempelvis de unika skeppsvraken i och de submarina stenåldersmiljöerna längs Sydsveriges kust. Syftet Eftersom de molekylära DNA tekniker och analysmetoder har utvecklats i snabb takt finns det nu mycket goda möjligheter för att lyckas med fylogenetisk identifiering och placering av erosionsbakterierna. Det överordnade syftet är att öka kunskaperna om bakterierna så att målriktade skyddsmetoder för in situ-bevaring av kulturlämningarna kan utvecklas. Mål Målet var att utveckla en fungerande metodik (ej odling) för provtagning av erosionsbakterier i det arkeologiska trämaterialet och ta fram ett välfungerande protokoll för DNA extraktion och sekvensering. Analys av data indikerar vilka och hur många olika bakterier som finns i träet. Denna förstudie kommer att ligga till grund för utvecklingen av ett större forskningsprojekt. 4 (14)

5 Kortfattad teori- och metoddiskussion Teori Trä består av lignin, cellulosa, och hemicellulosa och är att betrakta som ett av de svåraste organiska material i naturen att bryta ner. Kring 1980 upptäckte man med hjälp av elektronmikroskop att bakterier stod för nedbrytningen av trä i vattendränkt syrefattig miljö. Efterföljande försök på att identifiera bakterierna med traditionella odlingsmetoder lyckades inte. Under 2000-talet tillkom nya möjligheter med DNA baserad identifieringsteknik. En av de första DNA baserade studier visade att arkeologiskt trä kan innehålla mer än 100 olika bakterier samtidigt. Men det var inte möjligt att skilja mellan vednedbrytande och ickevednedbrytande bakterier (Helms, Martiny et al. 2004). Resultat från EU projektet Bacpoles ( ) visade också att det fanns otroligt många olika bakterier i det arkeologiska materialet och att det var mycket svårt att isolera och identifiera EB (Landy, Michell et al. 2008). DNA-baserade odlings-oberoende tekniker för att identifiera mikrober/bakterier delas upp i två typer: metabarcoding och shotgun sequencing. Metabarcoding baseras på analys av en essentiell gen 16S ribosomal RNA(Pace 1997, Tringe and Rubin 2005). Denna gen finns hos alla prokaryota organismer och evolverar långsamt. Den skiljer sig mellan arter men inte mellan individer av samma art. Tekniken är effektiv för att detektera och kvantifiera redan kända bakterier i ett prov, men kan även vägleda oss i rätt riktning för att placera helt okända bakterier i rätt fylogenetisk grupp eftersom släktingar (nära eller avlägsna) med stor sannolikhet finns i databaserna. Tekniken som idag används för 16S mikrobiom bestämning är Illumina amplicon sequencing som ger en mycket detaljerad beskrivning av bakteriesamhället i provet. En banbrytande studie beskrev bakterier som lever i kraftigt försurade vatten vid järngruvor (Tyson, Chapman et al. 2004). Sen dess har metoden använts för att studera sammansättning av bakterier ( mikrobiom ) associerade till exempelvis pico-plankton (de minsta växtplankton i oceanerna), i hydrotermiska källor, reningsverk och i olika organ hos människor. Om ett bakteriellsamhälle består av många olika arter kan det vara svårt att få ut hela genom. I så fall kan man fokusera på enskilda gener eller delar av gener. Om vi istället vill undersöka vad bakterierna gör och vilka biologiska och kemiska processer de utför bör vi sekvens-bestämma och analysera hela arvsmassan hos alla organismerna i den aktuella miljön. Detta angreppssätt kallas shotgun sequencing och då sekvenserar man inte bara en gen utan allt DNA i ett prov. För shotgun sekvensering gäller att sekvenserna för 16S genen jämförs med databaser för att artbestämma bakterier i provet ( Taxonomic profiling ) och sen kan man sammanställa alla gener och de funktioner som finns i ett DNA prov ( Functional profiling ). På detta sätt kan man förstå vilka biokemiska processer som pågår i en viss miljö och även identifiera nya bakteriella enzymer (Hugenholtz and Tyson 2008). Metod Det marinarkeologiska trämaterialet som användes i studien, var två mindre pålprover från en pålspärr (Dynestadstäket) i (ej daterat än). De var uppgrävda av marinarkeolog Johan Rönnby i samarbete med Västerviks museum 2016/17. Från de två pålarna togs tunna snitt där angreppen studerades under ljusmikroskop som visade att proverna hade väldefinierade angrepp av erosionsbakterier. Friska (vita) och nedbrutna (blå) vedceller ses 5 (14)

6 sida vid sida vid olika förstoringar (figur 1, 2). Under sterila förhållanden togs sedan prover för DNA extraktion, och svepelektronmikroskopi (SEM) studier i båda proverna. Figure 1. Tvärsnitt från vikingatids-träpålens inre (VPV_st). Tre årsringar är synliga. Stor del av sommarveden är frisk (vita celler). Nedbrytna av bakterier är blå. Figure 2. Tvärsnitt av VPV_st, där vi ser typiskt angrepp av erosionsbakterier där nedbrytna vedceller (blå) finns bredvid friska celler (vita). Ytterligare ett marinarkeologiskt träprov, daterat AD, ingick i projektet för att balansera Östersjöproverna med en annan geografisk lokal. Detta kom från ett skeppsvrak i Svarta Havet som har grävts ut av Black Sea projekt Eftersom miljön i Svarta Havet skiljer sig markant från förväntade vi att se andra EB bakterier som här var aktiva i nedbrytningen av träet. En lämplig DNA-extraktionsmetod behövde utvecklas eftersom bakterierna i vårt fall var inneslutna i trämaterialet och inte omedelbart tillgängliga. Det visade sig att tunna och väldig små prover inte gick att använda eftersom de innehöll för lite DNA. Därför ökades provstorlek successivt tills man fick tillräcklig mängd DNA. En annan svårighet var att separera bakterier från träet. Olika metoder att mala ner trämaterialet testades, bl. a. att jobba med blött trä eller nedfryst i flytande kväve; homogenisera för hand, med en elektrisk mortel eller i en Retsch kvarn. Frystorkning av träet följt av malning i Precellys Evolution homogeniseringsapparat visade sig vara bästa metoden för att frigöra bakteriecellerna innan DNA extraktionen. DNA från träprover är ofta kontaminerat med tanniner, fenoler och polysackarider, dvs. ämnen som förhindrar molekylärbiologiska analyser. Därför testades flera DNA extraktionsmetoder som är rekommenderade för prover med högt innehåll av dessa ämnen. Den bästa extraktionsmetod för vårt ändamål var lysering i 1:1 blandning av CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromid) och SDS (sodium dodecyl sulfat), följt av extraktion med kloroform. All provhantering och DNA extraktionerna utfördes under sterila förhållanden. Ett blankprov (dvs. ett provrör utan träbit) ingick i alla steg som kontroll för eventuell kontaminering från labb-miljön. Efter alla optimeringar uppfyllde DNAt de kvalitativa och kvantitativa krav som krävs för analys av 16S regionen (metabarcoding). Tyvärr gav ingen av dessa prover den mängden DNA som krävdes för hel-genom sekvenseringen (shotgun sequencing). 6 (14)

7 Ett fragment av16s regionen amplifierades med hjälp av 16S bakterie-specifika primrar (Klindworth, Pruesse et al. 2013) och PCR. Samtidigt adderades primers för Illumina sekvenseringen och streck-koder för att urskilja sekvenser från dem olika proverna enligt ett rekommenderat on-line protokol ( Dessa så kallade amplicon bibliotek skickades till sekvensering vid Science for Life Laboratory - NGI i Stockholm. 16S sekvensdata var analyserade med Mothur pipeline (Kozich, Westcott et al. 2013). I första steget sattes forward och reverse sekvenser för varje 16S fragment ihop. Sekvenser med dålig kvalitet filtrerades bort. Också sekvenser som troligen innehåller delar från två olika 16S fragment (så kallade chimeras) togs bort. Efter det grupperades sekvenser som var minst 97% identiska i så kallade OTUs operational taxonomic units, som för okända mikroorganismer motsvarar olika arter. Dessa grupper jämfördes med 16S sekvenser från senaste versionen av databasen SILVA (v132, december 2017). Denna databas innehåller sekvenser av ribosomala gener för alla kända organismer och uppdateras kontinuerligt (Quast, Pruesse et al. 2013, Yilmaz, Parfrey et al. 2014). För våra analyser begränsades sökningar i databasen till 16S ribosomal RNA gen och bakterier som taxonomisk grupp. Diversitet av bakterier i varje prov (så kallad alpha diversity ) räknades ut som antal OTUs och Inverse Simpson diversity estimate. Rarefaction analys genomfördes för att uppskatta sannolikhet att hitta alla bakteriergrupper i prover med den aktuella mängden data. Biodiversitet mellan proverna (så kallad beta diversity ) räknades ut som Yue & Clayton distans mellan proverna och visualiserades med hjälp av Principal Coordinate Analys (PCoA). Bakteriegrupperna som dominerade varje prov visualiserades med hjälp av Phinch verktyg (Bik, Pitch Interactive). Till sist, gick man igenom de dominerande bakteriergrupperna i prover för att se om dessa är stavformade, anaeroba eller fakultativa anaeroba, gram negativa, har potential att bryta ner cellulosa/lignin, och återfinns i marin/akvatisk miljö. Projektets huvudsakliga resultat och effekter SEM analyserna visade tydliga angrepp i provmaterialet orsakat endast av erosionsbakterier (figur 3). Det arkeologiska trämaterialet från förväntades att innehålla marina bakterier och speciellt erosionsbakterier. Analys av sekvensdata från proverna visade att man med största sannolikhet upptäckt alla bakterier i proverna coverage värde var nära 1 (Tabell 1), vilket bekräftades av rare-fraction analyserna. Analyser av DNA sekvenserna visade att träproverna innehöll ett stort antal olika bakterier (3,565-5,582 OTUs), varav de flesta troligen inte är erosionsbakterier, utan sekundära bakterier eller kontamineringar från hantering vid provtagning, transport och i laboratoriemiljön. Träproverna från innehöll större antalet bakterier än proverna från Svarta Havet, och största diversitet hittades i prover VPV-stor (Tabell 1). Analys av beta diversitet visade att tekniska replikat (dvs. två träbitar från samma prov) var väldigt lika (Figur 4). 7 (14)

8 Figur 3. Ett stort antal erosionsbakterier ses bryta ner cellväggen i träfibern (vita små stavformade bakterier längs kant). Provet tagit från Pålprov VPV 1-stor. Tabell 1. Alpha diversitet av bakteriesamhällen i analyserade träprover. * Inverse Simpson Diversity Index Sample Origin N seqs Coverage N OTUs IVS* BS10_1 Black Sea BS10_2 Black Sea VPVsm_ prov sm VPVsm_ prov sm VPVst_ Prov st VPVst_2 Prov st Figur 4. Principal Coordinate Analys av skillnader i bakteriesammansättning mellan proverna och tekniska replikat. 8 (14)

9 De vanligaste bakteriegrupper i prover och Svarta Havet prover ses i figur 5. Planctomycetes, Proteobacteria och Bacteroidetes dominerade i prover, medan Patescibacteria följd av Actinobacteria och Proteobacteria var vanligaste i proverna från Svarta Havet. En noggrann analys av dominerande bakterier i och Svarta Havets prover resulterade i en lista av tänkbara kandidater se Tabell 2. Ingen av dessa fanns i märkbart antal i kontroll provet, således kan kontaminering uteslutas. Projektet har varit mycket värdefullt eftersom vi har fått testat och utvecklat metodiken och fått erfara både begränsning och svårigheter i detta arbetsflöde. Dessa kunskaper är ovärderliga när vi i nästa steg vill genomföra en fördjupad studie av erosionsbakterier, deras identitet och funktion. Tabell 2. Bakteriekandidat taxa funna bland amplikonsekvenserade träfynd från Svarta havet och i syfte att identifiera erosionsbakterier. *hög abundans i material sekvenserat från både och Svarta Havet. Taxon Familj Bacteriovoracaceae Genus Saccharospirillum Genus Pseudoalteromonas Genus Thalassospira Genus Hylemonella Genus Syntrophorhabdus Genus Ruminiclostridium Familj Burkholderiaceae Familj Devosiaceae Genus Mangroviflexus Genus Phenylobacterium Genus Ohtaekwangia Genus Chryseolinea Familj Desulfobacteraceae Genus Desulfocarbo Genus Desulfatiglans Family Syntrophaceae Geografiskt område Svarta Havet Svarta Havet Svarta Havet Svarta Havet (VPVst endast) Marin miljö* Marin miljö* Marin miljö* Marin miljö* 9 (14)

10 Figur 5. De vanligaste bakteriegrupper i analyserade prover: 0,1 = Svarta havet, 2 = kontroll, 3,4,5,6 =. 10 (14)

11 Resultatens placering i förhållande till nationell och internationell översikt av tidigare forskning inom området Erosionsbakterier (EB) bryter ner arkeologiskt trä i vattendränkta syrefattiga miljöer världen över (Björdal, Nilsson et al. 1999, Kim and Singh 2000). Långtidsstudier visar att de dessutom är de enda organismer som bryter ner trämaterial som är täckt av sediment på havsbottnen (Björdal and Nilsson 2008). Nedbrytningen går mycket långsamt och i gamla vikingatidspålspärrar fanns fortfarande pågående angrepp av EB efter 1000 år i marin sediment (Björdal, Daniel et al. 2000). Ytterligare information om EB och deras angrepp i arkeologiskt trä finns i en review artikel av Björdal, I EU projektet Bacpoles ( ) arbetade vi också mot målet att identifiera erosionsbakterierna. Arbetet och resultaten finns beskrivna (Nilsson and Björdal 2008a, Nilsson and Björdal 2008b, Nilsson, Björdal et al. 2008c). Resultaten härifrån indikerade att EB kunde tillhöra gruppen av Cytophaga/Flavobakterier (Landy, Michell et al. 2008)(Landy et al 2008). Materialet från innehöll några abundanta släkten av ordningen Cytophaga (Ohtaekwangia och Chryseolinea) men dessa var inte alls vanliga i Svarta Havet. Flavobakterier förekom i små mängder i alla analyserade prover, inklusive kontrollen. Våra resultat kompletterar tidigare forskning och skiljer sig i på två viktiga punkter. Analyserna är gjorda på bakterier påträffade långt inne i det arkeologiska trämaterialet och teoretiskt så är risken för kontaminering av mikrober från träytan, hav eller sediment väsentlig mindre än i många andra studier som gjorts. Metoden är extremt känslig och även om kontaminering förekommer så kan vi identifiera målgruppen av bakterier eftersom vi har sekvenserat djupt. Djupsekvensering innebär att man fördelar sitt DNA på en stor yta och även de ovanligaste bakterierna i provet kan identifieras. Dessutom är vår studie fokuserad på erosionsbakterier, - de vednedbrytande bakterier som har biokemiska verktyg för att kunna bryta ner ligno-cellulolytic material, vilket betyder att sekvenser av redan kända bakterier med andra förmågor kan sorteras bort. Likaså har bakterier som inte uppfyller de morfologiska kraven ignorerats. Våra resultat pekar på att erosionsbakterierna finns inom några av de grupper som anges i Tabell 2. Fördjupade studier framöver vill fokusera på dessa kandidater. Resultatets relevans för kulturmiljön, kulturarvet och kulturmiljöarbetet Sverige har en helt unik samling av historiska vrak och stenåldersboplatser i, och trä utgör största delen av det arkeologiska fyndmaterialet. För att kunna skydda det arkeologiska trämaterialet i marin miljö är det viktigt att förstå de nedbrytningsprocesser som hotar träets bevarande. Eftersom skeppsmasken inte är aktiv i s bräckta vatten tror många att vårt kulturarv är säkrat, men så är inte fallet. Trämaterial från flera kända skeppsvrak så som Kronan, Mars, Spökskeppet, Riksäpplet, Gröna Jägaren och Kravellen har 11 (14)

12 undersökts i mikroskop och alla visade pågående angrepp av vednedbrytande mikroorganismer. Dessa bakteriella angrepp börjar i träytan och arbetar sig långsamt in i träkonstruktionen. Resultatet är att träet blir mjukt och förlorar sin styrka. Vrak som befinner sig i strömt vatten och i områden med sedimenttransport utsätts även för ett fysiskt slitage som långsamt slipar ner det uppmjukade ytskiktet. Träskulpturers färglager och ornamentik i ytan försvinner först, och härmed försvinner också unik historisk information. Det är därför viktigt att man utarbetar skyddsmetoder för att säkra det marina kulturarvet. Dessa metoder bör hindra eller åtminstone minimera de mikrobiella angreppen. Idag rekommenderar man att trälämningar in situ bör skyddas med minst 50 cm sediment och förslutas så att skyddslagret är kvar på plats. Man poängterar också att regelbunden övervakning är nödvändig för att säkra att skyddslagret är kvar på plats (Björdal, Gregory et al. 2012b). När vi vet vilken grupp, och typ av bakterier som bryter ner trä i den marina miljön, är det också möjligt att förstå sig bättre på hur bakterierna rent biokemiskt förmår att sönderdela cellulosa, hemicellulosa och lignin. Med nya kunskaper om bakteriernas tillvägagångsätt för att bryta ner trä, blir det lättare att ta fram och skräddarsy skyddsåtgärder som kan hämma eller i bästa fall helt stoppa den mikrobiella nedbrytningen av det marina kulturarvet in situ så att det kan bevaras för framtida generationer. Enligt UNESCO`s konvention av 2001, rekommenderas att det marina kulturarvet först och främst ska bevaras och skyddas på sin fyndplats i havet. Detta arbete med ändamålsenliga skyddsmetoder för in situ bevarande bör ske i samarbete med marinarkeologer, länsstyrelser och Statens maritima museer. Resultatspridning - nuläge och framtidsläge Våra resultat är under bearbetning för publicering i en internationell vetenskapliga tidskrift med inriktning troligen på ekologi. Ambitionen är dessutom att skriva om våra resultat i populärvetenskaplig form i tidskriften Populär Arkeologi eller Forskning och Framsteg. För att sprida ytterligare information om projektet och dess resultat är målet att presentera det för konservatorer vid ICOM`- WOAM (International Council of Museums, Waterlogged organic archaeological material) nästa internationella konferens 2019 i Portsmouth, UK. 12 (14)

13 Referencer Bik H. M., Pitch Interactive. "Phinch: An interactive, exploratory data visualization framework for Omic datasets". biorxiv ; Björdal, C., G. Daniel and T. Nilsson (2000). "Depth of burial, an important factor in controlling bacterial decay of waterlogged archaeological poles." International Biodeterioration & Biodegradation 45: Björdal, C. G. (2012a). "Evaluation of microbial degradation of shipwrecks in the Baltic Sea." International Biodeterioration & Biodegradation 70: Björdal, C. G., D. Gregory and A. Trakadas, Eds. (2012b). Wreckprotect. Decay and protection of wooden archaeological shipwrecks. London, Archaeopress. Björdal, C. G. and T. Nilsson (2008). "Reburial of shipwrecks in marine sediments. A long term study on wood degradation." Journal of Archaeological Science 35: Björdal, C. G., T. Nilsson and G. Daniel (1999). "Microbial decay of waterlogged archaeological wood found in Sweden." International Biodeterioration & Biodegradation 43(1-2): Helms, C. A., C. A. Martiny, J. Hofman-Bang, K. B. Ahring and M. Kilstrup (2004). "Identification of bacterial cultures from archaeological wood using molecular biological techniques." International Biodeterioration & Biodegradation 53: Hugenholtz, P. and G. Tyson (2008). "Metagenomics." Nature 455(7212): Kalenitchenko, D., N. L. Bris, L. Dadaglio, E. Peru, A. Besserer and P. E. Galand (2017). "Bacteria alone establish the chemical basis of the wood-fall chemosynthetic ecosystem in the deep-sea." The ISME Journal 12(2): 367. Kim, Y. S. and A. P. Singh (2000). "Micromorphological characteristics of wood biodegradation in wet environments: a review." IAWA J 21(2): Klindworth, A., E. Pruesse, T. Schweer, J. Peplies, C. Quast, M. Horn and F. O. Glöckner (2013). "Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies." Nucleic acids research 41(1): e1. Kozich, J., S. Westcott, N. Baxter, S. Highlander and P. Schloss (2013). "Development of a Dual- Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform." Applied and Environmental Microbiology 79(17): Landy, E. T., J. I. Michell, S. Hotchkiss and R. A. Eaton (2008). "Bacterial diversity associated with archaeological waterlogged wood: Ribosomal RNA clone libraries and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)." International Biodeterioration & Biodegradation 61: Nilsson, T. and C. Björdal (2008a). "The use of kapok fibres for enrichment cultures of lignocellulosedegrading bacteria." International Biodeterioration & Biodegradation 61: Nilsson, T. and C. Björdal (2008b). "Culturing wood-degrading erosion bacteria." International Biodeterioration & Biodegradation 61: Nilsson, T., C. G. Björdal and E. Fällmann (2008c). "Culturing erosion bacteria: Procedures for obtaining purer cultures and pure strains." International Biodeterioration & Biodegradation 61: Pace, N. R. (1997). "A molecular view of microbial diversity and the biosphere." Science (New York, N.Y.) 276(5313): 734. Palla, F., F. P. Mancuso and N. Billeci (2013). "Multiple approaches to identify bacteria in archaeological waterlogged wood." Journal of Cultural Heritage 14(3): e61-e64. Pop Ristova, P., C. Bienhold, F. Wenzhöfer, P. E. Rossel and A. Boetius (2017). "Temporal and Spatial Variations of Bacterial and Faunal Communities Associated with Deep-Sea Wood Falls." PloS one 12(1): e Quast, C., E. Pruesse, P. Yilmaz, J. Gerken, T. Schweer, P. Yarza, J. Peplies and F. O. Glöckner (2013). "The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools." Nucleic acids research 41(Database issue): D (14)

14 Tringe, G., S and E. Rubin (2005). "Metagenomics: DNA sequencing of environmental samples." Nature Reviews Genetics 6(11): 805. Tyson, G. W., J. Chapman, P. Hugenholtz, E. E. Allen, J. R. Ram, P. M. Richardson, V. V. Solovyev, E. M. Rubin, D. S. Rokhsar and J. F. Banfield (2004). "Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment." Nature 428(6978): 37. UNESCO. (2001). "UNESCO convention on the protection of underwater cultural heritage." from Yilmaz, P., L. W. Parfrey, P. Yarza, J. Gerken, E. Pruesse, C. Quast, T. Schweer, J. Peplies, W. Ludwig and F. O. Glöckner (2014). "The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks." Nucleic acids research 42(Database issue): D (14)