Tubocurarine. Filip Kantardjiev A8. Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling, 5p, HT06. Handledare Ulf Göransson

Transkript

1 Tubocurarine Filip Kantardjiev A8 Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling, 5p, HT06 Handledare Ulf Göransson Institutionen för läkemedelskemi avdelningen för farmakognosi 1

2 1. Innehållsförteckning Innehåll sida Titelsida 1 Innehållsförteckning 2 Historisk bakgrund 3 Varför startade utvecklingen av tubocurarine 3 Biosyntes av tubocurarine 4 Metodbeskrivning, för extraktion 6 och isolering av substansen Biologisk aktivitet 6 Klinisk effekt och användning 8 Referenser 9 2

3 Historisk bakgrund: Tubocurarine är en aktiv substans i curare som används i århundraden av infödingar i Sydamerika vid jakt. Curare består av en grupp kompetetiva neuromuskulära blockerande preparat och bereds som ett extrakt av en eller flera växtsorter. I östra Amazondjungeln användes framför allt olika arter av Strychnos medan man i västra delen av djungeln använde arter ifrån släktet Chondrodendron för att bereda curare. När en pil med curare påstruket penetrerade huden på ett djur och går in cirkulationssystemet drabbas djuret av andningsparalys vilket leder till döden. Djuret kan därefter förtäras eftersom curare har mycket dålig absorption över magtarmslemhinnan (West 1984). Curare har används inom västerländsk medicin sedan 1858 då för att behandla stelkramp, oturligt nog avled patienten. I fyrtio år efter detta blev behandlingen av stelkramp med curare etablerad men även epilepsi behandlades på likartat vis. Curare gjorde även framsteg inom området elchocksterapi vid psykiska sjukdomar där dess muskelrelaxerande effekt förhindrade skador orsakade av kraftiga muskelsammandragningar under behandlingen (West 1984). Figur 1. Tubocurarine klorid Varför startade utvecklandet av Tubocurarine? I början av anestesins utveckling användes höga doser av anestetiska preparat vilka kunde vara på gränsen till livshotande. Anledningen till dessa koncentrationer var för att förhindra rörelse av muskler vilka uppkom beroende av reflexer använde sig den tyska kirurgen Dr Läwen av curarine vilket var delvis renat curareextrakt under operation i kombination med anestesimedel. Han fann då att säkerheten ökade när man endast använde ett anestesimedlel för att framkalla medvetslöshet hos patienten medan curarine administrerades för att ge paralys av muskelvävnaden. Denna upptäckt var dock något som inte fick något större genomslag utan föll snabbt i glömska (Lee 2005). Det var först när två kanadensiska anestesiologer använde ett standardiserat extrakt från Chondrodendron tomentosum vid namn Intocostrin som muskelrelaktant som bruket av muskelrelaxerande substanser började användas över världen (Dorkins 1982). Till en början var man tvungen att standardisera curareextrakten enligt en biologiska testmodeller. När extrakten blivit väl etablerade inom anestesin kom dock problemet med att tillgodose efterfrågan utifrån naturprodukter vilket ledde till att man påbörjade sökandet efter produkter kunde ersätta dessa. Tubocurarine användes inom kirurgisk anestesi fram till 1980-talet då substanser som atracurium, pancuronium och vecuronium lanserades och tog dess ställe inom kliniken (Lee 2005). 3

4 Biosyntes av tubocurarine Biosyntesen av tubocurarine har delvis kunnat kartläggas genom studier av cellkulturer ifrån bl.a. Berberis stolonifera som producerar bisbenzylisoquinoliner vilket är en typ av alkaloid som även tubocurarine tillhör (Samuelsson 2004). Benzylisoquinolinalkaloider är en stor och divers grupp med mer än 2500 identifierade strukturer.biosyntesen börjar med metaboliska modifikationer av tyrosin för att bilda dopamin och 4-hydroxyfenylacetaldehyd. Dopaminet och 4-hydroxyfenylacetaldehyden sammansluts sedan av norcoclaurinesyntas vilket ger trihydroxybenzylisoquinolin alkaloiden norcoclaurine, vilken är en viktig precursor till syntes av alla benzylisoquinolin alkaloider. (S)-Norcoclaurine omvandlas därefter till (S)-reticuline av 6-O-metyltransferas, N-metyltransferas, P450 hydroxylas och 4-O-metyltransferas. Intermediat av (S)-reticuline har visat sig vara substrat för bisbenzylisoquinoliner som tex. tubocurarine. Bisbenzylisoquinoliner uppkommer när två former av (S)-reticulineintermediatet N- metylcocalaurine sammanlänkas varandra katalyserat av CYP80A1 (Facchini 2001). Figur 2. Biosyntetiskt schema för bl.a. bisbenzylisoquinilinalkaloider (Facchini 2001) 4

5 Metodbeskrivning, för extraktion och isolering av substansen Curare är en benämning på det som blir kvar efter att vatten avlägsnats ifrån en avkokt av Chondrodendron tamentosum. Curare används sedan för att kommersiellt framställa tubocurarine. Tubocurarine har dock ett mycket smalt terapeutiskt index vilket kräver att substansen är mycket ren och har en korrekt standardsammansättning för att undvika överdosering. Detta har ställt särskilt höga krav på att kvantitativ analys sker med stor säkerhet. Då kvartinära curarealkaloider endast är lösliga i vatten och mycket polära organiska lösningsmedel som metanol, etanol och aceton samt blandningar av dessa lämpar sig analys med reversed-phase HPLC. Curares kvartinära baser kan utan större svårighet separeras och analyseras med reversed-phase HPLC-system men olika variabler i den mobila fasens sammansättning påverkar retentionstiderna och retentionssekvensen hos de separerade substanserna. Den mobila fasen behöver även en tillsats av elektrolyt för att undvika retention på grund av jonbyte mellan prov och den fasta fasen. Även ph påverkar retentionen av de olika substanserna i curare (Van der Maeden et. al 1977). Denna typ av metod används för analytiska bestämmningar och inte för kommersiell framställning av tubocurarine på grund av den låga kapaciteten. Principen som helhet används dock vid framställning av tubocurarine industriellt. Skillnaden ligger då framför allt i att man använder system med högre kapacitet men även tex. jonbyteskromatografi kan användas för att separera tubocurarine ifrån närbesläktade alkaloider. Biologisk aktivitet När en aktionspotential når till slutet av en nervfiber kommer det i normal vävnad att frisättas acetylkolin ut i den synaptiska klyftan vilket leder till depolarisation av det postsynaptiska membranet. Till följd av depolarisationen av det postsynaptiska membranet orsakat av transmittorberoende natriumkanaler kommer därefter kontraktion av muskelvävnaden att ske. Acetylkolinet kommer därefter att hydrolyseras av kolinesteras i princip omedelbart. Det postsynaptiska membranet kommer därefter att repolariseras varvid det blir mottagligt för stimuli med ytterligare muskelkontraktion som följd (Swartz 1955). De postsynaptiska nikotinerga actylkolinreceptorerna återfinns i högst grad vid kopplingen till motorendplattan med en täthet runt receptorer per µm 2. Dessa receptorer hör till superfamiljen cysloop-receptorer vilka är transmittorkopplade jonkanaler. Varje receptor består av 5 protomerer vilka lokaliserade till varandra enligt ordningen α1, ε, α1, δ och β motsols sett ifrån den synaptiska klyftan. Acetylkolin har bindningsplatser på receptorerna vid gränserna mellan αε och αδ. Bindning av acetylkolin till den en av bindningsplatsen underlättar bindning av acetylkolin till den andra bindningsplatsen. Det krävs dock att bägge bindningsplatser är ockuperade för att receptorn skall aktiveras. Membranets sammansättning runt receptorn är även av vikt för dess aktivitet och måste innehålla runt 50% kolesterol för att receptorn skall ha en normal funktion (Bowman 2006). 5

6 Figur 3. Acetylreceptor (Rang et. al. 2003). Genom användandet av patch-clamp elektrod på däggdjursceller har man visat att acetylkolin ger upphov till rektangulära pulser med samma amplitud oavsätt mängden stimuli. Flödet av Na + reglerar durationen av det elektriska pulserna. En ökning av koncentrationen acetylkolin ger upphov till högre frekvens av jonkanalsöppning men varken amplitud, konduktans eller hur länge jonkanalen är öppen påverkas. Den totala strömmen av Na + som passerar över det postsynaptiska membranet är dock ett verk utav tusentals aktiverade separat aktiverade jonkanaler som var och en för sig inte varit öppna i mer än ett par ms. Denna ström depolariserar membranet ner till 40 mv innan en potential uppstår (Bowman 2006). Vid en tillsats av tubocurarine har man funnit att effekten av acetylkolin inte upphör utan att det endast är frekvensen med vilken jonkanalerna öppnas som reduceras. Denna effekt beror på att tubocurarine associerar och dissocierar med bindningsplatserna för acetylkolin som därmed blockeras ifrån att utöva sin effekt och hinner brytas ner av kolinesteraser i synapsen. Denna effekt kan hämmas genom att intag av kolinesterashämmare vilka gör det möjligt för acetylkolinet att ackumuleras i den synaptiska klyftan. Det ackumulerade acetylkolinet kan därefter lättare minska aktiveringsenergin som krävs för att få depolarisation varvid en blockad kan hämmas (Bowman 2006). Neuromuskulära blockerande substanser delads in i två grupper beroende på deras verkan i kroppen. Till den första gruppen hör de curareliknande preparaten vilka även benämns som den kompetitiva blockerande gruppen. Den andra gruppen kallas för c-10- liknande gruppen eller den depolariserande blockerande gruppen (Swartz 1955). Klinisk effekt och användning Tubocurarine används inte i någon större utsträckning idag utan har ersatts av preparat som atracurium, pancuronium och vecuronium vilka har snabbare insättande av effekt och mindre biverkningar. Biverkningarna samt svårigheten till att förse marknaden ledde till en utveckling av syntetiska substanser vilka inte påverkade lika många biologiska mekanismer. 6

7 Tubocurarine har även en tendens att orsaka histaminfrisättning samt ger upphov till blockad av ganglia vilket kan leda till hypotension. 7

8 Referenser 1. Bowman W.C., Neuromuscular block. British Journal of Pharmacology 2006, 147, s Dorkins R. Huw, Suxamethonium- the development of a modern drug from 1906 to the present day, Medical history 1982, Rang, H.P., Dale, M.M., Ritter, J.M., och Moore, P.K., Pharmacology 5th Edition (2003), Churchill Livingstone/Elsevier Science, Edinburgh. 4. Facchini J. Peter, Alkaloid Biosynthesis in Plants: Biochemistry, Cell Biology, Molecular Regulation, and Metabolic Engineering Applications, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001,52: Lee MR, Curare: the South American arrow poison, J R coll Physicans Edinb 2005, 35: Raghavendra Thandla, Neuromuscular blocking drugs: discovery and development, journal of the royal society of medicine 2002, 95: Samuelsson Gunnar, Drugs of natural origin, 5 rd edition, Swedish Pharmaceutical Press: Stockholm, (2004) 8. Swartz H. Curtis, Introduction to muscle relaxants, California medicine 1955, sep;83(3): Van der Maeden F. P. B., van Rens P. T., Buytenhuys F. A. och Buurman E., Quantitative analysis of d-tubocurarine chloride in curare by column liquid chromatography, 1977 Nov 11;142: West Ranyard, An excursion into pharmacology: curare in medicine, Medical history 1984, 28,