Doktorandprojekt: Sofia Jönsson

Transkript

1 Kronisk myeloisk leukemi - monitorering av leukemibördan, resistensutveckling mot imatinib samt off target -effekter av imatinib Kronisk myeloisk leukemi (KML) är en hematologisk stamcellssjukdom som orsakas av en förvärvad translokation mellan kromosom 9 och 22. Translokationen ger upphov till en fusion mellan generna BCR och ABL. Fusionsgenen i sin tur kodar för ett konstant aktivt tyrosinkinas, BCR-ABL, som ger ohämmad celldelning. Den sjuka stamcellen differentierar till främst myeloiska celler, men även maligna T- och B-celler har observerats. Sjukdomen var tidigare mycket svårbehandlad men genom upptäckten av tyrosinkinashämmaren imatinib (Glivec, Novartis, Schweiz), som blockerar onkoproteinet BCR-ABL, har utsikterna i grunden förändrats. Vi kan idag förvänta oss års medianöverlevnad vid denna sjukdom, att jämföra med cirka fem år före introduktionen av imatinib. Detta innebär att behandlingen med imatinib kommer att vara mycket långvarig hos de flesta patienter, och långsiktiga sidoeffekter av behandlingen är ofullständigt kartlagda. Trots dessa behandlingsframgångar med imatinib, kvarstår det fortfarande några problem med denna molekylära målterapi : (i) Vissa patienter svarar inte tillfredsställande på imatinib eller utvecklar under årens lopp en resistens mot medicinen. Mekanismerna bakom denna resistensutveckling är endast till viss del klarlagda; (ii) Hos majoriteten av KML-patienterna som behandlas med imatinib kan kvarvarande sjukdom påvisas med känsliga tekniker, t.ex. RT-PCR. Dessa metoder ligger idag delvis till grund för våra behandlingsval, trots att de är bristfälligt validerade; (iii) Slutligen, under de senaste åren har flera off target -effekter beskrivits hos imatinibbehandlade patienter, till exempel förändrad ben- och mineralomsättning (1), förändringar i immunsystemet (2) och apoptos av kardiomyocyter (3). Dessa off target -effekter kan förklaras av att imatinib förutom BCR-ABL även hämmar andra tyrosinkinaser som c-kit, c-fms, och PDGF- Rα/β. Specifik målsättning 1. Att studera mekanismer bakom resistensutveckling mot imatinib 2. Att studera faktorer som kan påverka det mätbara uttrycket av BCR-ABL i perifert blod 3. Att studera immunologiska off target -effekter av imatinib 4. Att studera off target -effekter av imatinib på ben- och mineralomsättning in vivo hos KML-patienter samt in vitro på humana osteoblaster 1

2 Resurser Ett centralt mål med föreliggande forskningsprogram är att med grundvetenskapliga metoder belysa relevanta kliniska problem. Studierna genomförs i den forskargrupp som drivs av Prof. Hans Wadenvik, vid Hematologisektionen, Sahlgrenska sjukhuset. Vår grupp har etablerat ett samarbete med flera andra forskargrupper, särskild där det är metodologiskt motiverat. Inom Sahlgrenska akademin pågår fn. ett samarbete med Prof. Lena Carlsson, avdelningen för molekylär och klinisk medicin, Doc. Anne Ricksten, Doc. Ola Hammarsten och Dr. Stefan Jacobsson, avdelningen för klinisk kemi och transfusionsmedicin, samt Doc. Prof. Dan Mellström, avdelningen för geriatrik. Ett samarbete har även inletts med Prof. Standal, Department of Cancer Research and Molecular Medicine, Norwegian University of Science and Technology, Trondheim, Norge). Sedan tre år tillbaka är Doc. Bob Olsson, knuten till vår grupp. Doc. Olsson innehar en av vetenskapsrådet finansierad forskarassistenttjänst och han har lång erfarenhet av avancerade molekylära och cellbiologiska tekniker, t.ex. transgena djurmodeller, DNA microarrays, bio-informatik, och basala molekylärbiologiska metoder. En biomedicinska analytiker (Irene Andersson) arbetar heltid på laboratoriet. En läkare på post doc nivå (Med.Dr. Sofia Grund) är också knuten till laboratoriet. Vårt laboratorium är fullt utrustat för cellodling, immunomagnetisk cellseparation, ELISA, basal proteinkemi, och automatisk blodcellräkning. I samarbete med Lena Carlsson s grupp har vi tillgång till ett Affymetrix DNA microarray-system, komplett med mjukvara och arbetsstation. I samarbete med avdelningen för klinisk kemi och transfusionsmedicin har vi även tillgång till ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer för sekvensering, ABI PRISM 7900 Sequence Detection System för realtids RT-PCR, och BD FACSAria/Canto för flödescytometriska analyser. Bakgrund och tidigare publicerade resultat från andra forskargrupper Kronisk myeloisk leukemi (KML) är en relativt ovanlig sjukdom och ca l00 fall nyinsjuknar årligen i Sverige. Toppincidensen ses i års åldern och KML är något vanligare hos män. KML karaktäriseras av leukocytos där neutrofila granulocyter och myelocyter dominerar, men även basofili och någon gång eosinofili ses. Sjukdomen är i sitt naturalförlopp bi- eller trifasisk. Vid upptäckt är flertalet patienter i kronisk fas som är symtomfattig och varar 3-6 år. Symtomen under denna fas är diffusa med sjukdomskänsla, svaghet, viktnedgång, svettningar, och obehag från buken sekundärt till hepatosplenomegali. En andel patienter har inga symtom vid diagnos, utan sjukdomen upptäcks vid rutinkontroll av vita blodkroppar. Efter den kroniska fasen följer den accelererade fasen (AP) med ökad mängd blaster i blod och benmärg. Den accelererade fasen övergår slutligen till en blastkris (BC), som kliniskt ter sig som en akut leukemi och alltid har fatal utgång. KML är en hematologisk stamcellsjukdom som är associerad med en specifik kromosomtranslokation, känd som Philadelphia (Ph) kromosomen. Denna kromosom förekommer hos alla patienterna med KML. Phkromosomen är en reciprok translokation mellan kromosom 9 och 22 (t9;22)(q34;11). Den molekylära konsekvensen av translokationen är en fusion av proto-onkogenen ABL med BCRgenen, vilket resulterar i en produktion av en konstitutivt aktiv form av ABL-protein-tyrosinkinas. Detta BCR-ABL protein är av fundamental betydelse for utvecklingen av KML-sjukdomen (4;5). Hos patienter med KML ses uttryck av BCR-ABL huvudsakligen i myeloiska leukemiska celler men även en del B-celler och ett fåtal T-celler uttrycker BCR-ABL. I vilken grad BCR-ABL uttrycks i B- respektive T-celler är dock ofullständigt känt och så även betydelsen för prognos och behandling. 2

3 Stora ansträngningar har under senare år gjorts för att utveckla substanser som specifikt kan blockera detta tyrosinkinas. Imatinib (Glivec ), som syntetiserats och utvecklats av Novartis Pharma AG, har förmåga att specifikt hämma ABL-protein-tyrosinkinas (6). Att blockera aktiviteten av BCR-ABL kinaset med imatinib utgör en ny och synnerligen selektiv infart till behandling av KML. Kliniska studier med imatinib startade i juni 1998 och i skrivande stund har mer än patienter behandlats. Sammanfattningvis, imatinib har visat på mycket lovande resultat hos KML-patienter i ett sent kroniskt skede, i accelererad fas och i blastkris. Imatinib har även visat sig vara mycket effektivt hos patienter som befinner sig tidigt i sjukdomsförloppet. Detta senare har visats i den f.n. pågående IRIS-studien, där imatinib på ett randomiserat sätt jämförs med interferon+ara-c (7). Vid 60-månadersuppföljningen i denna studie hade 98% av de imatinibbehandlade patienterna uppnått en komplett hematologisk remission (CHR) och 84% en komplett cytogenetisk remission (CCyR; 0% Ph-positivitet). Vid samma tidpunkt var den progressionsfria överlevnaden (PFS) 84% med en 89%-ig overall survival. Man kunde notera en årlig progressionsfrekvens om ca 4%, varav hälften är övergång i mer avancerad sjukdom (accelererad fas och blastkris). Det allra bästa skyddet mot progressiv sjukdom hade de patienter som uppnådde ett major molekylärt svar (MMolR), dvs. en minskning av antalet BCR-ABL transkript (qrt- PCR) med mer är än 3 log(10) (8). Ett sådant gott molekylärt svar sågs hos 55% av patienterna som uppnått CCyR. Av detta framgår att behandlingsmålet bör vara en komplett cytogenetisk remission. Allt annat än det kan betraktas som ett otillfredsställande svar, där man kan överväga att modifiera behandlingen. År 2001 godkändes imatinib för behandling av kronisk myeloisk leukemi och idag är imatinib första linjens behanding vid KML. Imatinib-behandlade KML-patienter har ca 2% årlig mortalitet och vi kan förvänta oss en medianöverlevnad på ca år. Initialt var uppfattingen att imatinib var selektiv mot normalt c-abl och BCR-ABL, men senare visade det sig att läkemedlet även effektivt hämmade andra tyrosinkinaser som stemcell factor receptor (c-kit), platelet-derived growth factor (PDGF) receptorerna α och β, andra ABL-relaterade kinaser och c-fms. Detta innebär ett potentiellt ökat terapeutiskt användningsområde, vilket visas av framgångarna med imatinib mot gastrointestinala stromacellstumörer (GIST) genom hämning av c-kit, men även en ökad risk för oväntade och oönskade sidoeffekter av behandlingen vid KML (9;10). Glivec-resistens Strax efter att imatinib kom i kliniskt bruk uppdagades att en andel av KML-patienterna som behandlades med imatinib förlorade ett initialt gott behandlingssvar, s.k. förvärvad imatinibresistens. På 4 års sikt utvecklar ca. 16% av KML-patienterna som behandlas i tidig kronisk fas, 26% av patienterna som behandlas i sen kronisk fas, 73% av patienterna i AP och 95% av patienterna i BC, en imatinibresistens. Det har angetts att ca 50-90% av den förvärvade imatinibresistensen förklaras av punktmutationer i ABL-genens kinasdomän och ca 10% av genamplifiering (11-13). Andra mekanismer som föreslagits åstadkomma en reaktivering av BCR-ABL tyrosinkinaset, med resistens om följd, är otillräcklig intracellulär läkemedelskoncentration pga defekt upptag eller ökad uttransport av läkemedlet. Mutationer i kinasdomänen leder till en aminosyrasubstitution som förändrar ABLtyrosinkinasets konformation och omöjliggör eller 3

4 starkt förhindrar imatinibs inbindning. Idag har man uppdagat mer än 53 skilda punktmutationer som går med en absolut eller relativ imatinibresistens. Den kanske viktigaste mutationen drabbar den s.k. gatekeeper aminosyran Treonine i position 315 som ersättas av Isoleucin (mutationen T315I). Nyligen har två alternativa ABL-specifika tyrosinkinashämmare registrerats för behandling av KML, dasatinib (Sprycel, Bristol-Myers Squibb) och nilotinib (Tasigna, Novartis) (14;15). Vi kan kalla dem den andra generationens tyrosinkinashämmare alt. Super-Glivec. Båda dessa substanser har betydligt högre potens och båda förefaller i in vitro kunna inhibera konsekvenserna av alla utom en (T315I) av de imatinibresistenta mutationerna. För båda substanserna har man sett goda svar både hematologiskt och cytogenetiskt hos patienter i accelererad fas och blastkris. Dessa data är anmärkningsvärda speciellt mot bakgrund av att man studerat patienter med avancerad sjukdom och som sviktat på tidigare behandling och som haft lång sjukdomsduration. Man måste poängtera att T315I mutationen är resistent mot båda substanserna. Uppföljningstiden är ännu så länge kort och fullt naturligt vet vi inget om det långsiktiga resultatet. För närvarande pågår globala fas II/III prövningar, för båda substanserna, där även Västra Götalandsregionen är delaktiga, med Sahlgrenska sjukhuset som koordinerande centra. Rent hypotetiskt är det möjligt att kombinationen imatinib plus andra generationens tyrosinkinashämmare, i likhet med tuberkulos och HIV-behandling, bäst skyddar mot resistensutveckling, och det finns vissa in vitro data som stödde detta. En molekylär signatur av sjukdomen kommer med största sannolikhet att krävas för att på bästa sätt skräddarsy behandlingen för varje enskild patient (16;17). Molecular persistence Hos åtminstone hälften av patienterna med ett CCyR kan kvarvarande sjukdom påvisas med kvantitativ RT-PCR, pga. en kvarvarande pool av leukemiska stamceller. Mekanismerna bakom denna kvarvarande minimala sjukdomsbörda är multifaktoriell och mutationer i BCR- ABL kinasdomänen förefaller inte dominerar på samma sätt som vid imatinibresistensen. Andra mekanismer som föreslagits är drug efflux pga uppreglerade multi-drug resistance gener (p-glycoprotein, OCT1 och MRP1), amplifiering av BCR-ABL och stem cell quiescence. Denna molecular persistance har fått allt större betydelse och problemet med kvarvarande minimal sjukdom måste lösas innan vi kan anse patienten fullständigt skyddad (botad?) mot sjukdomsprogression (18). Det får anses klarlagt att lägre mängd kvarvarande sjukdom innebär förbättrad prognos. Effekter av imatinib på benomsättningen I ett par nyligen publicerad studier redovisades hypofosfatemi samt ökad exkretion av fosfat i urin hos en grupp patienter behandlade med imatinib för KML eller gastrointestinal stromacellstumör (GIST) (19). Det framkom även förändrade halter av osteomarkörererna osteocalcin och N- Kollagen-I-telopeptid. Det sågs också en ökad halt av parathorman hos en subgrupp av patienterna. Detta sammantaget skulle, enligt artikelförfattarna, kunna förklaras av en benomsättningsstörning medierad av imatinib genom en oönskad påverkan på PDGF-receptorerna α och β. Det fanns dock i artikeln inga uppgifter om huruvida patienterna var i sjukdomsremission vid undersökningstillfället. Det framkom inte heller hur länge de behandlats med imatinib. Doseringen av imatinib varierade också avsevärt mellan patienterna. Ingen bentäthetsmätning hade heller utförts, för att värdera om avvikelserna i laboratorieproverna var korrelerad till någon verklig påverkan på skelettet. 4

5 I en annan studie sågs på samma sätt lätt grad av fosfaturi, hypofosfatemi, hypokalcemi samt ökad halt av parathormon hos KML-patienter behandlade med imatinib i standardosen 400 mg dagligen (20). Här tolkades dock fynden bero på en imatinibmedierad ökad bennybildning med ökat upptag av kalcium i skelettet och en sekundär hyperparatyreoidism som resultat. Inte heller i denna studie hade någon bentäthetsmätning utförts. Det har även spekulerats i en direkt imatinibmedierad effekt på njuren, då c-kit uttrycks i renala tubuli. Försök har även gjorts in vitro där osteoklaster framodlats in vitro från perifert skördade CD14+celler från friska frivilliga individer. Osteoclasterna uppvisade en minskad reabsorptiv förmåga vid exponering för imatinib. Samma forskargrupp visade en minskad benreabsorption in vivo hos möss behandlade med imatinib (21) Det råder således delade meningar om huruvida imatinib påverkar benomsättningen och i så fall genom vilka mekanismer. Det är inte heller klarlagt om en sådan benomsättningsstörning har någon klinisk relevans. Imatinibs påverkan på hematopoes och T-celler Flera av de intracellulära signalmolekyler som triggas av ABL-tyrosinkinas är även engagerade vid aktiverigen av skilda celler i immunsystemet. Man har tidigare visat att imatinib åstadkommer en dosberoende och reversible lymfocytopeni och hypogammaglobulinemi (22). Vidare har imatinib en antiproliferativ effekt på normal hematopoietisk celler som tar sig uttryck i en mild anemi och neutropeni. Vid sidan av denna effekt på CD34+ progenitorceller (23), har imatinib även visats påverka monocyt-deriverade dendritiska celler (24) och monocyter (25). Imatinib kan även påverka T-lymfocyters aktivering och proliferation (26-28). De flesta av dessa resultat har erhållits i in vitro studier eller i djurmodeller. En begränsad mängd information finns tillgänglig om hur terapeutiska doser av imatinib påverkar immunsystemet in vivo. I en retrospektiv avalys av forskare vid M.D. Anderson Cancer Center fann man fler herpes zoster infektioner hos patienter som behandlats med imatinib jämfört med motsvarande patienter som tidigare behandlats med interferon-α (29). Om detta fynd är en koincidens eller om det utgörs av en kliniskt relevant och imatinib-inducerad immundefekt är oklart. Arbetsplan och preliminära resultat Patienter och etiska överväganden För närvarande behandlas cirka 40 KML-patienter med imatinib vid sektionen för hematologi, Sahlgrenska sjukhuset. Därutöver har vi genom ett regionalt samarbete tillgång till samtliga KMLpatienter inom VG-regionen (upptagningsområde 1,7 miljoner), vilket innebär cirka 70 patienter som för närvarande är under behandling med imatinib i hela regionen. Hos samtliga patienter har avancerad molekylär diagnostik genomförts och i en biobank finns såväl genomiskt DNA som cdna lagrat. Denna biobank är registrerad och för pågående studier finns godkännande från den regionala etikprövningsnämnden i Göteborg. Finansiering Pågående studier är finansierade via medel erhållna från Vetenskapsrådet, Kommunförbundet Västra Götaland, Assar Gabrielssons fond, Fred G och Emma E Kanolds stiftelse och s.k. LUA- ALF. Ett ograverat anslag har även erhållits från Novartis Sverige AB. Resistensmekanismer mot imatinib Vi planerar här att studera förekomsten av mutationer i BCR-ABL-genens kinasdomän som ger imatinibresistens. Vi kommer även att analysera andra gener samt proteiner associerade med resistens mot imatinib. Analyserna kommer att utföras på perifert blod från patienter med KML och 5

6 dessa görs vid diagnos av sjukdomen samt var 3:e månad under första året efter insatt behandling med imatinib. Samtliga cytogenetiska och molekylärcytogenetiska metoder finns uppsatta. Mutationsanalyserna av BCR-ABL-genens kinasdomän har startats som ett projekt, och våra initiala resultat har tidigare publicerats. Med flödescytometri skall förekomsten av mulidrogresistensmarkörerna p-glycoprotein (MDR1 och 2) och MRP1studeras, både kvantitativt och funktionellt. Vidare kommer uttrycket av motsvarande gener (MDR1, MRP1 och OCT1) att studeras med CA. 27 years old. Cytogenetic relapse. T315I mutation Cytogenetic does not relapse need to expand! Time (months) realtids RT-PCR. Dessa gener kodar för proteinpumpar som finns på cellytan och tros svara för inrespektive uttransport av imatinib. Ett förändrat uttryck av OCT1 och MDR1 skulle kunna vara en bakomliggande faktor vid suboptimalt svar på behandling med imatinib. Inklusion i studien kommer att ske fortlöpande över fyra år bland nyinsjuknande inom Sahlgrenska Universitetssjukhusets upptagningsområde. Detta innebär att cirka 30 nyinsjuknade patienter kommer att ingå i studien, liksom ett 50-tal patienter som för närvarande är under behandling i regionen. För studie av transkriptnivåerna för OCT1 och MDR1 finns material (cdna) fruset i biobank från 24 patienter. Monitorering av leukemibördan med qrt-pcr för BCR-ABL-transkript Rutinmässigt monitoreras leukemibördan hos imatinibbehandlade patienter genom analys av antalet BCR-ABL-transkript i perifert blod med qrt-pcr (30;31). Analysen genomförs på ofraktionerade cellpreparationer och förändringar över en viss nivå, vanligen en två- till femfaldig ökning, misstänkliggör imatinibresistens och föranleder ofta utvidgad provtagning eller ändrad terapi. Denna analys behöver optimeras och standardiseras för att få så säkra värden som möjligt. I samband med fysisk ansträngning frisätts vita blodkroppar ut i blodbanan från lever, mjälte och kärlväggar med en övergående stegring av vita blodkroppar i blodet som följd. Det är inte givet att frisättningen av lymfocyter respektive granulocyter följer samma tidsmönster eller frisätts i samma grad. Vidare är det ofullständigt kartlagt till hur stor del B-lymfocyter och T-lymfocyter tillhör den maligna klonen vid KML och därmed uttrycker fusionsgenen BCR-ABL. Om förhållandena i nivåer av granulocyter och lymfocyter i blodet samt då även maligna och friska celler i blodet, förändras i samband med ansträngning skulle detta kunna få konsekvenser för uppmätt nivå av BCR-ABL-transkript. Syftet med denna studie är således att belysa: (i) om fysisk ansträngning påverkar de analysresultat vi får med den metod som rutinmässigt används för att kvantifiera leukemibördan och (ii) till hur stor del B-lymfocyter och T-lymfocyter tillhör den maligna klonen vid KML. För att belysa denna fråga har vi påbörjat följande studie, till vilken 7 KML-patienter och 5 friska kontroller har rekryterats. Patienterna är i s.k. hematologisk och cytogenetisk remission, men har mätbara nivåer av BCR-ABL i blodet. Detta innebär med andra ord att de har en normal blodbild och inga påvisbara kromosomtranslokationer i benmärgen vid cytogenetisk analys. Däremot kan tumörmarkören BCR-ABL-trankript detekteras med qrt-pcr. Blod har samlats in från patienter och kontroller före, under och vid olika tidpunkter efter ett maximalt fysiskt arbetsprov. Nivåerna av granulocyter och skilda lymfocytfraktioner har bestämts med flerfärgs-flödescytometri (FACS; BD FACSAria) på blod från samtliga individer och tidpunkter. Hos patienterna har nivåerna av BCR-ABL i helblod mätts med qrt-pcr vid strax före arbetsprovet, vid maximal ansträngning samt tre timmar efter arbetsprovet. Med immunomagnetisk teknik har granulocyter, B-lymfocyter %Ph-pos. metaphases qrt-pcr (bcr-abl/gapdh) 02-Feb WT 04-Aug WT 05-Feb T315I 05-May WT 16% Ph+/Ph+ 4% Ph+/Ph+ 0% Ph+ 4% Ph+ 6

7 och T-lymfocyter isolerats från patientblod vid samma tidpunkter. Vi planerar nu att bestämma nivån på BCR-ABL-transkript med qrt-pcr i dessa cellpreparationer. Preliminära resultat tyder på att fysisk ansträngning, både hos patienter och kontroller, ger en ojämn frisättning av granulocyter och lymfocyter (se figur 1 och 2). De högsta nivåerna av lymfocyter noterades i samband med maximal ansträngning medan granulocyter frisattes med 2-4 timmars fördröjning. Detta kan bero på att katekolaminer, som frisätts akut under ansträngning, främst leder till mobilisering av lymfocyter, medan kortisol, som frisätts med fördröjning, framförallt ger en ökning av granulocyter. Liknande resultat finns beskrivna i litteraturen (32;33). Hos patienterna sågs en signifikant ökning av BCR-ABL-nivån efter fysisk ansträngning vilket skulle kunna spegla den förändrade fördelningen mellan granulocyter och lymfocyter (se figur 1 och 2). Högst BCR- ABL-nivåer noteras i samband med granulocyttoppen, vilket indirekt tyder på att den maligna klonen som förväntat huvudsakligen utgörs av myeloiska celler. Ökningen i BCR-ABL var upp till drygt fyrfaldig vilket är intressant eftersom det är på en nivå som idag ofta föranleder förnyad provtagning på misstanke om att en imatinibresistens utvecklats. Här rör det sig om en preanalytisk variation i BCR-ABL-nivån som inte kan förklaras av någon ändrad sjukdomsaktivitet. Svar på qrt- PCR BCR-ABL i cellseparationerna inväntas under kommande höst. Grad ökning av kvoten BCR-ABL/GUS Figur 1. Kvoten BCR-ABL/GUS under och efter fysisk ansträngning hos sex imatinibbehandlade KML-patienter ANOVA p <0, Före 1 Maximal 2 Tre 3timmar 4 ansträngning ansträngning efter ansträngning Antal celler (x 10 9 /L) Figur 2. Neutrofila granulocyter och lymfocyter i samband med fysisk ansträngning hos sex imatinibbehandlade KML-patienter. Tid vs neutrofila granulocyter Tid vs lymfocyter Arbetsprov Tid (min) Dessa resultat har sammanställts i ett abstrakt som accepterats för publikation i abstraktboken för 13th Congress of European Hematology Association : Jönsson S, Olsson B, Jacobsson S, Palmqvist L, Ricksten A, Wadenvik H. BCR-ABL transcript number and vigorous physical exercise in imatinib treated CML patients. Immunologiska off target -effekter av imatinib I tidigare studier, huvudsakligen in vitro experiment och djurmodeller, har man funnit att imatinib har en immunhämmande effekt genom att påverka antigenpresenterande celler (34), B-lymfocyter (35) och T-lymfocyter (36-39). Dessa fynd är kliniskt viktiga och även teoretiskt intressanta. Vi har i ett inledande arbete studerat hur imatinib påverkar T-lymfocyternas fenotyp och uttryck av apoptosrelaterade gener. Från elva imatinibbehandlade KML-patienter i komplett remission samt elva köns- och åldersmatchad kontroller isolerades T-lymfocyter med immunomagnetisk separationsteknik. Expressionen av apoptosrelaterade gener studerades med ett Taqman low density array (LDA) apoptosis panel -system, och T-lymfocyternas fenotyp analyserades med FACS. Vi fann att av 93 analyserade apoptosrelaterade gener hade 12 gener ett sänkt uttryck i T- lymfocyterna från KML-patienterna. Fenotypiska förändringar kunde även iakttas hos T- hjälparceller. Dessa celler uppvisade ett förändrat uttryck av PDGFR-, VLA-4 och de 7

8 immunmodulerande molekylerna KIR2DL2/DL3 resp. KIR3DL1. Dessa fynd talar för att terapeutiska doser av imatinib förändrar T-lymfocyternas fenotyp och uttryck av apoptosrelaterade gener. Dessa resultat har sammanställts i ett manuskript: Wei Y 1, Jönsson S 1, Olsson B, Stockelberg D, Jacobsson S, Ricksten A, Wadenvik H. Therapeutic doses of imatinib are associated with changes in T-cell phenotype and expression of apoptosisrelated genes. Vi planerar att utvidga dessa studier genom att på ett likartat sätt studera förändringar i B- lymfocyter och andra antigen-presenterande celler. I ett in vitro system avser vi även att studera huruvida imatinib kan påverka apoptos inducerad i T-lymfocyter. Påverkan av imatinib på mineral- och benomsättning Tidigare studier har visat hypofosfatemi hos patienter med imatinib mot gastrointestinal stromacellstumör och KML. Syftet med detta projekt är att vidare utreda uppkomsten av hypofosfatemi vid imatinibbehandling och undersöka om denna är korrelerad till någon förändring i bentäthet och benstruktur. I en inledande studie inkluderades 17 patienter med säkerställd KML och lika många friska köns- och åldersmatchade kontroller. Patienterna rekryterades från den grupp av patienter som regelbundet följs hos oss. Samtliga patienter behandlades med imatinib och medianbehandlingstiden var 50 månader vid undersökningstillfället. Patienterna var vid studiestart i hematologisk och cytogenetisk remission med en stabilt låg nivå av BCR-ABL i blodet. Varje individ lämnade blodprov som analyserades för S-kalcium, S-fosfat, S-magnesium, S- natrium, S-kalium, S-kreatinin, S-albumin, markörer för benomsättning (S-osteocalcin, S- benspecifika alkaliska fosfataser, S-kollagen-I-telopeptid) och regulatorer för benomsättning (Sparathormon, 25-hydroxi-vitamin D, 1,25-dihydroxi-viatmin D). Urin samlades under ett dygn och den dagliga urinexkretionen av kalcium och fosfat beräknades utifrån uppmätta halter av kalcium och fosfat i en fraktion av den totala urinvolymen. Vidare genomgick patienterna och kontrollerna bentäthetsmätningar med Dual Energy X-ray Absorptiometry (DXA) och peripheral quantitative computed tomography (pqct) vid Osteoporosmottagningen SU/Område Östra. DXA är standardmetoden vid diagnostik av rubbningar i benomsättningen som osteoporos medan pqct är en ny teknik som visualiserar benets olika delar och tros ge en bättre uppfattning om benkvaliteten. Data visade att KML-patienterna hade signifikant lägre nivåer av S-kalcium, S-fosfat, S-magnesium samt lägre utsöndring av kalcium i urinen. Vidare hade patienterna sänkta nivåer av benmarkörerna osteocalcin och kollagen-i-telopeptid. Patienterna hade enligt DXA-mätningarna en signifikant ökad bentäthet i ländrygg och höft jämfört med kontrollerna. pqct konfirmerade DXA-resultaten genom att visa en förhöjd bentäthet i kortikalt ben i radius och tibia hos patienterna. Detta tyder på att imatinib påverkar benomsättningen på ett sådant sätt att nettoeffekten blir en ökad benmineralisering. De sänkta nivåerna av fosfat, kalcium och magnesium i serum kan bero på att nedbrytningen av ben är lägre än bennybildningen, vilket är i linje med den observerade ökade bendensiteten. Fynden skulle kunna förklaras av att imatinib hämmar tyrosinkinasen PDGF-R och c-fms, som är viktiga för utvecklingen och funktionen av osteoblaster och osteoclaster. Detta är första gången som någon visat att imatinib-behandling är kopplat till en förändrad mineralisering av skelettet. Resultaten har sammanställts i ett manuskript som accepterats för publicering: Jönsson S, Olsson B, Ohlsson C, Lorentzon M, Mellström D, Wadenvik H. Increased cortical bone mineralization in imatinib treated patients with chronic myelogenous leukaemia. Haematologica, May 27, published ahead of print (impact factor 5.032). 8

9 Resultaten har även presenterats som poster vid två internationella hematologimöten: Jönsson S, Wei Y, Olsson B, Mellström D, Wadenvik H. Altered bone and mineral metabolism in chronic phase CML patients treated with imatinib. 12 th Congress of European Hematology Association, Vienna, june Jönsson S, Wei Y, Olsson B, Ohlsson C, Lorentzon M, Mellström D, Wadenvik H. Increased cortical bone mineralization in imatinib treated patients with chronic myelogenous leukemia. The American Society of Hematology, 49th Annual Meeting, Atlanta, December, Vi planerar nu göra en uppföljande mätning av mineralomsättningen och bentäthet två år efter studiestart för att se om någon förändring i bentäthet sker över tiden. Vi planerar att utföra samma serumanalyser och DXA som vid studiestart samt även utföra en morfologisk benanalys i form av extreme computed tomography (extreme CT). Extreme CT är en röntgenteknik som visualiserar enskilda trabekler i benet. Vidare planerar vi att in vitro närmare studera mekanismerna bakom den påverkade benomsättning som noterats hos imatinibbehandlade patienter. Detta tänker vi göra genom att studera hur imatinib påverkar differentieringen och funktionen hos osteoblaster och osteoclaster in vitro. Detta projekt kommer att drivas i samarbete med en forskargrupp i Trondheim (Prof. Standal, Department of Cancer Research and Molecular Medicine, Norwegian University of Science and Technology, Trondheim, Norge). På detta laboratorium finns de tekniker uppsatta som behövs för planerade experiment på osteoblaster och osteoclaster. Differentiering av humana mesenkymala celler mot osteoblaster induceras genom stimulering av dexametason, askorbinsyra och β-glycerofosfat, med eller utan tillägg av BMP-2 och imatinib, nilotinib och dasatinib. Proliferation av osteoblaster mäts genom inmärkning med radioaktivt tymidin. Osteoblastdifferentiering studeras genom mätning av aktiviteten hos alkaliskt fosfatas och förmågan att mineralisera bestämt genom infärgning med alizarinrött. Differentieringen bedöms även genom kvantifiering av uttrycket av generna Runx2 och Osteorix, som är centrala transkriptionsfaktorer i osteoblastogenesen. Signalvägarna som kan vara påverkade av tyrosinkinashämmarna studeras genom kvantitativ RT-PCR, fosfoproteinkinastest och Western blot. Betydelse och klinisk relevans Vi befinner oss nu i en spännande övergångsfas inom onkologin med individinriktad utredning av tumörbiologin med åtföljande individualiserad terapi. I vissa fall, som vid behandling av KML med imatinib, har framgångarna varit närmast sensationella. Denna utveckling är en utmaning för sjukvården, både ur organisationssynpunkt (avancerade utredningar och komplicerade terapier) och ur finansieringssynpunkt (nya effektiva, mycket kostsamma läkemedel). Föreliggande forskningsprojekt är av translationell karaktär och kommer att bidra till ny kunskap rörande tumördiagnostik och tumörbehandling samt vägleda oss i hur denna kunskapsmassa bäst ska införlivas i vårt rutinarbete, för att förbättra den kliniska cancervården i stort. Referenser (1) Berman E, et al. Altered bone and mineral metabolism in patients receiving imatinib mesylate. N Engl J Med 2006 May 11;354(19): (2) Appel S, et al. Effects of imatinib on normal hematopoiesis and immune activation. Stem Cells 2005 Sep;23(8): (3) Kerkela R, et al. Cardiotoxicity of the cancer therapeutic agent imatinib mesylate. Nat Med 2006 Aug;12(8): (4) Daley GQ, et al. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science 1990 Feb 16;247(4944): (5) Kelliher MA, et al. Induction of a chronic myelogenous leukemia-like syndrome in mice with v-abl and BCR/ABL. Proc Natl Acad Sci U S A 1990 Sep;87(17):

10 (6) Buchdunger E, et al. Inhibition of the Abl protein-tyrosine kinase in vitro and in vivo by a 2-phenylaminopyrimidine derivative. Cancer Res 1996 Jan 1;56(1): (7) Druker BJ, et al. Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 2006 Dec 7;355(23): (8) Hughes TP, et al. Frequency of major molecular responses to imatinib or interferon alfa plus cytarabine in newly diagnosed chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 2003 Oct 9;349(15): (9) Buchdunger E, et al. Abl protein-tyrosine kinase inhibitor STI571 inhibits in vitro signal transduction mediated by c-kit and platelet-derived growth factor receptors. J Pharmacol Exp Ther 2000 Oct;295(1): (10) Carroll M, et al. CGP 57148, a tyrosine kinase inhibitor, inhibits the growth of cells expressing BCR-ABL, TEL-ABL, and TEL-PDGFR fusion proteins. Blood 1997 Dec 15;90(12): (11) Shah NP, et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell 2002 Aug;2(2): (12) Shah NP, Sawyers CL. Mechanisms of resistance to STI571 in Philadelphia chromosome-associated leukemias. Oncogene 2003 Oct 20;22(47): (13) Shah NP, et al. Overriding imatinib resistance with a novel ABL kinase inhibitor. Science 2004 Jul 16;305(5682): (14) Kantarjian H, et al. Nilotinib in imatinib-resistant CML and Philadelphia chromosome-positive ALL. N Engl J Med 2006 Jun 15;354(24): (15) Talpaz M, et al. Dasatinib in imatinib-resistant Philadelphia chromosome-positive leukemias. N Engl J Med 2006 Jun 15;354(24): (16) Goldman J. Is imatinib a cost-effective treatment for newly diagnosed chronic myeloid leukemia patients? Nat Clin Pract Oncol 2005 Mar;2(3): (17) Goldman J, Gordon M. Why do chronic myelogenous leukemia stem cells survive allogeneic stem cell transplantation or imatinib: does it really matter? Leuk Lymphoma 2006 Jan;47(1):1-7. (18) Michor F, et al. Dynamics of chronic myeloid leukaemia. Nature 2005 Jun 30;435(7046): (19) Berman E, et al. Altered bone and mineral metabolism in patients receiving imatinib mesylate. N Engl J Med 2006 May 11;354(19): (20) Grey A, et al. Imatinib mesylate, increased bone formation, and secondary hyperparathyroidism. N Engl J Med 2006 Dec 7;355(23): (21) Dewar AL, et al. Imatinib as a potential antiresorptive therapy for bone disease. Blood 2006 Jun 1;107(11): (22) Steegmann JL, et al. Chronic myeloid leukemia patients resistant to or intolerant of interferon alpha and subsequently treated with imatinib show reduced immunoglobulin levels and hypogammaglobulinemia. Haematologica 2003 Jul;88(7): (23) Bartolovic K, et al. Inhibitory effect of imatinib on normal progenitor cells in vitro. Blood 2004 Jan 15;103(2): (24) Appel S, et al. Effects of imatinib on monocyte-derived dendritic cells are mediated by inhibition of nuclear factor-kappab and Akt signaling pathways. Clin Cancer Res 2005 Mar 1;11(5): (25) Dewar AL, etr al. Imatinib inhibits the in vitro development of the monocyte/macrophage lineage from normal human bone marrow progenitors. Leukemia 2003 Sep;17(9): (26) Cwynarski K, et al. Imatinib inhibits the activation and proliferation of normal T lymphocytes in vitro. Leukemia 2004 Aug;18(8): (27) Gao H, et al. Imatinib mesylate suppresses cytokine synthesis by activated CD4 T cells of patients with chronic myelogenous leukemia. Leukemia 2005 Nov;19(11): (28) Seggewiss R, et al. Imatinib inhibits T-cell receptor-mediated T-cell proliferation and activation in a dose-dependent manner. Blood 2005 Mar 15;105(6): (29) Mattiuzzi GN, et al. Development of Varicella-Zoster virus infection in patients with chronic myelogenous leukemia treated with imatinib mesylate. Clin Cancer Res 2003 Mar;9(3): (30) Galimberti S, et al. Quantitative molecular monitoring of BCR-ABL and MDR1 transcripts in patients with chronic myeloid leukemia during Imatinib treatment. Cancer Genet Cytogenet 2005 Oct 1;162(1): (31) Goldman J. Monitoring minimal residual disease in BCR-ABL-positive chronic myeloid leukemia in the imatinib era. Curr Opin Hematol 2005 Jan;12(1):33-9. (32) Gabriel H, Kindermann W. The acute immune response to exercise: what does it mean? Int J Sports Med 1997 Mar;18 Suppl 1:S28-S45. (33) Gleeson M, Bishop NC. The T cell and NK cell immune response to exercise. Ann Transplant 2005;10(4):43-8. (34) Dewar AL, et al. Imatinib inhibits the in vitro development of the monocyte/macrophage lineage from normal human bone marrow progenitors. Leukemia 2003 Sep;17(9): (35) Steegmann JL, et al. Chronic myeloid leukemia patients resistant to or intolerant of interferon alpha and subsequently treated with imatinib show reduced immunoglobulin levels and hypogammaglobulinemia. Haematologica 2003 Jul;88(7): (36) Cwynarski K, et al. Imatinib inhibits the activation and proliferation of normal T lymphocytes in vitro. Leukemia 2004 Aug;18(8): (37) Dietz AB, et al. Imatinib mesylate inhibits T-cell proliferation in vitro and delayed-type hypersensitivity in vivo. Blood 2004 Aug 15;104(4): (38) Gao H, Lee BN, et al. Imatinib mesylate suppresses cytokine synthesis by activated CD4 T cells of patients with chronic myelogenous leukemia. Leukemia 2005 Nov;19(11): (39) Seggewiss R, et al. Imatinib inhibits T-cell receptor-mediated T-cell proliferation and activation in a dose-dependent manner. Blood 2005 Mar 15;105(6):