CanAg PSA EIA. Prod. No CanAg PSA EIA är avsett för kvantitativ bestämning av Total PSA (Prostata Specifikt Antigen) i humant serum.

Transkript

1 CanAg PSA EIA Prod. No Bruksanvisning Enzymimmunometriskt test kit För 96 bestämningar. AVSEDD ANVÄNDNING CanAg PSA EIA är avsett för kvantitativ bestämning av Total PSA (Prostata Specifikt Antigen) i humant serum. SUMMERING OCH FÖRKLARING AV TESTET PSA är ett enkelkedjat glykoprotein med molekylvikt 32 kda. Proteinet, ett serinproteas med chymotrypsinlik specificitet, utsöndras normalt i seminalvätskan av prostatakörtelns sekretoriska epitel och dess funktion är att klyva proteiner från vesicula seminalis vilket medverkar till likvefiering av seminalkoagel (1, 2). PSA nivåerna i blodet är normalt låga och förhöjda nivåer indikerar prostatasjukdom såsom benign prostatahyperplasi och prostatacancer. Bestämning av PSA används allmänt för upptäckt och behandlingsuppföljning av patienter med prostatacancer och anses vara en överlägsen markör för prostatacancer (3, 8). Man har funnit att PSA bildar stabila komplex med olika antiproteaser och den dominerande fraktionen av PSA i serum föreligger som komplex med 11-antichymotrypsin (PSA-ACT) (4). Det är dock stora individuella skillnader i relationen fritt PSA och PSA-ACT komplex. Studier har visat att proportionen fritt PSA är högre vid benign prostatasjukdom jämfört med prostatacancer (5). Antikropparna som används i CanAg PSA EIA är omsorgsfullt utvärderade och utvalda för att ge samma molära respons för fritt PSA och PSA-ACT komplex (7). CanAg PSA EIA ger därför ett sant totalt PSA värde oberoende av individuella variationer mellan fritt och komplexbundet PSA. 1

2 METODPRINCIP CanAg PSA EIA är en icke kompetetiv, fast-fas baserad immunoassay baserad på den direkta sandwich tekniken. Kalibratorer, kontroller och patientprover inkuberas tillsammans med en biotinylerad anti-psa monoklonal antikropp samt pepparotsperoxidas-märkt anti-psa monoklonal antikropp i Streptavidin beklädda mikrostrips. Efter tvätt tillsätts buffrat Substrat/Chromogen reagens (väteperoxid och 3, 3, 5, 5 tetra-methylbenzidin) till varje brunn. Under enzymreaktionen utvecklas blå färg om antigen finns närvarande. Färgintensiteten är proportionell mot mängden PSA i provet och bestäms i en mikroplatteläsare vid 620 nm (eller alternativt vid 405 nm efter tillsats av of Stopplösning). Kalibreringskurvor konstrueras för varje testomgång genom att plotta absorbansvärdet mot koncentrationen för respektive kalibrator. Patientprovets PSA-koncentration avläses sedan från kalibreringskurvan. REAGENS Varje CanAg PSA EIA kit innehåller reagens för 96 tester. Kitets utgångsdatum är angivet på kit-boxens utsida. Använd ej kitet efter angivet utgångsdatum. Blanda inte reagens från olika kit-batcher. Förvara kitet vid 2 8 C. Får ej frysas. Öppnade reagens är stabila enligt tabellen nedan förutsatt att de inte kontamineras och att de efter första öppnandet förvaras i återförsluten originalförpackning samt hanteras enligt anvisning. Placera kitet i 2-8 C omedelbart efter användning. Komponent Mängd Förvaring och hållbarhet efter öppnande Streptavidin Mikroplatta 1 platta 2 8 C till utgångsdatum angivet på plattan 12 x 8 avbrytbara streptavidinbelagda brunnar. Oanvända brunnar placeras tillsammans med torkmedlet i foliepåsen som noga återförsluts för att hålla brunnarna torra. PSA Kalibratorer 6 flaskor 2 8 C till utgångsdatum angivet på flaskorna 0 g/l 1 x 0.75 ml 1 g/l 1 x 0.75 ml 2 g/l 1 x 0.75 ml 2

3 Komponent Mängd Förvaring och hållbarhet efter öppnande 10 g/l 1 x 0.75 ml 30 g/l 1 x 0.75 ml 60 g/l 1 x 0.75 ml Humant PSA i Tris-HCl buffrad saltlösning innehållande bovint serumalbumin, en inert gul färg samt 0.01% methyl-isothiazolone (MIT) som konserveringsmedel. Färdig att använda. PSA Kontroller 2 vials 2 8 C till utgångsdatum angivet på flaskorna 1 x 0.75 ml 1 x 0.75 ml Humant PSA i Tris-HCl buffrad saltlösning innehållande bovint serumalbumin samt 0.01% methylisothiazolone (MIT) som konserveringsmedel. Färdig att använda. Biotin Anti-PSA 1 x 15 ml 2 8 C till utgångsdatum angivet på flaskan Biotin Anti-PSA monoklonal antikropp från mus, ca. 1 µg/ml. Innehåller fosfatbuffrad saltlösning (ph 7.2), bovint serumalbumin, bovint immunoglobulin, blockerare, Tween 20, en inert blå färg samt 0.01% methylisothiazolone (MIT) som konserveringsmedel. Färdig att använda. Tracer, HRP Anti-PSA 1 x 0.75 ml 2 8 C till utgångsdatum angivet på flaskan Stamlösning av HRP Anti-PSA monoklonal antikropp från mus, ca. 20 µg/ml. Innehåller konserveringsmedel. Skall blandas med Biotin Anti-PSA innan användning. TMB HRP-Substrat 1 x 12 ml 2 8 C till utgångsdatum angivet på flaskan Innehåller buffrad väteperoxid och 3, 3, 5, 5 tetramethyl-benzidin (TMB). Färdig att använda. 3

4 Komponent Mängd Förvaring och hållbarhet efter öppnande Stopplösning 1 x 15 ml 2 8 C till utgångsdatum angivet på flaskan Innehåller 0.12 M saltsyra. Färdig att använda. Tvättkoncentrat 1 x 50 ml 2 8 C till utgångsdatum angivet på flaskan Tris-HCl buffrad saltlösning med Tween 20. Innehåller Germall II som konserveringsmedel. Skall spädas med vatten 25 gånger innan användning. Tecken på instabilitet TMB HRP-Substrat skall vara färglöst eller svagt blåaktigt. Blåfärgning indikerar att reagenset har kontaminerats och skall kasseras. VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER För in vitro diagnostisk användning. Endast för professionellt bruk. Konsultera US Department of Health and Human Services (Bethesda, Md., US) publikation No. (CDC) eller annat tillämpligt nationellt regelverk för anvisningar om laboratoriesäkerhet. Hantera alla patientprover som potentiellt smittsamma. Följ lokala riktlinjer för bortskaffande av avfall. Varning Material med humant ursprung har testats och befunnits negativt för HIV-1 och 2 antikroppar, HCV antikroppar samt hepatit B ytantigen (HBsAg). Eftersom inget test fullständigt kan utesluta ev. blodsmitta skall hantering och bortskaffande av humant material från denna produkt ske som om den vore potentiellt infektiös. 4

5 PROVTAGNING OCH PROVHANTERING CanAg PSA EIA är avsedd att användas med serum. Samla venöst blod och avskilj serum enligt gängse metodik. Prover kan förvaras vid 2 8 C under 48 timmar. För längre tids lagring skall prover förvaras vid - 20 C eller lägre. Prover skall ej förvaras i självavfrostande frys. Låt prover tina långsamt, företrädelsevis vid 2 8 C över natt och låt sedan provet anta rumstemperatur före analys. Prostatamanipulering ger normalt förhöjda nivåer av PSA varför blodprov bör tas innan digital rektal undersökning. Efter kirurgiska ingrepp på prostata såsom nålbiopsi eller transurethral resektion rekommenderas en väntetid > 6 veckor innan prov tas för bestämning av PSA (8). BPH-behandling med Finasteride har visats orsaka sänkta nivåer av PSA (8). PROCEDUR Nödvändigt material och utrustning utöver kitets innehåll 1. Mikroplatteskak Skakfrekvens skall vara moderat till kraftig. Longitudinell skakning med ca 200 slag/min, oscillation /min. 2. Mikroplattetvätt Använd antingen en automatisk platt-tvätt med kapacitet för 1 resp. 6 tvätt-cykler eller en semiautomatisk tvätt ansluten till en vakuumpump eller vattensug med anslutande vätskefälla för uppsamling av vätska. Som alternativ till en automatisk tvätt rekommenderas den manuella tvättaren Nunc Immuno Mikroplattespektropfotometer Läsare för våglängd 620 och/eller 405 nm och absorbansområde 0 till 3,0. 4. Precisionspipetter Med engångsspetsar för dispensering av mikro- resp. millilitervolymer. En 8-kanalspipett eller repeterpipett med engångsspetsar för 100 µl är fördelaktigt men ej nödvändigt. 5. Destillerat eller avjoniserat vatten För beredning av Tvättlösning. Anvisningar 1. Grundlig förståelse av denna bruksanvisning är nödvändig för korrekt användning av CanAg Fri PSA EIA kit. Reagensen i kitet är avsedda att användas som en integrerad enhet. Blanda inte reagens från kit med olika lotnummer. Använd inte kitet efter det utgångsdatum som finns angivet på kitboxens utsida. 2. Reagensen skall anta rumstemperatur (20 25 C) innan användning. För korrekt resultat skall testet utföras vid C. Frysta prover bör långsamt tinas till rumstemperatur och därefter omsorgsfullt blandas. 3. För att underlätta identifiering av prover under och efter analysen är det tillrådligt att märka mikrostripsen innan pipettering av kalibratorer, kontroller och prover påbörjas. 5

6 4. Omsorgsfull tvättning av mikrostripsen är av avgörande betydelse för analysresultatet. Tillse att varje brunn fylls fullständigt samt att uppsugning av vätska från brunnarna mellan och efter tvättstegen är fullständig så att brunnarna blir helt tömda på vätska. Om vätska ändå kvarstår skall plattan vändas upp och ner och omsorgsfullt knackas mot ett absorberande papper. Automatisk mikrostrip-tvätt: Följ tillverkarens anvisningar för underhåll och tvätta angivet antal tvättcykler före och efter varje inkubering. Lämna inte tvättapparaten med Tvättlösning i systemet under längre tider eftersom nålarna då kan sättas igen med försämrad funktion som följd. 5. skall användas när en högkänslig analys önskas. Se Option 2, sid. 8 för fullständig anvisning. 6. TMB HRP-Substrat är mycket känsligt för kontaminering. För optimal stabilitet rekommenderas att substratet hälls over till en noggrant rengjord behållare alt. engångsbehållare i syfte att undvika kontaminering. Använd endast rena pipettspetsar. 7. Använd rena engångsspetsar och en korrekt pipetteringsteknik vid hantering av prover och reagens. Undvik carry-over genom att hålla pipettspetsen strax ovanför mikrobrunnen och undvik att nudda plast- eller vätskeytan. Korrekt pipetteringsteknik är speciellt viktigt vid hantering av TMB HRP- Substrat. Beredning av reagens Stabilitet, beredda reagens Tvättlösning 2 veckor vid 2 25 C vid förvaring i försluten behållare Bered buffrad Tvättlösning genom att hälla upp Tvättkoncentratet (50 ml) i en ren behållare och späda 25 gånger med 1200 ml destillerat eller avjoniserat vatten. Antikroppslösning 3 veckor vid 2 8 C Bered önskad mängd Antikroppslösning genom att blanda 50 µl Tracer, HRP Anti-PSA med 1 ml Biotin Anti- PSA per mikrostrip (se tabellen nedan samt Protokollbladet). Antal Tracer, HRP Anti-PSA Biotin Anti-PSA Strips (µl) (ml)

7 Använd en ren plast- eller glasflaska för beredning av Antikroppslösning. Alternativ: Häll over hela innehållet från Tracer, HRP Anti-Fri PSA till flaskan med Biotin Anti-Fri PSA och blanda försiktigt. OBS: Antikroppslösning är stabil under 3 veckor vid 2 8 C. Bered endast den mängd antikroppslösning som åtgår under denna period och lagra under korrekta betingelser. TESTMETODIK Analysera kalibratorer, kontroller och patientprover i duplikat. En kalibreringskurva skall köras vid varje testtillfälle. Alla reagens och prover skall vara rumstempererade (20 25 C) innan användning. 1. Börja med att bereda Tvättlösning samt Antikroppslösning. Det är viktigt att använda rena behållare. Följ anvisningarna noga. 2. Placera önskat antal mikrostrips i en strip-ram. Placera genast resterande strips i foliepåsen med torkmedel och förslut omsorgsfullt. Tvätta varje strip en gång med Tvättlösning. Tvätta endast det antal strips som kan hanteras inom 30 minuter. 3. Pipettera 50 µl av respektive PSA Kalibrator (CAL 0, 2, 10, 30, 60), Kontroll (C1, C2) och patientprov (unknowns-unk) i mikrostripbrunnarna enligt schema nedan: A B C D E F G H etc Cal Cal Unk Cal Cal etc 0 60 Cal C1 2 Cal C1 2 Cal C2 10 Cal C2 10 Cal Unk1 30 Cal Unk Tillsätt 100 µl Antikroppslösning med hjälp av en 100 µl precisionspipett eller en 8-kanals 100 µl precisionspipett. Undvik carry-over genom att hålla pipettspetsen något ovanför vätskeytan samt genom att undvika att beröra plastytan. 5. Inkubera ramen med mikrostrips under 1 timme (± 10 min) vid rumstemperatur (20 25 C) med konstant skakning på en mikroplatteskak. 6. Tvätta varje strip 6 gånger (se tvättprocedur under anvisningar, punkt 4). 7. Tillsätt 100 µl TMB HRP-Substrat till varje brunn (procedur, se punkt 4 ovan). TMB HRP-Substrat skall tillsättas så snabbt som möjligt och tidsskillnaden mellan första och sista brunnen bör inte överstiga 5 min. 7

8 8. Inkubera 30 min (± 5 min) vid rumstemperatur med konstant skakning. Undvik exponering för direkt solljus. 9. Läs omgående absorbansen vid 620 nm i en mikroplattespektrofotometer. Option 1 I de fall laboratoriet inte har tillgång till en mikroplatteläsare som kan läsa vid 620 nm, kan absorbansen bestämmas enligt nedan: Tillsätt 100 µl Stopplösning. Blanda och läs absorbans vid 405 nm i en mikroplattespektrofotometer inom 15 minuter från tillsats av Stopplösning. Option 2 För högkänslig bestämning av PSA i lågområdet (0-10 µg/l), skall (1 µg/l) inkluderas i kalibreringskurvan. Det är då nödvändigt att utesluta de två högsta kalibratorerna (30 och 60 µg/l). Absorbansmätning skall göras enligt Option 1, men vid 450 nm. Mätområde CanAg PSA EIA mäter koncentrationer mellan 0.1 and 60 µg/l. Om det är förväntat att koncentrationen PSA överstiger mätområdet rekommenderas att provet späds med normalt manligt serum före analys. OBS: Det serum som används för spädning skall också analyseras för bestämning av den endogena koncentrationen PSA (se under Beräkning av resultat ). Kvalitetskontroll PSA Kontroll 1 och 2 bör användas för validering av varje testomgång. Det förväntade resultatområdet finns angivet på respektive flasketikett. Om värden utanför det förväntade området erhålls bör en fullständig genomgång av reagensen samt läsarens prestanda utföras och analysen sedan upprepas. Laboratoriet kan som komplement tillverka egna serum-preparationer på olika nivåer, vilka kan användas som interna kontroller för att säkerställa testets precision. Referensmaterial 1 st International Standard 96/670 kan användas som referensstandard. Angivna koncentrationer för PSA Kalibratorer och kontroller har åsatts genom kalibrering mot en intern uppsättning referensstandarder, spårbara till den Internationella standarden 96/670. 8

9 BERÄKNING AV RESULTAT Vid användande av mikroplatteläsare med inbyggt beräkningsprogram hänvisas till läsarens bruksanvisning för programmering och resultatberäkning utgående från koncentrationerna angivna på respektive etikett PSA Kalibrator. För automatisk beräkning av PSA resultat rekommenderas följande metoder: Cubic spline kurvanpassningsmetod. Kalibrator 0 skall ingå i kurvan med värde 0 µg/l. Spline smoothed kurvanpassningsmetod. Kalibrator 0 skall användas som plattblank. Interpolering med punkt-till-punkt utvärdering. Kalibrator 0 skall inkluderas i kurvan med värde 0 µg/l. Quadratic kurvanpassningsmetod. Kalibrator 0 skall ingå i kurvan med värde 0 µg/l. OBS: 4-parametric eller linjär regression skall inte användas. För manuell utvärdering konstrueras en kalibreringskurva genom att plotta absorbansen (A) för respektive kalibrator mot motsvarande PSA koncentration (i µg/l), se bild nedan. Okända koncentrationer PSA kan sedan avläsas från kurvan baserat på uppmätt medel-absorbans för respektive prov. Exempel Prov Kalibrator Medel abs PSA värden värde (A) (µg/l) 0 µg/l µg/l µg/l µg/l µg/l Prov A Prov B

10 Exempel (använd inte denna kurva för beräkning av verkliga resultat). Beräkning av resultat för spädda prover Om prover vid inledande analys ger högre koncentration PSA än 60 µg/l skall proverna spädas 1/10 med normalt manligt serum och återanalyseras för bestämning av korrekt koncentration PSA. OBS: Provet som används för utspädning skall också analyseras för bestämning av dess endogena koncentration av PSA. Koncentration PSA i det ospädda provet beräknas sedan enligt nedan: Spädning 1/10: 10 x ([PSA] Spätt prov -(0.9x [PSA] Normalt manligt serum )) METODENS BEGRÄNSNINGAR Halt PSA skall inte användas som bevis för närvaro eller frånvaro av malign sjukdom. Testresultat skall tolkas endast mot bakgrund av andra undersökningar och procedurer för diagnos och omhändertagande av patienten. Test för PSA skall inte ersätta etablerade kliniska undersökningar. Kalibratorerna som ingår i kitet CanAg PSA EIA skall inte användas för metodstudier för recovery. Här rekommenderas istället användning av ett förhöjt patientprov. Förekomst av anti-reagens antikroppar (human anti-mouse antibody (HAMA) eller heterofila antikroppar) i patientprovet kan interferera med testet trots att bufferten innehåller tillsats av specifika blockerande substanser. FÖRVÄNTADE RESULTAT För friska män förväntas att halten PSA är lägre än 4 µg/l. Eftersom nivån av PSA ökar med åldern har användning av ålders-specifika referensområden för PSA föreslagits i syfte att dels öka känsligheten hos yngre män samt även öka specificiteten hos äldre män (6, 8). Vi rekommenderar att varje laboratorium upprättar sitt eget referensområde med hänsyn tagen till sådana lokala omgivningsfaktorer som diet, klimat, levnadsförhållanden, patienturval, etc. 10

11 KARAKTÄRISTISKA PRESTANDA Dos-respons och precisionsprofil En typisk kalibreringskurva och precisionsprofil erhållen med CanAg PSA EIA visas nedan. Precisionsprofilen är baserad på analys av slumpmässigt placerade kalibratorer i en mikroplatta, n=10. Precision Totalprecision beräknades enligt NCCLS riktlinje EP5-A (9) baserat på analyser av fruset humanserum med tillsatt PSA på fyra olika nivåer och med användande av sex olika CanAg PSA EIA reagenskombinationer. Varje prov pipetterades på slumpmässigt utvalda platser på plattan (n=2/analys) och analyserades två gånger per dag under totalt 20 dagar. Prov Replikat Medel g/l) Within-run SD ( g/l) Within-run CV % Between-day SD ( g/l) Between-day CV % PSA PSA PSA PSA Detektionsgräns Detektionsgränsen för CanAg PSA EIA är < 0,1 µg/l definierat som koncentrationen motsvarande medelabsorbans för PSA kalibrator 0 plus två standardavvikelser enligt formeln: 2 x SD CAL 0 OD CAL 2 - OD CAL 0 x 2 g/l 11

12 Utbyte (recovery) Spetsade serumprover tillverkades genom att tillsätta portioner av prover med förhöjd halt PSA till normalt manligt serum. Det analyserade utbytet av tillsatt antigen var inom + 10% av förväntat. OBS: Utbytesstudier skall inte utföras med kitets kalibratorer. Hook Ingen hook har noterats för prover upp till µg/l. OBS: I mycket höga prover kan substratets färg ändras från blått till grönaktigt (och eventuellt i extrema fall till gult). Detta leder till falskt låg absorbans vid 620 nm och i extrema fall kan absorbansen hamna inom kalibreringskrvans område och då noteras som en hook. Linjäritet Patient prover späddes med normalt manligt serum och analyserades. Erhållna värden var inom + 10 % av förväntade värden. Specificitet CanAg PSA EIA är baserad på två monoklonala antikroppar från mus, PSA10 och PSA66, riktade mot två olika epitoper exponerade både i PSA-ACT komplexet och på fri PSA. Denna kombination av antikroppar genererar ett test med ekvimolär respons för Fri PSA och PSA-ACT komplexet (7). NCCLS riktlinje EP7-P (10) användes för att bestämma möjliga källor till interferens. Följande substanser och koncentrationer testades och befanns ej interfererande: Koncentration utan signifikant (± 10%) interferens Lipemia (Intralipid ) Bilirubin, unconjugated Hemoglobin 10 mg/ml 0.6 mg/ml 5 mg/ml Metodjämförelse CanAg PSA EIA (Prod. No ) jämfördes med två-stegsmetoden CanAg PSA EIA (300-10). Serumprov från 308 män med värden mellan 0-53 µg/l analyserades och linjär regressionsanalys av resultaten visade: [PSA] Prod. No = 0.92 x [PSA] Prod. No r =1.00 GARANTI Här redovisade prestanda erhölls med den angivna testmetodiken. Alla förändringar eller modifieringar av testmetodiken som ej rekommenderats av Fujirebio Diagnostics kan påverka testresultaten och Fujirebio Diagnostics frånsäger sig allt ansvar för sådan användning av produkten. 12

13 REFERENSER 1. Wang MC, Valenzuela LA, Murphy GP, Chu TM (1979). Purification of a human prostate specific antigen. Invest Urol 17: Lilja H. (1985). A kallikrein-like serine protease in prostatic fluid cleaves the predominant seminal vesicle protein. J Clin Invest 76: Oesterling JE (1991). Prostate specific antigen: A critical assessment of the most useful tumor marker for adenocarcinoma of the prostate. J Urology 145: Lilja H., Christensson A., Dahlén U., Matikainen M-T, Nilsson O., Pettersson K., Lövgren T. (1991). Prostate-specific antigen in serum occurs predominantly in complex with 1 -antichymotrypsin. Clin Chem 37: Christensson A., Björk T., Nilsson O., Dahlén U., Matikainen M-T., Cockett ATK, Abrahamsson PA, Lilja H. (1993). Serum prostate specific antigen complexed to 1 -antichymotrypsin as an indicator of prostate cancer. J Urology 150: Oesterling JE., Cooner WH., Jacobsen SJ., Guess HA., Lieber MM. (1993). The influence of patient age on the serum prostate specific antigen concentration: An important clinical observation. Urol Clin North Am 20: , 1993a. 7. Nilsson O., Peter A. Andersson I., Nilsson K., Grundström B., and Karlsson B. (1997) Antigenic determinants of prostatespecific antigen (PSA) and development of assays specific for different forms of PSA. Br J Cancer 75(6): P Price C., Allard J., Davies G., Dawnay A., J Duffy M., France M., Mandarino G., Milford Ward A., Patel B., Sibley P. and Sturgeon C. Pre-and post-analytical factors that may influence use of serum prostate specific antigen and its isoforms in a screening programme for prostate cancer. Ann Clin Biochem 2001; 38: National Committee for Clinical Laboratory Standards, Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices. Approved Guideline EP5-A (1999). 10. National Committee for Clinical Laboratory Standards, National Evaluation Protocols for Interference Testing, Evaluation protocol Number 7, Vol. 6, No 13, August (1986) 13

14 CanAg är ett varumärke registrerat av Fujirebio Diagnostics AB Fujirebio Diagnostics AB Elof Lindälvs gata 13 PO Box SE Göteborg Sweden Phone Fax info@fdab.com CanAg PSA EIA Prod. No SE, F5741, r3 14