Reagens för kvantitativ bestämning in-vitro av hemoglobin A1c (HbA1c).

Transkript

1 1 Reagens för kvantitativ bestämning in-vitro av hemoglobin A1c (HbA1c). 2004/06/02 A93A01058 E A11A01702 Klinisk betydelse (1,7) HbA1c har sitt ursprung i den icke-enzymatiska fixeringen av den N- terminala delen av -kedjan hos hemoglobin A0. HbA1c-nivån står i proportion till blodglukosnivån och speglar den genomsnittliga dagliga glukoskoncentrationen under de senaste två månaderna före provtagningstillfället. Nyligen genomförda studier har visat att regelbundna mätningar av HbA1c kan leda till förändringar i behandlingen av diabetes och till förbättrad metabolisk kontroll genom en minskning av HbA1c-värdena. Denna metod för in vitro-diagnostik används således för kvantitativ bestämning av hemoglobin A1c (HbA1c), en markör för diabetes, i humant blod. Mätningar som erhålls med denna procedur kan användas för långsiktig diabeteskontroll. Metod HbA1c uttrycks som en procent av det totala hemoglobininnehållet. För att kunna bestämma THb-koncentrationer med spektrofotometri, måste de olika formerna av hemoglobin omvandlas till endast en form som har samma absorptionsspektrum. De värden för HbA1c och totalt hemoglobin (THb) i mol som erhålls med testet används för beräkning av HbA1c/THb-förhållandet och de enskilda värdena får inte användas för diagnos. Princip (8): Koncentrationerna av HbA1c och totalt hemoglobin mäts och förhållandet anges i procent av HbA1c. Fem reagenser används för att bestämma HbA1c i procent: Antibody Reagent (R1) spädd med Diluent I (R5), Agglutinator Reagent (R2), Hemolysis Reagent (R3) och Total Hemoglobin Reagent (R4). Helblodprovet blandas för hand med Hemolysis Reagent(R3) (1 volymer blandas och 40 volymer R3): De röda blodkropparna lyseras och hemoglobinkedjan hydrolyseras genom inverkan av proteas som finns i reagenset. Total Hemoglobin Reagent (R4) används för att bestämma totalt hemoglobin. Metoden baseras på omvandling av alla former av hemoglobin till alkalisk hematin i en alkalisk lösning av icke-jonisk detergent på det sätt som Wolf et al. har beskrivit den ursprungliga proceduren. Reaktionen stoppas genom tillsats av ett blodprov som förbehandlats med Total Hemoglobin Reagent (R4), vilket ger en grönfärgning av lösningen. Omvandlingen av de olika hemoglobintyperna till alkaliskt hematin med ett definierat absorptionsspektrum gör det möjligt att beräkna koncentrationen av totalt hemoglobin. Hemoglobinet mäts med en ändpunktsmetod vid 600 nm. 1 x 110 ml 1 x 38 ml 1 x 25 ml ABX Diagnostics BP Montpellier cedex 4 - France Hemoglobinkoncentrationen är direkt proportionell till ökningen av absorbansvärdet. Ett latexagglutinationshämningstest används för att mäta specifikt HbA1c. Ett agglutinin (syntetisk polymer innehållande en multipel av den immunreaktiva delen av HbA1c) orsakar agglutination av latexpartiklarna som är klädda med monoklonala (mus) antikroppar specifika för HbA1c. Om HbA1c inte förekommer i provet, agglutinerar agglutininet i Agglutinator Reagent (R2) och de med Antibody Reagent (R1) klädda mikropartiklarna. Agglutinationen leder till en ökning av suspensionens absorbans. Förekomst av HbA1c i provet minskar agglutinationshastigheten eftersom HbA1c konkurrerar med Agglutinator Reagent (R2) om mikropartiklarnas antikroppsbindningsställen. Ju större mängd HbA1c som finns i provet, desto lägre blir agglutinationshastigheten. Reaktionen mäts genom absorbans vid 600 nm och agglutinationshastigheten används för beräkning av koncentrationen från en standardkurva. HbA1c i procent beräknas därefter med hjälp av värdena för HbA1c och totalt hemoglobin i mol.

2 Reagenser ABX Pentra HbA1c WB är en sats innehållande flera reagenser. Förpackningen innehåller: Reagens 1: Antibody Reagent Reagens 2: Agglutinator Reagent Reagens 3: Hemolysis Reagent Reagens 4: Total Hemoglobin Reagent Reagens 5: Diluent I 1 x 110 ml 1 x 38 ml 1 x 25 ml Antibody Reagent (R1) innehållande: partiklar klädda med antikroppar (mus) mot HbA1c, bovint serumalbumin, buffert, ytaktiva ämnen, konserveringsmedel. Agglutinator Reagent (R2) innehållande: kovalent polymerbindande hapten, bovint serumalbumin, buffert, konserveringsmedel, ytaktivt ämne. Hemolysis Reagent (R3) innehållande: pepsin från svin, buffert, konserveringsmedel. Reagenset kan även tillhandahållas separat, referensnummer A11A Total Hemoglobin Reagent (R4) innehållande: natriumhydroxid, ytaktivt ämne. Vid hemolysering spädes både prover och kontroller 1:41 med Hemolysis Reagent (R3). Blanda försiktigt (undvik skumbildning) och låt stå i fem minuter i rumstemperatur (tills en grönaktig färgning erhålls) innan testet utförs i instrumentet. Använd omvänd pipettering för prover av helblod. Kalibrator För kalibrering används: ABX Pentra HbA1C WB Cal, ref. A11A01703 (medföljer ej) 1 x 8 ml + 5 x 2 ml Totalt hemoglobin kalibreras med ABX Pentra HbA1c WB Cal (CAL 1) med hjälp av ett målvärde för totalt hemoglobin. Kalibratorer och reagenser är inte satsberoende och de genomgår en intern kvalitetskontroll vid ABX. Kalibrering av HbA1c-metoden utförs med hjälp av ABX Pentra HbA1c WB Cal, som innehåller sex kalibratornivåer för HbA1c. Dessa kalibreringsprocedurer överensstämmer med NGSP/DCCTcertifieringen. Placering av kalibratorerna i provracket (calibrator sample rack): Diluent I (R5) innehållande: konserveringsmedel, NaCl. ABX Pentra HbA1c WB ska användas i enlighet med denna reagensbipacksedel. Om anvisningarna inte följs kan ABX Diagnostics inte garantera dess prestanda. Hantering Antibody Reagent (R1): 1. Blanda 3 delar Antibody Reagent (R1) med 2 delar Diluent I (R5) 2. Låt blandningen stabiliseras i cirka en timme i det kylda facket i ABX Pentra 400 före den första användningen. Alla övriga reagenser Agglutinator Reagent (R2), Hemolysis Reagent (R3) och Total Hemoglobin Reagent (R4) levereras som bruksfärdiga lösningar. 1. Blanda reagenset försiktigt genom att vända det och häll det sedan i en bägare. 2. Låt reagenserna stabiliseras i rumstemperatur i det kylda facket i ABX Pentra 400 före användning. Se diagram nedan (sektor B och C visas som exempel): Total Hemoglobin Reagent Reagens 4 Agglutinator Reagent Reagens 2 Antibody Reagent Reagens 1 (spä ut) 1. CAL 1 (200 l) 2. fysiologiskt vatten 3. CAL 2 (150 l) 4. CAL 3 (150 l) 5. CAL 4 (150 l) 6. CAL 5 (150 l) 7. CAL 6 (150 l) Obs: Positionen för CAL 1 har använts som exempel, CAL 1 kan även placeras i position 8, 9 eller 10. Kontroll För intern kvalitetskontroll används: ABX Pentra HbA1C WB Control, ref. A11A01704 (medföljer ej) Normal kontroll: 2 x 0,25 ml (frystorkat material) Patologisk kontroll: 2 x 0,25 ml (frystorkat material) Varje kontroll ska analyseras dagligen och/eller efter varje kalibrering. Kontrollfrekvensen och konfidensintervallen bör motsvara riktlinjerna för laboratorier och landsspecifika föreskrifter. Resultaten måste ligga inom intervallet för de definierade konfidensgränserna. Varje laboratorium bör upprätta en metod som ska följas om resultaten överskrider dessa konfidensgränser. S.A. au capital de RCS Montpellier SIRET APE 332 B

3 Material som behövs men ej medföljer Automatiskt kliniskt kemiskt analysinstrument Vanlig laboratorieutrustning fysiologiskt vatten Prov (9) Kapillär- eller venblodprover kan användas med denna metod. Godkända antikoagulanter är kaliumetylendiamintetra-ättiksyra (K2-EDTA) och ammoniumheparin (NH 4 -heparin). Helblodprover som tagits i K 2 -EDTA eller NH 4 -heparin kan förvaras i 70 C i upp till sex månader, i 5 C i upp till två veckor eller i 25ºC eller varmare i upp till en vecka. Frusna prover ska tinas i rumstemperatur och sedan blandas försiktigt före användning. Blanda blodprover försiktigt omedelbart innan analysen utförs så att riktiga THb-resultat säkerställs. Normalintervall (4,11,13,14) Varje laboratorium ska verifiera att dess standardvärden överensstämmer med NGSP-referensvärdena. Denna teknik har NGSP-certifierats med 4 6% HbA1c som ett standardvärde hos icke-diabetiker med ett terapeutiskt mål att erhålla värden 7% enligt rekommendationer från ADA (American Diabetes Association). Alla patientresultat ska tolkas mot bakgrund av de kliniska undersökningarna av patienten. Metodens begränsningar (10): De flesta patienter har hemoglobinnivåer på mellan 4,4 mmol/l och 14,4 mmol/l. Specialistpublikationer har emellertid visat att hemoglobinnivåerna för patienter med svår anemi kan underskrida 4,4 mmol/l och att hemoglobinnivåerna för patienter med polycytemi kan överskrida 14,4 mmol/l. Prover från patienter som har dessa symtom måste testas med en annan metod om deras hemoglobinvärden ligger utanför mätområdet. Tillstånd som påverkar de röda blodkropparnas livscykel (som till exempel hemolytisk anemi eller andra hemolytiska sjukdomar, graviditet eller betydande blodförlust etc.) leder till en minskning i exponeringen av dessa celler för glukos och följaktligen till en nedgång i de procentuella nivåerna glykerat hemoglobin (Ghb). Ghb %-resultat är inte tillförlitliga hos patienter som lider av kronisk blodförlust och därmed av skiftande erytrocytlivscyklar. Prover som innehåller hemoglobin C och S kan, vid analys med denna metod, leda till en ökning på upp till 40 % av det förväntade HbA1cvärdet. Prover som innehåller höga nivåer hemoglobin F (över 10 %) kan ge HbA1c-resultat som är lägre än de som förväntas med denna metod. Resultat för hemoglobin A1c som erhålls med detta test för blodprover som innehåller formerna S, C och F (över 10 %) ska därför inte jämföras med normala eller onormala publicerade värden. Det har påvisats att prover som innehåller hemoglobin E inte interfererar med mätningen av HbA1c när denna metod används. Interferenser från karbamylerade eller acetylerade hemoglobiner har inte testats för detta reagens. Den labila glykerade hemoglobinfraktionen (Schiffbasen till hemoglobin A eller A1c) påverkar inte resultaten eftersom antikroppen är specifik för stabil ketoamin. Förvaring och stabilitet Skyddas mot extrem värme, ljus och frost. Reagensets hållbarhet (i oöppnad och öppnad förpackning): Reagenserna är stabila till det utgångsdatum som anges på etiketten om de förvaras i 2 8 C i originalförpackningen och skyddas mot kontaminering. Analysmetod Testanvisningar för andra automatiska instrument än ABX Pentra 400 kan erhållas på begäran. Avfallshantering Följ gällande föreskrifter. Allmänna försiktighetsåtgärder 1. Reagenset är endast avsett för yrkesmässig in vitro-diagnostik. 2. Antibody Reagent (R1) : Komponenter av humant ursprung har använts vid beredningen av denna produkt. Varje blodgivare har testats med avseende på hepatit B (HBsAg) ytantigen och hepatit C (HCV) samt antikroppar mot humant immunbristvirus (HIV-1 och HIV-2). Testerna gav negativa resultat (ingen upprepad reaktivitet). Försiktighet: Eftersom inget test fullständigt kan garantera frånvaro av HIV-, hepatit B- eller C-virus eller andra infektiösa agens, ska produkterna behandlas som potentiellt infektiösa humana blodprover. Följ riktlinjerna från medicinska myndigheter vid exponering. 3. Agglutinator Reagent (R2) : Irriterande. 4. Antibody Reagent (R1), Agglutinator Reagent (R2), Hemolysis Reagent (R3), Total Hemoglobin Reagent (R4): Undvik kontakt med ögonen, huden och kläderna. Tvätta händerna noga med vatten efter hantering av produkten. Får inte förtäras. 5. Diluent I (R5): Irriterande. R36/38: Kan orsaka irritationer på ögon och hud. R43: Kan ge allergi vid hudkontakt. 6. Reagensflaskorna ska kasseras efter användning. 7. Ytterligare information finns i det varuinformationsblad som hör till reagenset.

4 Prestanda på ABX Pentra 400 De prestanda som anges nedan är bestämda på analysatorn ABX Pentra 400. Antal test: 345 test Hållbarhet för rekonstituerad latexlösning: Den rekonstituerade latexlösningen är hållbar i 2 månader om den förvaras i 2 8 C efter rekonstituering. Använd endast den erforderliga mängden och sätt tillbaka reagenserna i kylskåpet omedelbart efter användning. Provvolym (efter behandling): Hb: 25 l/test HbA1c: 2,5 l/test Detektionsgräns: Detektionsgränsen har bestämts enligt Valtec-protokollet (15) och uppgår till 1,22 mol/l för totalt hemoglobin. Noggrannhet och precision: Repeterbarhet (precision inom körning) 3 prover med låg, medelhög och hög koncentration och 2 kontroller analyseras 20 gånger enligt rekommendationerna i Valtec-protokollet (15). Medelvärde % Variationskoefficient % Normal kontroll 5,32 1,17 Patologisk kontroll 10,33 0,92 Prov 1 5,54 1,39 Prov 2 8,46 1,04 Prov 3 12,16 1,21 Reproducerbarhet 2 prover med låg och hög koncentrationsnivå och 2 kontroller analyseras med dubbelprover i 20 dagar (2 serier per dag) enligt rekommendationerna i NCCLS, EP5-A-protokollet (16). Medelvärde % Variationskoefficient % Normal kontroll 5,70 2,46 Patologisk kontroll 11,18 1,92 Prov 1 5,77 2,37 Prov 2 12,75 2,74 Linjäritet och mätintervall: Reagenslinjäriteten bestäms enligt rekommendationerna i NCCLS, EP6- P-protokollet (17). Låg linjäritet: för totalt hemoglobin: 5 mol/l för HbA1c: 1,34 mol/l Hög linjäritet: för totalt hemoglobin: 125 mol/l för HbA1c: 7,80 mol/l Obs: Om koncentrationen av HbA1c är högre än den högsta kalibratorn (7,80 mol/l) ska provet inte spädas. Beräkna det högsta möjliga värdet i enlighet med koncentrationen av totalt hemoglobin och ange värdet högre än.... Exempel: om koncentrationen av totalt hemoglobin som fastställts av instrumentet är 54,00 mol/l, beräknas värdet: 7,80/54,00 x 100 = 14,44% av HbA1c. Resultatet blir : högre än 14,44% av HbA1c. Korrelation: 99 patientprover korrelerades med ett kommersiellt reagens som referens i enlighet med rekommendationerna i protokollet NCCLS, EP9- A (18). Ekvationen för den allometriska linjen som erhålls är följande: Y = 1,09 x + 0,32 med en korrelationskoefficient r 2 = 0,976. Interferenser: Triglycerider: Ingen betydande påverkan har observerats upp till 7 mmol/l Totalt bilirubin: Ingen betydande påverkan har observerats upp till 353 mol/l Direkt bilirubin: Ingen betydande påverkan har observerats upp till 368 mol/l Glukos: Ingen betydande påverkan har observerats upp till 167 mmol/l Kalibreringsstabilitet: Reagenset kalibreras dag 0. Kalibreringsstabiliteten kontrolleras genom analys av 2 kontrollprover. Kalibreringsstabiliteten är 4 veckor. Obs: En ny kalibrering rekommenderas vid byte av reagenssats, vid byte av latexsuspension eller när resultatet av kvalitetskontrollen ligger utanför det intervall som fastställts. Kvot: Y = (100*9319*X-3957)/10000 Programvaruversion: 4.00 Varning Användaren är skyldig att kontrollera att detta dokument är tillämpligt för det reagens som används. Referenser 1. Mayer TK and Freedman ZR: Protein glycosylation in diabetes mellitus: A review of laboratory measurements and of their clinical utility. Clin. Chim. Acta 127; (1983). 2. Baynes JW.Bunn HF, Goldstein DE, et al : National Diabetes Group; Report of the expert committee on glucosylated hemoglobin. Diabetes Care 7; (1984). 3. Koenig RJ, Peterson CM, Kilo C. et al: Hemoglobin A1c as an indicator of the degree of glucose intolerance in diabetes. Diabetes 25; (1976). 4. Nathan DM, Singer DE, Hurxthal K, and Goodson JD: The clinical information value of the glycosylated hemoglobin assay. NE J. Med. 310; (1984). 5. McCarren M: DCCT; and it works: Intensive therapy reduces the risk of diabetic eye, kidney, and nerve disease. Diabetes forecast (September 1993). 6. Larsen ML, Horder M, and Mogensen EF: Effect of long-term monitoring of glycosylated hemoglobin levels in insulindependent diabetes mellitus. NE. J. Med. 323; (1990). 7. Nathan DM: Hemoglobin A 1c. Infatuation or the real thing? NE. J. Med. 323; (1990). S.A. au capital de RCS Montpellier SIRET APE 332 B

5 8. Wolf HU, Lang W, and Zander R; Alkaline haematin D-575, a new tool for the determination of haemoglobin as an alternative to the cyanhaemoglobin method. Clin. Chim. Acta. 136; (1984). 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Skin Puncturethird edition; approved standard. NCCLS publication H4-A3. Villanova, PA: NCCLS; Knowles BJ, Haigh WB, and Michaud GC: A monoclonal antibodybased immunoassay for hemoglobin A 1c. Diabetes 35; Supplement: 94A (1986). 11. Goldstein DE, Little RR, Wiedmayer HM, et al: Glycated hemoglobin: Methodologies and clinical applications Clin. Chem. 32; (1986). 12. Ellis G. Diamandis EP, Giesbrecht EE, et al. An automated «high pressure» liquid chromatographic assay for hemoglobin A 1c. Clin. Chem. 30: (1984). 13. Burtis CA and Ashwood ER, eds: Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2 nd edition, WB Saunders Company, Philadelphia, PA. p.2021 (1994). 14. Diabetes Care 2002; 25 (suppl. 1); Vassault A., Grafmeyer D. Naudin C. et al., Protocole de validation de techniques (document B), Ann. Biol. Clin., 1986, 44, Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices, Approved Guideline, NCCLS document EP5-A, Vol. 19, No. 2, february Evaluation of the Linearity of Quantitative Analytical Methods, Proposed Guideline, NCCLS document EP6-P, Vol. 6, No. 18, september Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples, Approved Guideline, 2 nd ed., NCCLS document EP9-A2, Vol. 22, No. 19, 2002.