Validation of a tetraplex assay for detection of antibodies in poultry serum using Luminex 200 platform. Nasteho Ismail Awale

Transkript

1 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi. Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15hp, vårterminen 2011 Validation of a tetraplex assay for detection of antibodies in poultry serum using Luminex 200 platform. Nasteho Ismail Awale Handledare: Dr Neil Leblanc Enheten för Virologi, Immunologi och Parasitologi (VIP) Statens veterinärmedicinska anstalt (SVA) Uppsala, Sweden 1

2 ABSTRACT. Background: As a part of a national health control program, Statens Veterinärmedicinska Anstalt performs diagnostics to screen flocks for certain pathogens causing high mortality, morbidity and/or serious economical losses. There are several viruses in the program including IBDV (infectious bursal disease virus), IBV (infectious bronchitis virus) and NDV (Newcastle disease virus). Method: 96 serum samples were collected from different poultry flocks in Sweden and analyzed by ELISA, which are currently used in the health control program as well as by a commercial prototype of a multiplex immunoassay manufactured by Luminex Corp., which is currently under evaluation at the United States Department of Agriculture USDA. This 4-plex assay detects antibodies for the three above-mentioned viruses as well as antibodies of avian reovirus. In the context of this study the ELISAs run in routine diagnostics as well as a REO ELISA were used as the standard for comparison. Result: The antibody concentration in serum from vaccinated chickens was high while the antibody concentration level in serum from not vaccinated chickens was low. There was a good correlation between the multiplex assay and ELISA. Conclusion: The results obtained in this study indicate that the Luminex multiplex assay tested has the potential to be used routinely for screening flocks. Keywords: Luminex, antibody detection for viral disease, immunobead-based assay, ELISA. 2

3 INTRODUKTION: Produktionen och konsumtionen av fjäderfäprodukter (ägg och kycklingkött) ökar över hela världen lika snabbt som de växande utbrotten av infektionssjukdomar. Det finns många olika virussjukdomar som kan drabba fjäderfä, vissa av dem är mycket smittsamma. När de förekommer som utbrott kan hälsan av stort antal fåglar påverkas vilket innebär en minskning och enorma förluster för produktionen. Dessa utbrott har en negativ inverkan på fjäderfähållning och kräver därmed snabba åtgärder som karantän och restriktioner i handeln. I Sverige övervakas fjäderfähälsan genom hönshälsokontrollprogram som har till syfte att övervaka sjukdomsläget samt förebygga och bekämpa eventuella sjukdomar. Programmet syftar också till att de krav som ställs inom EU vid handel ska uppfyllas 1. Både infektiös bronkit, infektiös bursit och Newcastlesjukan innehåller de smittämnen som ingår i programmet och ska därmed bekämpas. Detta innebär att fjäderfäflockar i Sverige måste testas för dem varje år. Infektiöst bursitsjukevirus (IBDV), även kallad Gumboros sjukdom är mycket smittsamt och infekterar unga kycklingar (Cheville et al, 1967). Viruset tillhör släktet Birnavirus av familjen Birnaviridae och innehåller två delar dubbelsträngat RNA. Förutom döden och minskad tillväxt av kycklingarna leder sjukdomen också till svår immunsuppression som gör kycklingar mottagliga för andra patogener. Infektiös bronkit(ib) är en av världens mest förlustbringande virussjukdomar i äggproduktionen. Sjukdomen orsakas av coronavirus och drabbar kycklingar i alla åldrar. Det påverkar främst andningsvägarna och urogenitalsystemet. Sänkt äggproduktion med försämrad äggkvalitet i form av skalförändring och äggviteförändring karakteriserar ägg från IB-infekterade höns

4 Newcastlesjukans virus (NDV) smittar lätt och är en virussjukdom som leder till döden och drabbar de flesta fågelarter. Sjukdomen överförs genom direkt kontakt med smittade fåglar eller symptomlösa virusbärare. Även kontaminerade kläder, transportlådor och foder kan sprida smittan. Newcastlesjukans virus angriper luftvägarna, centrala nervsystemet och magtarmsystemet (Alexander et al., 2000). Totalt tio utbrott hos fjäderfä har inträffat och diagnostiserat i Sverige sedan Sjukdomen är anmälningspliktig och bekämpas därför enligt epizootilagen som innebär att alla djur avlivas och destrueras, en så kallad stamping out. I Sverige vaccineras inte fjäderfä mot Newcastlesjuka. Reovirus är ett utbrett virus som drabbar unga fåglar och kycklingar. Det orsakar viral artrit och malabsorbtion. Detta virus ingår inte i det ordinarie programmet i Sverige men är mycket förekommande i andra delar av världen. Vaccinering anses vara ett effektivt sätt att förebygga och kontrollera smittsamma virussjukdomar. Ett annat sätt, som tidigare nämnts, att få bukt med smittämnena är genom "stampingout" vid sjukdomsutbrott. I Sverige används både vaccination och stamping out - metoderna för fjäderfä. I Sverige vaccineras fjäderfä mot IB virus, IBD- virus och reovirus medan NVD-virusutbrott åtgärdas med stamping out -metoden. Varje år får SVA tusentals serumprover som samlats in från vaccinerade kycklingar i olika fjäderfäbesättningar i Sverige för att bestämma och utvärdera serologiskt immunsvar efter vaccination eller för att kontrollera exponering för viruset. ELISA (enzyme- linked immunosorbent assay) är en analysteknik som används för att kvantifiera och påvisa närvaro av antikroppar/antigen. Det är en säkrare och mer utvecklat alternativ till den radioimmunologisk analys metoden som fanns före ELISA. Denna metod använde radioaktivitet för märkning och detektering av reaktionsmaterialet. För närvarande är ELISA den metod som används vid SVA för att fastställa antikroppsnivåer, både för kontroll 4

5 av vaccinet och exponering för viruset. Trots att flera metoder finns för påvisande av antikroppar i serum vid SVAs avdelning för veterinär diagnostik för övervakning används ELISA för att påvisa cirkulerande antikroppar mot IBD-virus, IB-virus, ND-virus och reovirus. Men denna teknik har vissa begränsningar eftersom den bara mäter en analyt en tid och kräver relativt stor provvolym. Den senaste tidens utveckling av Luminex xmap- teknik som bygger på flödescytometri och mikrosfärer bundna med fångstantikroppar tillåter kvantifiering av multipla antikroppar i en enda liten provvolym. Denna analys har väckt förhoppningar om att många av ELISAs begränsningar kan övervinnas. Luminex 200 teknik (Luminex, Austin, TX) är en kvantitativ flödescytometribaserat system som gör det möjligt att testa ett enda prov för många olika analyter samtidigt. Metoden började användas i slutet av 90-talet och en enorm utveckling skedde under åren Luminex 200-systemet är en etablerad teknik för multiplexa analyser av proteiner (Waterboer et al. 2006) och nukleinsyror (Dunbar, 2006). Designen är baserad på flödescytometri, mikrosfärer, laser, digital signalbehandling och traditionell kemi. I systemet ingår Luminex 200- instrument, Luminex XY- plåthanteringsplattform, vätskeleveranssystem, xponent 3,1 programvara och PC. Luminexmaskinen är ungefär lika stor som en stationär dator, med en 20 L- tank för systemets vätska. Byggd på en flexibel, öppen design, kan den konfigureras att utföra en mängd olika biologiska testsystem. Den har kapacitet att skilja minst 1 till högst 100 unika uppsättningar xmap mikrosfärer i ett enda prov, dvs 100-Plex förmåga. Luminex plattformen kan samtidigt upptäcka proteiner mellan 6 och 150 kda i så lite som 50 µl prov (de Jager et al., 2006). Korrekt utförda analyser kan ge snabba resultat som har känslighet och specificitet som motsvarar eller överstiger standardtester (Das et al, 2006; Prins et al, 2006; Schmitt et al, 2006). Tekniken använder en 5,6 µm diameters polystyrenmikrosfär. Kulorna är internt färgkodade av fluorokromer och är preparerade med kovalent bundna monoklonala antikroppar specifika för en viss biologisk 5

6 reaktant. Reagenserna kan vara antigen, antikroppar, oligonukleotider, enzymer, substrat eller receptorer (Kellar et al., 2002). I vårt experiment var mikrosfärerna belagda med fångstantikroppar som var bundna på mikrosfären via en amidbindning (Carson et al., 1999). Kvantifiering av analyterna uppnås genom tillägg av detektionsantikropp som är biotinylerad och binder till analyten på en sekundär plats. Tillägget av ett streptavidin-fykoerytrin (SA-PE) konjugat möjliggör detektion med laser. Systemet använder två lasrar, en klassificeringslaser som identifierar mikrosfärklassen och en reporterlaser som exciterar de fluorescerande molekylena på reporternmolekylen för att bestämma resultatet av analysen. Den förinstallerade programvaran xponent 3,1 ackumulerar de signaler som upptäckts av båda lasrarna och ger ett mått på medelvärdet av fluorescensintensiteten (MFI) för varje enskild mikrosfär. Medianvärdet för fluorescensen erhålls från minst 50 till 100 pärlor för att göra analysen mer tillförlitlig (Kettman et al., 1998). Multiplexing ger möjlighet att minska kostnaderna och mängden av prover som krävs för analysen. Keller et al uppskattade att en 8-Plex-analys kostade en sjuttondel av den jämförbara ELISAn och provvolymen minskade med en tjugondel. Syftet med denna studie var att samtidigt detektera antikroppar mot fyra olika virus med hjälp av en multiplex Luminexanalys och jämföra resultaten med dem som erhålls från ELISA. 6

7 MATERIAL OCH METOD. Prover som användes för syftet med denna studie bestod av 96 serumprover för fjäderfä. Dessa samlades in från sex olika svenska fjäderfäbesättningar enligt tabell 1. Tabell 1: Vaccinationsprotokoll i sex svenska fjäderfägårdar. Flock nr Ålder(v) IBV-vaccin IBDV-vaccin Reo-vaccin NDV-vaccin x(3-4v,6-8v&13-16v) x(3-4v,6-8v&13-16v) 2x(6v,14v) Nej* Nej 2x(6v,14v) Nej* Nej x(3-4v,6-8v&19-20v) 2x(7-6v,19-20v) Nej* Nej x(3-4v,6-8v&19-20v) 2x(7-6v,19-20v) 1x8v Nej x(3-4v,6-8v&19-20v) 2x(7-6v,19-20v) 1x8v Nej x(3-4v,6-8v&19-20v) 2x(7-6v,19-20v) 1x8v Nej *Flockar med kliniska symptom/ingen vaccination. Kitet som användes heter Bursal-Newcastlesjuka, bronkit, Reovirus antikroppstest (AG0002 ) från Luminex Corporation. Det innehöll spädningslösning, negativ och positiv kontroll, tvättbuffert, mikrosfärmix, detektionsantikropp och fluorokrom fykoerytrinkonjugat (SA-PE) samt 96-hålsplatta. Kitet förvarades i ett kylrum (-18 C) och tinades upp innan det användes. Förutom kitet erhölls från samma företag en LuminexxMAP- maskin, en dator med förinstallerad mjukvara och en skakmaskin. 7

8 I en 96 hålsplatta, som användes som arbetsplatta, späddes serumproverna och kontrollproverna 1:25 till en total volym av 250 per prov. Eftersom 50 används till varje analys, räckte detta till 5 analyser. I en annan platta i syfte att analyseras tillsattes 50 av mikrosfärmixet i varje brunn. 50µL av de utspädda negativa och positiva kontrollproverna tillsattes i fyra brunnar av plattan, följt av 50µL av outspädda standardprover i tio brunnar av plattan. Därpå tillsattes 50µL av utspädda serumprover i alla brunnar av plattan, som täcktes av aluminiumfolie för att skydda den från ljus. Plattan inkuberades 55 min i rumstemperatur med samtidig centrifugering i 700 x g. Efter inkubationen tvättades plattan tre gånger med 300µL tvätt buffert med hjälp av en tvättmaskin (Tecan GmbH, AUSTRIA) enligt tillverkarens instruktioner. 100µL av detektionsantikropp pipetterades till alla brunnar av plattan, som täcktes med aluminiumfolie och inkuberades i 25 min i rumstemperatur med samtidigt centrifugering i 700 x g. Sedan tvättades plattan två gånger med 200µL tvättbuffert i tvättmaskinen. Efteråt tillsattes 100µL SA-PE konjugat sekundär antikropp försiktigt till varje brunn. Plattan täcktes av aluminiumfolie och inkuberades i rumstemperatur i 25 min i 700 x g och tvättades sedan en gång med 100µL tvättbuffert med hjälp av tvättmaskinen. Slutligen placerades mikroplattan i Luminexmaskinen för avläsning. Dessa serumprover analyserades tidigare med ELISA-metoden vid Enheten för virologi immunologi och parasitologi på SVA. Resultaten som erhölls från deras metod användes för att jämföra med Luminexresultat. Antikroppskoncentrationen i serum mättes i MFI (Median Fluorescens Intensity) på Luminex 200-instrumentet. Minst 50 kulor per brunn analyserades för att beräkna MFI för varje reaktion. 8

9 För att skilja positivt från negativt serum, beräknades S/P för varje prov. S/P-kvoten definieras matematiskt som (provets MFI negativ kontrollens MFI) / (positiv kontroll negativ kontroll). Kvoten avgör om ett prov är positivt eller negativt genom att jämföra det med en cut-off värde, dvs att ett prov med S/P-värde lika med eller ovanför cut-off värdet tolkas som positivt och under som negativa. Cut-off-värdena kom via Luminextillverkaren LUMINEX CORPORATION, från United States Department of Agriculture (USDA). Dessa värden är: IBDV 0,09 vilket innebär att S/P-kvot 0,09 indikerar närvaro av antikroppar mot Gumborosjuka, NDV 0,14 vilket innebär att S/P-kvot 0,14 indikerar närvaro av antikroppar mot virus som orsakar Newcastlesjukan, IBV 0,13 vilket innebär att S/P-kvot 0,13 indikerar närvaro av antikroppar mot infektiös bronkit Virus, Reo 0,11vilket innebär att S/P-kvot 0,11indikerar närvaro av antikroppar mot Avian Reovirus. RESULTAT. Förekomst av antikroppar i serum visar att kycklingarna hade haft en humoral respons till ett specifikt virus, vilket tyder på att kycklingarna antingen hade vaccinerats eller utsatts för vaccinerade virus eller exponerats för viruset. Av totalt sex fjäderfäflockar med sexton serumprov från varje flock, var det två flockar som inte korrelerade 100 % med ELISAresultat, baserat på positiva negativa S/P kvoten enligt tabellen nedan. De sexton serumproverna som testades för IB-virus, IBD-virus, ND-virus och reovirus visade en hög korrelation mellan de två testmetoderna (minst 81 %), se tabell 2. Luminexanalysen upprepades sju gånger och bara då avvek resultaten några gånger från den redan körda ELISA-metoden, se tabell 3 och 4. Det ska dessutom noteras att dessa avvikelser bara avser ND-virus och reovirus och att resultat från IB-virus och IBD-virus stämde till 100 % med ELISA-resultaten. 9

10 Tabell2: Sammanfattning av avvikande resultat mellan ELISA- och Luminextestmetoder för 96 serum. Flock Virus Positiv/Negativ korrelation mellan Luminex och ELISA 1 Reo 15/16* 94% IBV 16/16 100% IBDV 16/16 100% Newcastle 16/16 100% 2 Reo 13/16** 81% IBV 16/16 100% IBDV 16/16 100% Newcastle 13/16** 81% *Se tabell 3 för detaljerade resultat vid upprepade körningar. **Se tabell 3 och 4 för detaljerade resultat vid upprepade körningar. 10

11 Tabell3: Resultat från avvikande serumprover för Reovirus efter upprepade analyser. Luminex* ELISA Positiv Negativ Serum 8 i flock1 Positiv 5 2 Serum 12 i flock2 Positiv 5 2 Serum 13 i flock2 Positiv 6 1 Serum 15 i flock2 Positiv 3 4 *7 analyser Tabell4: Resultat från avvikande serumprover för NDV efter upprepade analyser. Luminex* ELISA Positiv Negativ Serum 2 i flock2 Negativ 1 6 Serum 6 i flock2 Negativ 4 3 Serum 8 i flock2 Negativ 4 3 *7 analyser 11

12 DISKUSSION. Virussjukdomar som drabbar fjäderfä har ökat markant de senast åren. Vaccinationen har blivit ett viktigt sätt att bekämpa dessa smittsamma virussjukdomar i anläggningar för fjäderfäproduktion. I Sverige har man infört ett vaccineringsprogram som säkerställs av SVA genom ett hönshälsokontrollprogram. För att upprätthålla ett effektivt vaccineringsprogram, behövs en övervakning av antikroppsnivåer i serumet. Övervakning av antikroppar är också viktigt för att upptäcka exponering för patogen som kycklingarna inte är vaccinerade för i produktionshusen. På SVA används ELISA-metoden för kvantifiering och mätning av antikroppar och resultaten från dessa två analysmetoder skulle jämföras. Studien gick därför ut på att validera en ny metod, Luminex som har en multiplexeringsförmåga genom att tillåta detektering av antikroppar av fyra olika virus samtidigt i ett volymprov. I studien ingick totalt 96 serumprover för fjäderfä som samlades in från sex olika svenska gårdar. Serum från höns i kommersiella fjäderfäbesättningar som är vaccinerade mot IBV och IBDV hade höga antikroppskoncentrationer vilket bevisar att vaccinationen mot dessa virus har varit framgångsrik i att producera ett specifikt svar för varje virus. Däremot hade kycklingarna som inte vaccinerats mot Newcastlesjukans virus och Reovirus låga titrar av antikroppar för båda virus. Resultat som erhållits från ELISA-analysen visade en signifikant stark korrelation mellan de två metoderna och därmed stämde resultaten bra med de från Luminexanalysen bortsett från två gårdar där för den ena gården resultat av fyra serumprover efter sju omkörningar av Luminex inte stämde överens och för den andra gården var det tre serumprover som inte stämde se Tabell3 och 4. 12

13 Fördelen med Luminextekniken ligger i den höga känsligheten, genomströmningen och effektiviteten (Vignali et al, 2000) men också betydande minskning av tid och kostnader för analyser från multiplexering jämfört med ELISA, som är både dyrare och tidskrävande att utföra när många proteiner ska mätas (Jager och Rijkers, 2006). Luminexanalysen är oerhört viktig för kliniska studier där provvolymer är begränsade (Liu et al, 2005), exempelvis för cerebrospinalvätska och synvialvätskeprover som är svåra att få tag på. En nyligen genomförd studie fann en hög korrelation mellan mikrosfär-baserad analys och ELISA-metod. (DuPont et al, 2005). Andra olika studier har syftat till att utveckla mikrosfär-baserade analyser för att utreda smittsamma sjukdomar och därmed förbättra den diagnostiska aspekten. Bellisario et al. har använt tekniken för att samtidigt mäta antikroppar mot HIV-1-antigener i torkat blod från nyfödda. Opalka et al. har använt systemet för att samtidigt kvantifiera neutraliserande antikroppar riktade mot papillomvirus. Det ska dessutom noteras att de cut-off värden som erhållits från företaget är mycket viktiga för att avgöra om proverna är positiva eller negativa. Trots den höga känsligheten och den robusta multiplexeringsförmåga i Luminextekniken avvek några prover från ELISA-resultaten, vilket kan ha orsakats av möjligt pipetteringsfel under utförande av analysen. En nedsatt känslighet kan också uppträda på grund av det ökande antalet pärlor per brunn. Några nackdelar med Luminex är att multiplexanalyser är betydligt mer komplicerade att utforma, utveckla och validera. Dessutom är tekniken mer komplex än ELISA. Den kräver mer underhåll och det finns problem i samband med bearbetning av vissa typer av prover. Sammanfattningsvis har vi utfört och visat att Luminex MAP- teknik kan användas för att upptäcka och validera kvantifiering av antikroppars nivå i serumprov. Den multiplexa Luminex-analysen har gett resultat som korrelerade mycket nära med de ELISA-test som 13

14 används för närvarande i hälsokontrollprogram i Sverige vilket indikerar att denna multiplexanalys kan användas rutinmässigt för fjäderfäscreening vid SVA. Dessutom tror man med den pågående utvecklingen och förbättringen att Luminexmetoden att den inom en snar framtid kommer att ersätta ELISA-metoden. 14

15 REFERENSER. Cheville NF. Studies on the pathogenesis of Gumboro disease in the bursa of Fabricius, spleen and thymus of chicken. Am J Pathol. 1967; 51: Alexander DJ. Newcastle disease and other avian paramyxoviruses. Rev Sci Tech. 2000; 19(2): Kellar KL, Lannone MA. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Exp Hematol. 2002; 30(11): Carson RT, Vignali DA. Simultaneous quantitation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay. J Immunol Methods. 1999; 227(1-2): Kettman JR, Davies T, Chandler D et al. Classification and properties of 64 multiplexed microsphere sets. Cytometry. 1998; 33(2): Das S, Brown TM, Kellar KL, et al. DNA probes for the rapid identification of medically important Candida species using a multianalyte profiling system. FEMS Immunol Med Microbiol. 2006; 46(2): De Jager W, Rijkers GT. Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison. Methods. 2006; 38(4): Dunbar SA. Applications of Luminex xmap TM technology for rapid, high-throughput multiplexed nucleic acid detection. Clin Chim Acta. 2006; 363(1-2): K.L. Kellar, R.R. Kalwar, K.A. Dubois, et al. Multiplexed fluorescent bead-based immunoassays for quantitation of human cytokines in serum and culture supernatants Cytometry. 2001; 45(1):

16 Prince HE, Lape-Nixon M, Matud J. Evaluation of a Tetraplex microsphere assay for bordetella pertussis antibodies. Clin Vaccine Immunol. 2006; 13(2): Schmitt M, Bravo IG, Snijders PJ, et al. Bead-based multiplex genotyping of human papillomaviruses. J Clin Microbiol. 2006; 44(2): Waterboer T, Sehr P, Pawlita M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 2006; 309(1-2): Bellisario R, Collinas RJ, Pass KA. Simultaneous measurement of antibodies to three HIV-1 antigens in newborn dried blood-spot specimens using a multiplexed microsphere-based immunoassay. Early Hum Dev. 2001; 64(1):21-5. Opalka D, Lachman CE, MacMullen SA, et al. Simultaneous quantitation of antibodies to neutralizing epitopes on virus-like particles for human papillomavirus types 6, 11, 16, and 18 by a multiplexed luminex assay. Clin Diagn Lab Immunol. 2003; 10(1): Liu MY, Xydakis AM, Hoogeveen RC et al. Multiplexed analysis of biomarkers related to obesity and the metabolic syndrome in human plasma, using the Luminex-100 System. Clin Chem. 2005; 51(7): Dupont NC, Wang K, Wadhva PD et al. Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 2005; 66(2):