Påvisande av Echinococcus multilocularis med specifikt fiske av mitokondrie-dna

Storlek: px

Starta visningen från sidan:

Download "Påvisande av Echinococcus multilocularis med specifikt fiske av mitokondrie-dna"

Axel Lindqvist
för 8 år sedan
Visningar:

1 Påvisande av Echinococcus multilocularis med specifikt fiske av mitokondrie-dna Åsa Hagström Statens Veterinärmedicinska Anstalt Avdelning för virologi, immunbiologi och parasitologi

2 Innehåll Bakgrund agens övervakning provtagning Utveckling av specifikt fiske Utförande av analysen Resultat

3 E. multilocularis Foto: KarinTroell/SVA

4 Värddjur: räv hund mårdhund varg (katt) Mellanvärd: sork (människa)

5 Angripen lever

6 Övervakning av E. multilocularis rävens dvärgbandmask analyserades ca 300 rävar per år jägare skickade in hela djurkroppar tarmpaketet analyseras med tarmskrapning och mikroskopering

8 PCR parallellt med ordinarie övervakning 2010 testades en ny metod: äggflotation följd av magnetkulebaserad extraktion och echinocock- PCR med EvaGreen (CyberGreen). Positiva prov typades med konventionell PCR.

magnetkulebaserad extraktion och echinocock- PCR med

9 Fynd: Echinococcus multilocularis Feb 2011, för första gången i Sverige Räv, årsunge, hona, sköts dec km från Uddevalla Träckprov: äggisolering + PCR pos, därefter tarmundersökning rikligt med mask

dec 2010 15 km från Uddevalla Träckprov:

10 Utökad övervakning 3000 rödrävar analyserades med den gamla metoden (SSCT) under perioden mars-juni 2011

12 Foto: Erik Ågren/SVA

13 Resultat av övervakningen Ytterligare 3 smittade rävar hittades Södermanland Dalarna Västra Götaland

14 Ytterligare övervakning insamling av ytterligare 4000 prover insamling av rävspillning runt fyndplatsen i Södermanland inom ett område som täcker cirka kvadratkilometer.

15 Mål: enklare provberedning och större känslighet Tillräckligt bra om man får bättre utbyte än med äggflotation eller samma utbyte men enklare hantering, dvs större antal provberedningar per dag

äggflotation eller samma utbyte men enklare

16 Besvärliga prov Knepiga när man vill sätta upp molekylärdiagnostiska metoder är Prov som innehåller ett litet antal av den sökta patogenen Prov som innehåller mycket inhibitorer Prov där patogenen är ojämnt fördelad i provmaterialet

litet antal av den sökta patogenen Prov som innehåller

17 Robotextraktion direkt efter homogenisering ~10 ägg i 12 ml buffert 10 ägg sp 1:5 träckprov >> 10 ägg / 3 g

18 - Fånga upp DNA så att man kan koncentrera det - Analysera stor provvolym - Slippa alla inhibitorer

20 3 ml rävträck + 12 ml buffert (slutkonc NaCl2 1M) Homogenisera i MP-Bio: 6x[6,5/s; 12x15ml;1 min] zirkonkulor, 2 mm zirkonoxidkulor, 0,5 mm Centrifugera 10 min 3000 rpm Flytta över 8 ml av supernatanten till ett 15-ml rör

21 Borttagande av fritt biotin Sätt uppslammad sepharose till provet Rotator i rumstemperatur, 10 rpm, 45 minuter Centrifugera 3500g, 15min 6 ml supernatant flyttas till 10 ml-rör

22 Hybridisering av specifik prob Sätt fiskeprob till provet Denaturera i 15 min ~98 C i vattenbad Flytta till 55 C skakvattenbad i 45 min, ca 80/min (här sker hybridiseringen, dvs DNA binder till proben) Rotator i rumstemperatur, 15min

23 Fiske Dynal M-270 Streptavidinkulor sätts till provet Rotator i rumstemperatur 1 timme De biotinylerade (och eventuellt hybridiserade) proberna, binder till streptavidinet på kulorna.

24 Nordiag Bullet robot

25 AUTOMATISERAD TVÄTT Flytta proven till 24-brunns platta med pyramidbotten Tvätta enligt program i Bullen Det går att tvätta 48 prov åt gången

26 DENATURERING Sätt elueringsplattan i ett värmeblock 99 C 10 minuter Flytta över elueringsplattan till magnetställ och för över eluatet till ny platta

27 Till PCR PCR-kit SsoFast probes, tar ca 1 timme Duplikat

28 Validering Test resultat för 177 schweiziska rävprov MC- PCR SCT (Segmentation Counting technique) Pos Neg Tot Pos Neg Tot antal maskar (sct) per djur antal rävar MC-PCR positiva < < < < < * 4 2 totalt antal prov MC-PCR negativa Känsligheten MC-PCR jämfört med SCT (gold standard) är 88 % (82/93) Resultat från MC-PCR i relation till antal maskar funna med SCT *i två av rävarna hittade stora mängder mask. som alla var immatura och i en tredje räv hittades.. bara proglottider (segment)

29 Validering Bedömningen av specificiteten baseras på de rävträck som insamlades under den svenska övervakningen. Om man förutsätter att alla positiva prov var falskt positiva, är specificiteten minst 99,9 % (2156 / 2158)

30 Positiva prov hittills Dalarna, 1 Västra Götaland, 3 Småland, 1 Södermanland 2 +

31 Mats Isaksson Mikael Juremalm Helene Wahlström Erik Ågren SVA Anders Holmberg Morten Lukacs PSS Peter Deplazes Univ. Zurich

32 . Tack för er uppmärksamhet!

Relevanta dokument

Harpest (tularemi) Rävens dvärgbandmask. Gete Hestvik Enhet för patologi och viltsjukdomar

Harpest (tularemi) Rävens dvärgbandmask Gete Hestvik Enhet för patologi och viltsjukdomar Harpest (tularemi) Zoonos Sjukdom som kan spridas mellan olika djurslag Människa annat djur Exempel: Tularemi Salmonellos