Välkomna Eukaryot proteinexpression 30 oktober 2008 Sissela Liljeqvist Föreläsningens innehåll Prokaryot vs Eukaryot översikt eukaryota värdar och expressionsvektorer (='budbärare') Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Baculovirus/insektsceller däggdjursceller = mammalieceller Prokaryot plasmidexpression vanligast inducerbara promotorsystem billigt sekretionssystem - underlättar rening höga expressionsnivåer (upp till 5g/l) Prokaryot vs Eukaryot Vad avgör val av värd-vektorsystem? AcMNPV Eukaryot inga bakteriella cellkomponenter posttranslationella förändringar struktur hos proteinet - posttranslationella modifieringar användningsområde - in vivo - in vitro - struktur/funktionsstudie mängdbehov tidsperspektiv kostnad
Posttranslationella modifieringar Eukaryota värdar för proteinproduktion disulfidbindningar proteolytisk processning glykosyleringar fosforyleringar, sulfatering, acetylering, acylering, -karboxylering fettsyraaddering (C14, C16) jäst insektsceller däggdjursceller växtceller Transformationsmetoder - protoplaster - litiumacetat - elektroporering Transfektionsmetoder - DNA fällt med Ca-fosfat eller DEAE-dextran - elektroporering - lipofektion O-länkad glykosylering N-länkad glykosylering N-länkad glykosylering Generell eukaryot expressionsvektor
Generell eukaryot expressionsvektor eukaryot promotor, polyadenylerings-signal och termineringssekvens (transkription) selekterbar markör funktionell i eukaryot cell selekterbar markör funktionell i prokaryot ori funktionellt i eukaryot cell ori funktionellt i prokaryot Jästarter Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Hansenula polymorpha Schizosaccharomyces pombe Candida utilis Saccharomyces cerevisiae Jästvektorer Enkel och billig att odla i stor skala Väl karaktäriserad genetiskt och fysiologiskt Sekreterar få proteiner naturligt Naturligt förkommande plasmid Fungerande sekretionsmaskineri Etablerade selektionssystem finns GRAS-organism (generally recognized as safe) Plasmidvektorer = episomal vektor - ofta instabil vid större odling Integrerande vektorer - endast en genkopia - tandem arrays tenderar till att vara instabila Yeast artificial chromosome (YAC) - kan härbärgera stora fragment - bevaras som separat kromosom - analys och sekvenerig av stora genfragment - ej primärt för proteinproduktion Episomal jästvektor (2μm) Integrerande vektor (jäst)
YAC system Ökning av gendosen Se fig. 7.6 Multipla kopior efter varandra Genamplifiering - His4/Tn903KanR (G418) 50-100 kopior - Sh ble/zeocin Promotorer och signalsekvenser Sekretion Promotorer: Starka - AOX1 (inducerbar) - GAPD (konst.) - FLD1 (ind.) Medel - PEX8 (ind.) Svag - YPT1 (konst.) Signalsekvenser: S. cerevisiae -MF P. pastoris acid phosphatase (PHO1) C. rugosa Lip1 Phaseolus vulgaris agglutinin (PHA-E) Glykosylering vid sekretion Pre-pro- -faktor = signalpeptid Lys-Arg-linker signalpeptid klyvs av endoproteas Sekretionsmaskineriets proteiner kan modifieras Nackdelar med S. cerevisiae Pichia pastoris Plasmider förloras ofta vid odling i stor skala Hyperglykosylerar proteiner Vanligt med periplasmatiska proteiner istället för sekreterade Fermenterar socker till etanol (Crabtreeeffekt)
Pichia pastoris Baculovirus Ungefär samma karaktäristika som S. cerevisiae, i övrigt gäller dessutom: Stark och strikt reglerad promotor (AOX1) Ingen etanolproduktion Sekreterar färre proteiner än S. cerevisiae Ofta hög produktion Förhöjd proteolys en av de största virusfamiljerna infekterar ryggradslösa djur - insekter (ca. 600) - skaldjur cirkulärt ds-dna, 80-220 kb Stavformig, membranomsluten viruspartikel tre subgrupper - Nuclear polyhedrosis viruses - Granulosis viruses - Non-occluded viruses Baculovirus infekterar insektsceller AcMNPV polyhedrin-kapsel ut i omgivningen äts av ny insekt polyhedrin-kapseln löses upp i mag-tarmkanalen och virioner kan infektera nya celler Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus infekterar ett 30-tal insekter (främst nattfjärilar). proteinösa nukleära ocklusionskroppar genexpression tidigt och sent (polyhedrin, p10) i replikationscykeln starka promotorer AcMNPV Cabbage looper Budding virus particles Polyhedron embedded viruses
Insektscell-linjer Sf9 Spodoptera frugiperda (Cabbage looper) Trichoplusia ni Sf21 Sf9 BTI-TN-5B1-4 Baculovirus transfer vector Bacmid: E. coli -insektscells-skyttelvektor Se fig 7.15 Bioreaktor för odling av insektsceller Proteinproduktion i däggdjursceller Fördelar: autentiska posttranslationella modifieringar väl stabila är cellinjer pålitliga Nackdelar dyrt
Mammalie-cellinjer African green monkey Transient=övergående expression - African green monkey kidney cells (COS) - Baby hamster kidney cells (BHK) - Human embryonic kidney cells (HEK-293) Stabil expression - Chinese hamster ovary cells (CHO) - Myeloma cells (Sp2/0, J558L) - Murine erythroleukemia cells (MEL) COS-1 (kidney fibroblast) Amplifiering av genomregioner Coexpression Se fig. 7.18-7.20 Hydroxy urea Aphidicolin UV- eller gammastrålning Carcinogener DHFR (Dihydrofolat reduktas)-mtx GS (Glutamin syntas)-msx Sammanfattning Generella fördelar med eukaryota system Jäst: S. cerevisiae och P. pastoris Insektsceller och baculovirus Bacmider Däggdjursceller transfektionsmetoder, markörsystem, expression av fler målprotein per cell Tack för denna gång, vi ses den 7 november