IFM/Kemi Augusti2011/LGM Linköpings Universitet Lägesspecifik mutagenes av proteiner
Figur1. Flödesschema över lägesspecifik mutagenes laboration.
Lägesspecifik mutagenes Introduktion In vitro lägesspecifik mutagenes är en ovärderlig teknik för att t.ex. studera samband mellan proteiners struktur och funktion eller modifiering av vektorer för kloningsändamål Under det senaste årtiondet har det kommit ett antal effektiva och pålitliga metoder för att åstadkommma lägesspecifika mutationer i DNA genom att använda syntetiska oligonukleotider. Under denna kurs ska vi använda oss av en relativt ny metod som kallas quik-change site-directed mutagenesis kit och saluförs av Stratagene. Den främsta fördelen med denna metod är att den inte kräver enkelsträngat DNA (ss- DNA) detta medför eliminering av subkloningssteg i M13 baserade bakteriofager för att erhålla enkelsträngat DNA (ss-dna). Dessutom kräver denna metod inga specialiserade vektorer eller unika restriktionssites utan man kan i princip använda vilken dubbelsträngad plasmid som helst. Denna metod bygger på att man använder sig av enzymet Pfu TurboTM DNA polymeras II som är ett värmetåligt DNA polymeras som replikerar bägge DNA strängarna med stor noggrannhet utan att undantränga mutant oligonukleotiderna. Vid mutagenesen används en dubbelsträngad plasmid som vektor med en gen som ska modifieras. Med hjälp av två syntetiska oligonukleotid primers, vardera komplementär till en av DNA strängarna av vektorn med basbyte för den önskade mutationen så förlängs DNA strängarna under temperaturcykler (PCR) med hjälp Pfu Turbo DNA Polymeras II. (Figur 2). Förlängningen av DNA strängarna ger ett nickat DNA som efter avslutad temperaturcykel behandlas med enzymet Dpn I endonukleas. Enzymet Dpn I endonukleas är specifikt för metylerat och hemimetylerat DNA och används för att bryta ned original DNA strängen och selektera för den mutant innehållande DNA strängen. Nästan all DNA isolerad från E. Coli är metylerat och därmed tillgänglig för nedbrytning med DpnI.
Fig Figur. 2 Schematisk översikt över Quikchange metoden
Fatty acid binding protein (FABP) Bakgrund: Fatty acid binding protein (FABP) är ett cytosoliskt protein som transporterar olika fettsyror. För att studera detta protein har vi klonat FABP från en ökenmyra och kan uttrycka proteinet i E.coli. Detta protein består av 134 aminosyror med en His-Tag konstruktion på 20 aminosyror för att underlätta rening av proteinet (se appendix för konstruktion av klonen). Ett vanligt sätt att studera proteiner är att använda sig av någon spektroskopisk mätmetod t.ex. tryptofan fluorescens. En svårighet med att studera FABP från ökenmyran är att den saknar tryptofaner för att använda som spektroskopiska sonder. Med hjälp av lägesspecifik ska vi åstadkomma tre olika varianter av FABP en aminosyran tryptofan är introducerad på olika positioner i proteinet. För att hitta lämpliga positioner för Trp:s har vi använt oss av threading där den tredimensionella strukturen av FABP från råtta använts som mall. Figur 2 Överlagrad simulerad struktur av FABP från ökenmyra (ljusblå) med FABP från råtta (grön). Illustrerat är de positioner som ska muteras (rött) och motsvarande aminosyra i FABP från råtta (blått).
Material: Lägesspecifik mutagenes Dubbelsträngad plasmid (~10 ng) Mutagenes primer (forward) Mutagenes primer (reverse) Kontrollplasmid, pwhitescript (4.5 kb, 10 ng/ul) Kontroll primer (forward) Kontrollprimer (reverse) 10x Reaktionsbuffert Pfu Turbo DNA polymeras DpnI restriktions enzym dntp mix Sterilt vatten Autoklaverade PCR-rör Utförande: I ett PCR-rör tillsätts följande lösningar: Prov: 2.5 µl 10x reaktionsbuffert 1 µl (10ng) dubbelsträngad plasmid 1 µl Mutagenes primer (forward) 1 µl Mutagenes primer (Reverse) 0.5 µl dntp mix Sterilt vatten till totalvolymen 25µl
Tillsätt sedan 0.5µl Pfu Turbo DNA Polymeras (2.5U/µl). Blanda genom att snabbcentrifugera 10 sekunder. Kontroll: (utförs av någon/några labgrupper utöver prov1) 2.5µl 10x reaktionsbuffert 1µl (10ng) pwhitescript (kontrollplasmid) 0.6 µl kontroll primer (forward) 0.6µl Kontroll primer (reverse) 0.5µl dntp mix Sterilt vatten till 25µl Tillsätt sedan 0.5µl Pfu Turbo DNA Polymeras (2.5U/µl) Blanda genom att snabbcentrifugera 10 sekunder. 1) Överför PCR rören till en PCR apparat och programmera in följande cykel: 95 C (30 sekunder).55 C (1 minut).68 C (6 minuter) Denna cykel repeteras 16 gånger OBS! Temperaturerna och tiderna är ungefärliga och beror på vilken vektor som används (Labassistenten avgör vilken temperatur som ska användas) 2) Efter avslutad PCR cykel SPARA 5µl för analys på agarosgel 3) Tillsätt 0.5µl DpnI restriktionsenzym till varje rör, blanda genom snabbcentrifugering. Inkubera rören 1 timme vid 37 C. 4) Proven är nu redo att tranformeras och återstoden av proverna fryses ned i -20 C. Lästips: Mutagenes: Gene Cloning and DNA analysis(6th edition)sid: 202-204
Stratagene Quikchange Site-Directed Mutagenesis Kit, Instruction manual
Material: Transformation av plasmid efter läges-specifik mutagenes Agarplattor med Kanamycin alternativt Ampicillin NZY+ Broth (alternativt LB-medium) IPTG X-Gal Prov1 efter läges-specifik mutagenes Kontroll efter läges-specifik mutagenes Transformationskontroll, puc18 Epicurian Coli XL1-Blue supercompetent cells Utförande: 1) Tina de superkompetenta XL1-blue cellerna portionerade i 20µl:s portioner i fyra rör. 2) Till varje 20µl:s portion av superkompetenta celler tillsätts 1µl av prov1, kontroll eller transformationskontroll. 3) Blanda försiktigt med pipetspetsen och inkubera på is 30 minuter. 4) Värmechocka cellerna genom att placera rören i värmeblock 45 sekunder vid 42 C, placera sedan rören på is i 2 minuter. 5) Till cellerna tillsätt 100µl av förvärmt (42 C.) NZY+Broth odlingsmedium (eller LBmedium) och inkubera transformationsreaktionen 1 timme i 37 C. 6) Sprid 100 µl av transformationsreaktionen för prov1 på agar-kanamycin plattor.
OBS för kontroll och puc18 transformationskontroll behandlas agarplattor enligt följande Tillsätt 20µl 10% (w/v) X-gal och 20µl 100mM IPTG till 100µl NZY+Broth odlingsmedium (eller LB-medium) och sprid på agarplattan och låt torka 37 C 30 minuter innan transformering. 7) Dagen efter transformation (ca 16 timmar) kontrolleras transformationsgraden. Räkna antalet kolonier på de olika agarplattorna. 8) Plocka över 12 kolonier i rutmönster för fortsatt plasmidpreparation och DNA sekvensning 9) Alla agarplattor sparas i kylrummet inplastade i parafilm. Lästips: Kompetenta celler och transformering Gene Cloning and DNA analysis(6th edition)sid: 72-79
Preparation av plasmid Material: 25 ml Odlingskolvar LB-medium Kanamycin (stamlösning) Qiaprep spinnkolonnkitts Autoklaverade eppendorfrör och pipettspetsar Sterilt vatten Utförande Preparation av plasmid För preparationen av plasmid kommer ett färdigt kit att användas (QiaPrep spinnkit). Detta kit bygger på att plasmid DNA:t renas på en minikolonn där DNAt binds upp på en scilicagel. Dagen innan plasmidpreparationen har övernattskulturer av E. Coli med den önskade plasmiden i iordningställs. Odlingskolvar innehåller 10ml odlingsmedium och ampicillin. Till detta har satts en bakteriekoloni, innehållande önskad plasmid, från en LB-Amp platta från en tidigare transformation. Odlingarna har fått växa över natt i 37 C med skak. Den plasmid som preppas på denna kurs kommer att användas till liknande laborationer på andra kurser längre fram! 1) Varje grupp fyller två 1,5 ml eppendorfrör med övernattskultur av E. coli med den plasmid som ni ska preparera. 2) Centrifugera i bordcentrifug 10 000 rpm i 5 min 3) Sug av all supernatant med pasteurpipett alternativt dekantera. 4) Resuspendera pelleten i totalt 250 µl (125 µl i varje epp.rör) Buffer 1. Lös upp cellerna helt och för samman de båda rören till ett. 5) Sätt till 250 µl Buffer 2. 6) Blanda genom att vända röret ett par gånger, cell suspensionen ska klarna nästan omedelbart. 7) Tillsätt 350 µl N3 buffer och blanda genast genom att vända röret några gånger. Det ska bildas vita moln i röret. 8) Centrifugera 13 000 rpm 10 minuter för att samla molnet på rörväggen.
9) Dekantera supernatanten ner i kolonnen. Inget vitt får följa med. (Det går också bra att använda en pipett med steril pipettspets för att föra över supernatanten.) Se till att kolonnen sitter i ett plaströr. 10) Centrifugera 13 000 rpm i 1 minut. 11) Tillsätt 750µl PE-buffer och centrifugera 13 000 rpm 1 min. 12) Häll bort bufferten från röret och centrifugera en gång till. 13) Flytta över kolonnen till ett rent (sterilt) eppendorfrör. 14) Tillsätt 50 µl H 2 O. 15) Centrifugera 13 000 rpm 1 min. Glöm inte att använda skyddslocket på centrifugen, ifall locket på epp. röret flyger av! Plasmiden är nu eluerad och finns i epp.röret!
Agarosgelelektrofores Utförande: Gjutning av agarosgel 1) I en 250 ml flaska tillsätts 0.5-2.0 g agaros och 10ml 10x TBE buffert och spädes med vatten till totalvolymen 100ml. 2) Värm agarosgelen tills den är helt flytande, i ett vattenbad eller i mikrovågsugn. Låt blandningen svalna en stund (till ca 60 o C) och gjut agarosgelen. Låt gelen svalna i minst 30 minuter. Elektroforetisk separation av DNA 1) Blanda 4 µl laddningsbuffert med 5µl DNA och 11µl H 2 O. 2) Tillsätt 5 µ färdigblandad molekylviktsmarkör 3) Lägg agarosgelen i elektroforesapparaten och fyll på med 1x TBE buffert, så att det täcker gelen. 4) Applicera sakta och försiktigt proverna i provbrunnarna med en automatpipett (de ska sjunka ned i botten på brunnen). 5) Separera DNA fragmenten genom att lägga på en spänning ~100 Volt. Kom i håg att DNA är negativt laddat. 6) När den blåa markören har nått ca 2/3 ner på gelen avbryts elektroforesen och DNA fragmenten infärgas med etidiumbromid. Etidiumbromid som interkalerat med DNA kan ses genom att gelen belyses med 300-360 nm ljus på en transluminator. Skydda ögonen genom att använda skyddsglasögon och använd handskar vid arbete med Etidiumbromid. 7) Fotografera av gelen och uppskatta mängden DNA ni har erhållit. Lästips: T.A Brown Gene Cloning and DNA analysis, 6 th edition, sid 56-62
Appendix Primers för mutagenes av FABP: F42W_forward: 5'-gtagcgaaaatttcgacgattggatgaaggcactcggcgtag-3' F42W_reverse: 5'-ctacgccgagtgccttcatccaatcgtcgaaattttcgctac-3' F80W_forward: 5'-gtatactctaaagacgactagtacctggaaaaacacggaaataaaattcaaact-3' F80W_reverse: 5'-agtttgaattttatttccgtgtttttccaggtactagtcgtctttagagtatac-3' V98W_forward: 5'-gaagaattcgatgaagacacctgggacggtagaaaagtgaagag-3' V98W_reverse: 5'-ctcttcacttttctaccgtcccaggtgtcttcatcgaattcttc-3' DNA sekvens FABP från ökenmyra 5 - ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCA TATGTCCATCAACGAGATTCTTGGAAAACGTTACAAGCTCTCTAGTAGCGAAAATTTCG ACGATTTTATGAAGGCACTCGGCGTAGGTATGGTGACGCGGAAAATGGGTGCTACGGTC AGTCCCGTCGTCGAATTGACGGAGAAAGACGGAGTGTATACTCTAAAGACGACTAGTAC CTTCAAAAACACGGAAATAAAATTCAAACTTGGCGAAGAATTCGATGAAGACACCGTGG ACGGTAGAAAAGTGAAGAGTGTCTGCACTCTGGAAGGTAATAAACTCATACAGGTGCAG AAAGGTGATAAGAATACTACGATTGAAAGGGAATTCACACCTACAGAGATGGAAGCGAT CATGAAAGTTGATGACATAGTTTGCACAAGAGTATATAAGATCCAGGAATAA-3
DNA och aminosyrasekvens av FABP från ökenmyra 5 -atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccat M G S S H H H H H H S S G L V P R G S H atgtccatcaacgagattcttggaaaacgttacaagctctctagtagcgaaaatttcgac M S I N E I L G K R Y K L S S S E N F D gattttatgaaggcactcggcgtaggtatggtgacgcggaaaatgggtgctacggtcagt D F M K A L G V G M V T R K M G A T V S cccgtcgtcgaattgacggagaaagacggagtgtatactctaaagacgactagtaccttc P V V E L T E K D G V Y T L K T T S T F aaaaacacggaaataaaattcaaacttggcgaagaattcgatgaagacaccgtggacggt K N T E I K F K L G E E F D E D T V D G agaaaagtgaagagtgtctgcactctggaaggtaataaactcatacaggtgcagaaaggt R K V K S V C T L E G N K L I Q V Q K G gataagaatactacgattgaaagggaattcacacctacagagatggaagcgatcatgaaa D K N T T I E R E F T P T E M E A I M K Gttgatgacatagtttgcacaagagtatataagatccaggaataa-3 V D D I V C T R V Y K I Q E - Konstruktion av pet28 vektorn