Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse Kod K5001 Utgåva 6 För användning med Dako automatiska immunfärgningsinstrument. Kitet innehåller tillräckligt med reagens för 500 tester. (129664-001) P04097SE_01_K500111-2/2015.10 s. 1/8
Innehåll Sid. Avsedd användning... 3 Sammanfattning och förklaring... 3 Reagenser... 4 A. Medföljande material... 4 B. Nödvändigt material som inte medföljer... 4 Försiktighetsåtgärder... 5 Förvaring... 5 Reagensberedning... 5 Provtagning och preparation... 6 Procedur... 6 Kvalitetskontroll... 7 Resultattolkning... 7 Förklaring av symboler... 8 (129664-001) P04097SE_01_K500111-2/2015.10 s. 2/8
Avsedd användning För in vitro-diagnostik. Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, är avsett för användning i immunhistokemi tillsammans med Dako automatiska immunfärgningsinstrument. Kitet baseras på LSAB- (märkt streptavidin-biotin) metoden och används i en procedur i tre steg. Det första steget är inkubering av vävnaden med en optimalt spädd primär kanin- eller musantikropp. Det andra steget är inkubering med Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2) och det tredje steget är inkubering med Dako REAL Streptavidin Peroxidase (HRP). Reaktionen visualiseras med Dako REAL DAB+ chromogen, vilket även medföljer satsen. För att tillförsäkra korrekt färgning rekommenderas användning av kitet tillsammans med andra rekommenderade reagenser vilka anges i avsnittet Nödvändigt material som inte medföljer. Sammanfattning och förklaring Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, har utformats för att ge en optimal färgning på Dako automatiska immunfärgningsinstrument vid användning av mallarna/protokollen som rekommenderas i detta produktblad. Före färgning skall en del rutinmässigt fixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt utsättas för värmeinducerad epitopåtervinning (HIER) med användning av Target Retrieval Solution, som specificerats i produktbladet för den primära antikroppen. Vissa primära antikroppar kräver enzymatisk förbehandling av vävnad för optimal färgning i stället för HIER. Observera att Dako REAL Proteinase K, kod S2019, har utformats för att användas i kombination med HIER för att underlätta satsbearbetning av objektglasen. Endogen peroxidas skall blockas med Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution, kod S2023 eller Dako Dual Endogenous Enzyme Block, kod S2003. P.g.a. en effektiv tvättningsprocedur och närvaron av stabiliserande proteiner i Dako-reagenserna är extra blockningssteg för att reducera icke-specifik bakgrundsfärgning inte nödvändigt. Dako tvättbuffert, som är specifik för de individuella Dako-instrumenten, rekommenderas. Primära antikroppar medföljer inte kitet. Vi rekommenderar användning av Dako N-Series Ready-to- Use Primary Antibodies eller Dako koncentrerade primära antikroppar. Dako REAL Detection System, Peroxidase/ DAB+, Rabbit/Mouse, är baserat på en indirekt streptavidin-biotinmetod, som har påvisats ge en ökad sensitivitet jämfört med analoga metoder. Kitets biotinylerade, sekundära antikroppsreagens reagerar lika bra med kanin- och musimmunoglobuliner, varför endast ett sekundärt reagens krävs för primära antikroppar från kanin och mus. Det sekundära antikroppsreagenset har märkts optimalt med biotin, med användning av en spacerarm med 7 atomer. Detta gör det möjligt för varje biotinylerad antikroppsmolekyl att reagera med flera peroxidaskonjugerade streptavidinmolekyler och därigenom öka detektionssystemets sensitivitet. Kitets peroxidaskonjugerade streptavidin framställs av streptavidin som isolerats från Streptomyces avidinii, och starkt renat pepparrotsperoxidas. Konjugeringen utförs med en renad glutaraldehydmetod i två steg. Eftersom den isoelektriska punkten hos streptavidin är nästan neutral, undviks icke-specifika joninteraktioner med provkomponenterna. Det biotinylerade sekundära antikroppsreagenset, såväl som det peroxidaskonjugerade streptavidinet levereras bruksfärdigt i pipettflaskor och måste hällas i lämpliga instrumentbehållare före användning. Substratsystemet består av två komponenter, DAB+ Chromogen, en koncentrerad diaminobensidin- (DAB) lösning, och HRP Substrate Buffer, innehållande väteperoxid. DAB+ Chromogen måste spädas i HRP Substrate Buffer före användning. Substratsystemet producerar en skarpt brun slutprodukt vid målantigenplatsen. Dako REAL Hematoxylin, kod S2020 eller Hematoxylin, kod S3301, rekommenderas för motfärgning eftersom de ger en klarblå, nukleär färgning. De färgade vävnadssnitten kan monteras med antingen vattenhaltigt monteringsmedium eller monteringsmedium baserat på organiskt lösningsmedel. (129664-001) P04097SE_01_K500111-2/2015.10 s. 3/8
Reagenser A. Medföljande material Flaska A Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2) 100 ml, bruksfärdiga biotinylerade get-anti-mus- och anti-kaninimmunoglobuliner. I buffrad lösning innehållande stabiliserande protein och natriumazid. Reagensfärgen kan variera från starkt gul till färglös, utan att påverka kitets prestanda. Flaska B Flaska C Flaska D Dako REAL Streptavidin Peroxidase (HRP) 100 ml, bruksfärdigt streptavidin konjugerat till pepparrotsperoxidas. I buffrad lösning innehållande stabiliserande protein och konserveringsmedel. Dako REAL DAB+ Chromogen 5 ml, 50x koncentrerad 3,3'-diaminobensidintetrahydroklorid i organiskt lösningsmedel. Reagensfärgen kan variera från starkt lila till färglös, utan att påverka kitets prestanda. Dako REAL HRP Substrate Buffer 250 ml, bruksfärdig buffrad lösning innehållande väteperoxid och konserveringsmedel. B. Nödvändigt material som inte medföljer Dako automatiska immunfärgningsinstrument Dako tvättbuffert, som är specifik för det individuella instrumentet Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution, kod S2023, eller Dual Endogenous Enzyme Block, kod S2003 Dako REAL Proteinase K, kod S2019, utspädd i Dako REAL Proteinase K Diluent, kod S2032 eller Proteinase K, Ready-to-Use, kod S3020 (vid behov) Dako N-Series Ready-to-Use Primary Antibodies eller alternativt koncentrerad primär kanin eller mus N-seriens primära antikropp Dako REAL Antibody Diluent, kod S2022 (för utspädning av koncentrerade antikroppar) Dako REAL Hematoxylin, kod S2020 eller Hematoxylin, kod S3301 Target Retrieval Solution. Se produktbladet för den primära antikroppen Dako REAL Incubation Container, kod S2030 (valfritt) Dako REAL Slide Holder, kod S2029 (valfritt) Dako instrumenttillbehör Objektglas för mikroskop Allmänna laboratoriereagenser för avparaffinering av paraffininbäddade vävnadssnitt Monteringsmedium (vattenhaltigt eller baserat på organiskt lösningsmedel) och täckglas (129664-001) P04097SE_01_K500111-2/2015.10 s. 4/8
Försiktighetsåtgärder 1. För yrkesmässigt bruk. 2. Flaska A, Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2), innehåller material av däggdjursursprung. I likhet med alla produkter av biologiskt ursprung krävs en korrekt hantering. 3. Flaska A, Dako REAL Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2), innehåller natriumazid (NaN 3 ), en kemikalie som är mycket giftig i ren form. I produktkoncentrationer kan natriumazid, trots att det inte klassificeras som farligt, reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Skölj med stora mängder vatten vid kassering så att inte metallazider ansamlas i avloppet. 4. Utsätt inte flaska C, Dako REAL DAB+ Chromogen eller Substrate Working Solution (CHROM) för starkt ljus. 5. Flaska C, Dako REAL DAB+ Chromogen innehåller 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'- tetrayltetraammonium tetrahydroklorid, och är märkt med: H350 H341 P201 P280 Fara P308 + P313 P405 P501 Kan orsaka cancer. Misstänks kunna orsaka genetiska defekter. Inhämta särskilda instruktioner före användning. Använd skyddshandskar. Använd ögon- eller ansiktsskydd. Använd skyddskläder. Vid exponering eller misstanke om exponering: Sök läkarvård. Förvaras inlåst. Innehållet/behållaren lämnas som avfall i enlighet med lokala, regionala, nationella och internationella föreskrifter. Som huvudregel får personer under 18 år inte arbeta med denna produkt. Användare måste noggrant instrueras om lämplig arbetsprocedur, produktens farliga egenskaper samt nödvändiga säkerhetsanvisningar. Ytterligare information finns i databladet för säkerhet (SDS). 6. Använd lämplig skyddsutrustning för att undvika kontakt med ögon och hud. 7. Oanvänd lösning måste kasseras enligt lokala och statliga föreskrifter. Förvaring Förvara kitet vid 2 8 C. Använd inte efter det utg ångsdatum som anges på förpackningen. Byt inte ut satsens komponenter med komponenter från andra partier. Användaren måste validera alla förvaringsförhållanden som avviker från vad som specificerats. Den beredda Substrate Working Solution (CHROM) skall förvaras vid 2 8 C och anvä ndas inom fem dagar. Kontakta vår Tekniska Support om oväntad färgning observeras som inte kan förklaras med variationer i laboratorieprocedurerna och om det misstänks vara problem med produkten. Reagensberedning Substrate Working Solution (CHROM) Substrate Working Solution (CHROM) innehållande DAB, bereds genom att noggrant blanda 20 µl DAB+ Chromogen (flaska C) och 1 ml HRP Substrate Buffer (flaska D). Bered endast den volym som krävs för det antal objektglas som skall färgas. Använd CHROM inom fem dagar (förvaras i mörker vid 2 8 C). Se produktbladet som medföljer det individuella reagenset för beredning av reagenser som inte medföljer kitet. (129664-001) P04097SE_01_K500111-2/2015.10 s. 5/8
Provtagning och preparation Proven kan vara rutinmässigt fixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt och frysta vävnadssnitt. En mängd olika fixativ kan användas för konservering av proverna. Prover skall inte fixeras i neutralbuffrat formalin mer än 24 timmar och företrädesvis under en kortare tid. Den optimala tjockleken för paraffininbäddade snitt är ca 4 µm. Den optimala tjockleken för frysta snitt är 4 6 µm. Proven skall monteras på objektglas för mikroskop. Snitten skall monteras på objektglasen så platta och släta som möjligt. Alltför många veck kommer att påverka färgningsresultaten. OBS! Objektglasen för mikroskop måste ha en bredd som är lämplig för Dako-instrumentet. Se användarhandboken för det individuella Dako-instrumentet för en definition av användbara objektglas. Paraffinsnitt skall monteras från ett förvärmt vattenbad innehållande destillerat eller avjoniserat vatten. Vattenbadet får inte innehålla tillsatser (såsom gelatin, poly-l-lysin etc.). Snitten skall torkas genom uppvärmning, vanligen vid en temperatur på högst 60 C, i minst 60 minuter (t.ex. över natten). För att tillförsäkra lämplig vidhäftning av snitten vid objektglasen, är det viktigt att tappa ut vattnet under snitten före ugnstorkningsprocessen. Procedur Dako automatiska immunfärgningsinstrument använder tekniker som baserats på olika principer för att erhålla ett optimalt färgningsresultat. Innan protokollen körs på Dako automatiska immunfärgningsinstrument, läs noggrant användarhandboken för det angivna Dakoinstrumentet. Efter avparaffinering och hydrering till buffert (vatten), måste de flesta vävnadssnitt utsättas för HIER. Vi rekommenderar att HIER standardiseras för att säkerställa reproducerbar epitopåtervinning. För att standardisera behandlingen rekommenderas att ladda objektglashållaren full med objektglas, även om endast ett objektglas har vävnad. Detta tillförsäkrar en identisk uppvärmning av snitten under varje körning. Vid avslutningen av epitopåtervinningsstegen måste objektglasen lämnas i bufferten i minst 20 minuter vid rumstemperatur. Under denna avkylningsperiod kan Dako automatiska immunfärgningsinstrument prepareras för färgningskörningen. Några få epitoper tolererar inte HIER. Se produktbladet för den individuella Dako primära antikroppen för instruktioner om förbehandling. Inkubering med primär antikropp Dako N-series Ready-to-Use Primary Antibodies kan användas med Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, applicerat på formalinfixerade, paraffininbäddade snitt. En riktlinje för spädning av Dako koncentrerade primära antikroppar och användningen av proteinas K-förbehandling tillsammans med Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, applicerat på formalinfixerade, paraffininbäddade snitt, finns i produktbladet för den koncentrerade primära antikroppen. De koncentrerade primära antikropparna bör spädas i Dako REAL Antibody Diluent, kod S2022. Objektglasen laddas på ett Dako-instrument och färgas med användning av den angivna mallen/protokollet för Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse, kod K5001. Om mallen/protokollet inte finns på ditt Dako-instrument skall du kontakta vår Tekniska Support. Före användning av Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse på Dako Autostainer för första gången, är det nödvändigt att lägga till de reagenser och de tider som anges i tabell 1 till instrumentets reagenslista. (129664-001) P04097SE_01_K500111-2/2015.10 s. 6/8
Tabell 1. Nödvändiga tillägg till reagenslistan och optimala inkubationstider Reagens Kod Förslag till kortnamn Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution eller Dual Endogenous Enzyme Block Dako REAL Proteinase K Solution eller Dako Proteinase K S2023 eller S2003 S2019 + S2032 Mallsteg Inkubationstid HP Block End. enz. Block 5 minuter Pro K Förbehandling 10 minuter under antikropp S2030 Primära antikroppar Individuell - Antikropp 10* 25 minuter Dako REAL Detection System Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2) Dako REAL Detection System, Streptavidin Peroxidase (HRP) K5001 K5001LIN Sekundärt reagens 15 minuter K5001 K5001HRP Tertiärt reagens 15 minuter Dako REAL Detection System (DAB+) K5001 K5001DAB Substrat 3 minuter (2 gånger) Dako REAL Hematoxylin S2020 Hjälpmedel 1 2 minuter eller - Dako Hematoxylin S3301 1 5 minuter Blueing Buffer (= Autostainer-buffert) S3006 - Hjälpmedel 5 minuter * N-Series Ready-to-Use Primary Mouse Antibodies För andra Dako-instrument är reagensnamnen och inkubationstiderna förprogrammerade i mallarna/protokollen. Kvalitetskontroll Varje färgningskörning skall innefatta ett känt positivt kontrollprov för att säkerställa korrekt prestanda för alla använda reagenser. Om de positiva kontrollproverna inte uppvisar lämplig positiv färgning, skall märkningen av testproven anses ogiltiga. Ett negativt kontrollreagens skall användas med varje prov för att identifiera eventuell icke-specifik färgning. Om icke-specifik färgning inte tydligt kan differentieras från den specifika färgningen, skall märkningen av testproven anses ogiltig. Negative Control för N-Series Rabbit Primary Antibodies, kod N1699, eller Negative Control för N-Series Mouse Primary Antibodies, kod N1698 rekommenderas som negativt kontrollreagens. Resultattolkning Substrate Working Solution (CHROM) innehållande diaminobensidin, ger en brun färg vid målantigenplatsen, som känns igen av den primära antikroppen. Den bruna färgen skall vara närvarande på det positiva kontrollprovet vid den förväntade lokaliseringen av målantigenen. Om icke-specifik färgning är närvarande, kommer detta att observeras som en diffus, brunfärgning på objektglasen som behandlats med det negativa kontrollreagenset. Kärnor kommer att färgas blåa av hematoxylin-motfärgen. (129664-001) P04097SE_01_K500111-2/2015.10 s. 7/8
Förklaring av symboler Katalognummer Temperaturbegränsning Använd före In vitro diagnostisk medicinsk apparat Innehåller tillräckligt för <n> tester Tillverkare Läs bruksanvisningen Batchkod Faropiktogram (se avsnitt om försiktighetsåtgärder) Tillverkat av: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tel. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 (129664-001) P04097SE_01_K500111-2/2015.10 s. 8/8