1 Tillverkare Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC-system Läs dessa anvisningar noga innan du använder produkten. Spara denna bruksanvisning för framtida bruk.
Denna sida har avsiktligt lämnats tom
Innehållsförteckning 1 Tillverkare... 4 2 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD... 4 2.1 Avsedd användning... 4 2.2 Indikationer... 4 3 Principer för SURVEYOR Scan NRAS mutationsdetektionsanalys... 4 3.1 KRAS och NRAS... 4 3.2 Analys av patientprover med SURVEYOR Scan-kit... 5 3.3 SURVEYOR Nuclease... 6 4 Härledning av kittets kontrollsubstanser... 6 5 Komponenter... 7 5.1 Antal prover som kan testas med ett kit... 8 5.2 DNA-sekvensering... 8 6 Ytterligare nödvändig utrustning och reagenser... 9 7 Reagensberedning... 9 8 Förvaring och hållbarhet... 9 9 Varningar och försiktighetsåtgärder... 9 10 Förberedande provinsamling, hantering och förvaring... 10 11 Analysprocess... 10 11.1 Somatisk mutationsdetektion med SURVEYOR Scan-kit - En översikt... 10 12 Stegvisa anvisningar... 11 12.1 Installation/kalibrering av DHPLC... 11 12.2 Att tänka på före NRAS-provanalys... 11 12.3 Att tänka på avseende templat... 11 12.4 Att tänka på avseende arbetsflöde... 12 12.5 Amplifieringsprotokoll... 14 12.6 Termocykelprogram för amplifieringsprotokoll... 16 12.7 Kvalitetskontroll av PCR-produkter... 16 12.8 SURVEYOR Nuclease-nedbrytning... 17 13 Kontrollrutiner... 18 13.1 Kvalitetskontroll av SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD... 18 13.2 Användning av kontrollplasmid-dna... 18 14 Tolkning av resultat... 19 14.1 Analys av NRAS Exons 2, 3 & 4 med SURVEYOR Nuclease... 19 14.2 Granskning av SURVEYOR Scan-resultat... 19 14.3 Exempel på resultat... 20 15 Prestationsegenskaper... 23 15.1 LOD för mutationer med SURVEYOR Scan-kit... 23 15.2 Sekvensbekräftelse... 23 15.3 Analysprocessens begränsningar... 23 Bilaga A... 25 A.1 Översikt av platta för SURVEYOR Scan kit... 25 A.2 Kontrollernas DNA-stämplar... 25 A.3 Systemkrav för denaturering med HPLC (DHPLC)... 26 A.4 Laboratorieinstallation för PCR-analyser... 27 A.5 Litteraturlista... 28 Bilaga B... 29 Felsökningsguide... 29 Beställningsinformation... 36 Kontaktuppgifter... 36 översättning Ansvarsfriskrivning... 37 Varumärken & upphovsrätt... 37
1 Tillverkare 1 Tillverkare Tillverkare EGrepresentant M P Transgenomic, Inc. 12325 Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA Tel +1-402-452-5400 Transgenomic Limited 40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK Tel +44-141-892-8800 2 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD 2.1 Avsedd användning Endast för professionellt bruk. Transgenomics SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2,3 & 4 CE IVD är en in vitro diagnostisk analys som detekterar somatiska mutationer i exoner 2, 3 och 4 hos NRAS-genen. Dessa mutationer indiceras av SURVEYOR Nuclease-klyvningstoppar och inkluderar de mutationer som har känd potential för klinisk signifikans. Detta kit är utformat för användning i ett kliniskt diagnostiskt laboratorium av utbildad personal som testar DNA som utvunnits ur formalinfixerad paraffininbäddad vävnad. Detta kit, katalognummer 710400, tillhandahålls som en låda med de komponenter som anges nedan. Denna bruksanvisning kan hämtas på http://world.transgenomic.com/files/literature/482296-sv.pdf. 2.2 Indikationer Kliniker kan använda SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD med DHPLC-system för att underlätta fastställande om patienters kolorektala cancer kanske inte kommer att svara på behandling med EGFR-hämmare (epidermal growth factor receptor) såsom panitumumab. SURVEYOR Scan NRAS kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD ska användas för analys av sådana prover som fastställs vara KRAS Exon 2 Wild-Type efter analys med SURVEYOR Scan KRAS-kittet Exon 2 CE IVD. Detta kit ska även användas tillsammans med SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD. SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD får inte användas för diagnos av kolorektal cancer eller någon annan form av cancer. SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD är en analys som detekterar förekomst av potentiella somatiska mutationer i exoner 2, 3 och 4 hos NRAS-genen, men som inte bekräftar mutationens sekvensidentitet. För att bestämma exakt vilken mutation som detekteras krävs ytterligare analys, t.ex. DNA-sekvensering. Analysresultaten med detta kit kommer visserligen att visa patientens mutationsstatus, men andra kliniska faktorer bör beaktas, inklusive mutationer i NRAS exoner 2, 3 och 4. Resultat som erhålls med SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD bör inte vara den enda metod som används för att besluta om behandling av patienter med kolorektal cancer. Det är viktigt att notera att användning av DHPLC för att identifiera prover som är positiva för en NRAS-mutation med detta kit endast bör utgöra en vägledning och att alla mutationer måste bekräftas genom ytterligare analys, t.ex. DNA-sekvensering. 3 Principer för SURVEYOR Scan NRAS mutationsdetektionsanalys 3.1 KRAS och NRAS Riktade terapier för receptorn EGFR (epidermal growth factor receptor) har visat sig vara effektiva mot kolorektalcancer. Forskning har visat att cirka 40% av kolorektala tumörer bär på somatiska KRAS-genmutationer och kliniska studier har visat att mutationer i KRAS exon 2 (kodon 12 och 13) förutspår uteblivet svar på EGFR-hämmare. Undersökande studier som nyligen genomförts Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 4
3 Principer för SURVEYOR Scan NRAS mutationsdetektionsanalys har visat att patientpopulationen kan sållas ytterligare eftersom även patienter med mcrc-tumörer med ytterligare en mutation i KRAS exoner 3 och 4 eller NRAS exoner 2, 3 och 4 inte tenderade att svara på behandling som innehöll EGFR-hämmare 1-7. Detta kit är utformat för användning vid diagnostisk analys av somatiska mutationer i NRAS exoner 2, 3 & 4. SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD är en analys för att detektera alla sekvensoch små tillfogade/saknade förändringar i exoner 2, 3 & 4 i NRAS-genen. Mutationer i NRAS kodon 12, 13, 59, 61, 117 och 146 har förknippats med bristande effekt hos panitumumab. Positive Control tillhandahålls i detta kit för mutationer i kodon 12, 61 och 146. Detta kit använder Transgenomics patentskyddade SURVEYOR Nuclease-teknik och ger, då den används med DHPLC, enkel och känslig detektion av möjliga mutationer. Den kan detektera en blandning av 2-5% muterat DNA i en bakgrund av ej muterat DNA. Kontrollstudier har påvisat extremt hög överensstämmelse i väldefinierade prover med kolorektalcancer. Användning av SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD kommer att minska användarens sekvenseringbörda och även hjälpa till vid sekvenseringsbestämning då automatisk sekvenseringsprogramvara inte klarar att klargöra förekomst av låg mutationsnivå. På grund av att denna analys har en hög känslighet i förhållande till Sanger-sekvensering rekommenderas att laboratoriets installation är optimerad för att undvika korskontamination av prover eller kontroller. Ett exempel på ett idealiskt laboratoriearrangemang finns i Bilaga A.4 Laboratorieinstallation för PCR-analyser. 3.2 Analys av patientprover med SURVEYOR Scan-kit SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD bör endast användas i anknytning till ett av de arbetsflöden som anges nedan. Arbetsflöde A Arbetsflöde B Patientprov Patientprov Test KRAS exoner 2, 3 och 4 samt NRAS exoner 2, 3 och 4 Rapportera resultat Test KRAS exon 2 Resultat KRAS kodon 12 eller 13 Wild-Type Test KRAS exoner 3 och 4 och NRAS exoner 2, 3 och 4 Resultat KRAS kodon 12 eller 13 mutation Rapportera resultat Rapportera resultat Figur 1 Arbetsflöden för SURVEYOR Scan mutationsdetektionskit för screening av KRAS och NRAS Se Bilaga A.1 Översikt av platta för SURVEYOR Scan kit för förslag hur en platta med 96 brunnar kan ordnas för analys av alla KRAS och NRAS exoner 2-4. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 5
3 Principer för SURVEYOR Scan NRAS mutationsdetektionsanalys 3.3 SURVEYOR Nuclease Transgenomics SURVEYOR Nuclease är en avvikelsespecifik (mismatch-specific) växtbaserad DNA - endonukleas som kan söka efter kända och okända mutationer och polymorfismer i heteroduplex DNA 8. Enzymet klyver DNA med hög precision på ställen med avvikelser i basen och andra förändringar. Denna DNA-endonukleas klipper av båda strängarna på en DNA-heteroduplex på 3 -sidan av det avvikande stället. Tillfogade/saknade och bassubstituerande avvikelser identifieras men klyvningens effektivitet varierar beroende på sekvensen på avvikelsen. Figur 2. Verkningssätt för SURVEYOR Nuclease. Endonukleasen känner igen en avvikelse och klyvs vid 3 -sidan av det avvikande stället. Detta klyver den dubbla DNA-strängen och lämnar kvar ett 3 -överhäng av ett enda baspar. SURVEYOR Nuclease har använts i många olika sammanhang för att korrekt detektera en rad mutationer och polymorfismer i gener. I synnerhet har SURVEYOR Nuclease använts för att bekräfta förekomsten av kända mutationer i ett antal gener som associeras med njurcancer, lungcancer, cancer i huvud och nacke, leukemi, livmoderscancer och för att förutsäga resultatet av strålbehandling 9,10,11. SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD har utformats för att klyva avvikelser i NRAS exoner 2, 3 och 4 för vidare analys med DHPLC. OBS! Om ett prov är 100% muterad DNA, kan inga heteroduplexer bildas och provet kommer att visas som "Wild-Type". Tumörbiopsiprover kommer emellertid att innehålla Wild- Type-celler på grund av tumörheterogenitet och/eller kontaminerande normal vävnad; notera att 5% Wild-Type kan detekteras av detta kit med spår som är identiska till 5% muterat DNA. OBS! Enbart den DNA-polymeras som tillhandahålls med detta kit ska användas för denna analys. OBS! Följ specifika anvisningar i handboken till ditt DHPLC-system. För att framgångsrikt använda detta kit rekommenderar vi att du läser igenom den här handboken och noggrant följer alla instruktioner och riktlinjer. Nya användare bör utföra de kontrollexperiment som beskrivs i avsnittet Användning av kontroll-dna-plasmider. Om du har ytterligare frågor eller behöver hjälp kan du kontakta (888) 233-9283 (endast Nordamerika), +1 (402) 452-5400 eller +44 (0) 141 892 8800 (Europa) och begära "NRASsupport". Alternativt kan du mejla oss på: SURVEYORscan@Transgenomic.com 4 Härledning av kittets kontrollsubstanser De kontrollsubstanser som tillhandahålls i detta kit är plasmida kloner av NRAS exon 2-, 3- och 4- sekvenser. Alla kloner har sekvenserats för att verifiera sekvensens överensstämmelse genom jämförelse med NCBI referenssekvens: NG_007572. Kontrollerna har en genetisk "stämpel". Se Bilaga A.2 Kontrollernas DNA-stämpel; dessa variationer av NRAS Wild-Type-sekvenser, i en region som inte förväntas ha mutationer, kan användas för felsökning vid provkontaminering av Positive Control. Se Bilaga B - Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 6
4 Härledning av kittets kontrollsubstanser Felsökningsguide, Problem 8, för ett exempel på en SURVEYOR Scan-härledning av sådan kontamination. "NRAS Control Wild-Type" konstruerades genom syntes och kloning av NRAS exoner 2, 3 och 4 med användning av ovanstående NCBI referenssekvens. "NRAS Positive Control Exon 2" konstruerades genom syntes av NRAS exon 2 med användning av ovanstående referenssekvens med G12D-mutationen. DNA-sekvensering bekräftade att den enda förändringen i sekvensen är vid kodon 12 med en G12D, GGT>GAT förändring. Denna klon blandas därefter med NRAS Control Wild-Type-DNA för att skapa en heterozygot blandning. "NRAS Positive Control Exon 3" konstruerades genom syntes av NRAS exon 3 med användning av ovanstående referenssekvens men med Q61K-mutationen. DNA-sekvensering bekräftade att den enda förändringen i sekvensen är vid kodon 61 med en Q61K, CAA>AAA förändring. Denna klon blandas därefter med NRAS Control Wild-Type-DNA för att skapa en heterozygot blandning. "NRAS Positive Control Exon 4" konstruerades genom syntes av NRAS exon 4 med användning av ovanstående referenssekvens men med A146T-mutationen. DNA-sekvensering bekräftade att den enda förändringen i sekvensen är vid kodon 146 med en A146T, GCC>ACC förändring. Denna klon blandas därefter med NRAS Control Wild-Type-DNA för att skapa en heterozygot blandning. 5 Komponenter SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD består av (1) en SURVEYOR-låda med nedbrytningskomponenter med 10 reagensrör utan tomma hål och (2) en yttre rörhållare för PCR-komponenter och kontroller med 13 reagensrör och 7 tomma hål. Katalognummer Komponent Färg på rörets lock Volym för 100 reaktioner SURVEYOR låda med nedbrytningskomponenter 710160 SURVEYOR Nuclease W Lila 2 x 105 µl 710161 SURVEYOR Enhancer W2 Svart 105 µl 708049 SURVEYOR Enhancer Cofactor Rosa 105 µl 708027 0.15 M MgCl 2 Solution Brunt 105 µl 708030 SURVEYOR Stop Solution Rött 250 µl 710153F Universal Sequencing Primer 1 (10 µm) Orange 2 x 125 µl 710153R Universal Sequencing Primer 2 (10 µm) Orange 2 x 125 µl Låda med PCR-komponenter och kontroller 703310 DNA Polymerase Rött 100 µl 703315 DNA Polymerase 10X PCR Buffer Genomskinligt 1 ml 703065 dntps (10 mm) Genomskinligt 500 µl 710452F NRAS Primer Exon 2 Forward (10 µm) Blått 90 µl 710452R NRAS Primer Exon 2 Reverse (10 µm) Blått 90 µl 710453F NRAS Primer Exon 3 Forward (10 µm) Blått 90 µl 710453R NRAS Primer Exon 3 Reverse (10 µm) Blått 90 µl 710454F NRAS Primer Exon 4 Forward (10 µm) Blått 90 µl 710454R NRAS Primer Exon 4 Reverse (10 µm) Blått 90 µl 710441 NRAS Control Wild-Type Mix Gult 120 µl 710442 NRAS Positive Control Exon 2 Grönt 40 µl 710443 NRAS Positive Control Exon 3 Grönt 40 µl 710444 NRAS Positive Control Exon 4 Grönt 40 µl 482296 Bruksanvisning Hämtas från webbplatsen* http://world.transgenomic.com/files/literature/482296-sv.pdf Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 7
5 Komponenter 5.1 Antal prover som kan testas med ett kit SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD har utformats för att kunna testa 100 reaktioner. Det totala antal prover som kan testas med kittet beror på den genomsnittliga satsstorleken som testas vid ett tillfälle eftersom en uppsättning kontrollreaktioner (Wild-Typekontroller, positiva kontroller och kontroller utan templat) måste inkluderas i varje reaktionsplatta. Tabellen nedan anger vilket antal prover som kan analyseras med ett NRAS-kit beroende på storleken på en genomsnittlig provsats. I tabellen beaktas (a) de 9 kontrollerna (3x Wild-Type, 3x positiva kontroller, 3 x kontroller utan templat) som krävs för varje körning och (b) gränsen på 100 reaktioner per kit. OBS! Om flera plattor körs, måste en uppsättning med de 9 kontroller som anges ovan köras på varje platta. Därför kräver två plattor sammanlagt 18 kontrollreaktioner, 3 plattor kräver 27 kontrollreaktioner, o.s.v. Med en större provsatsstorlek ökar antalet prover som kan testas med ett kit, vilket minskar den genomsnittliga reagenskostnaden per prov. Nedanstående tabell ger en vägledning till hur många prover som kan testas med ett enda kit. Provsatsstorlek Antal kontrollreaktioner + antal provamplikoner Antal reaktioner som krävs er körning Totalt antal provsatskörningar per kit Totalt antal prover som testas per kit 1 9 + 3 12 8 8 2 9 + 6 15 6 12 3 9 + 9 18 5 15 4 9 + 12 21 4 16 5 9 + 15 24 4 20 5.2 DNA-sekvensering Universal Sequencing Primer (PN 710153F och 710153R) tillhandahålls för användning vid DNAsekvensering av alla testade prover. De PCR-amplikoner som skapas före SURVEYOR Nucleasenedbrytning bör användas för sekvensering. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 8
6 Ytterligare nödvändig utrustning och reagenser 6 Ytterligare nödvändig utrustning och reagenser Ytterligare komponenter och utrustning som behövs för att använda SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC omfattar följande: DHPLC-system, kolumn, buffertar, DNA-storleksmarkör - se Bilaga A.3.1 DHPLC-specifikationer för SURVEYOR Scan-användningar beträffande egenskaper för ett lämpligt DHPLC-system för användning med detta kit Vatten för molekylärbiologi 0,2 ml-pcr-rör, remsor eller platta med 96 brunnar Mikropipetter Pipettspetsar Isbad Vortexblandare Mikrocentrifug Termocykler Agarosgeler och utrustning för agarosgelelektrofores 10% blekmedel eller liknande rengöringsmedel 7 Reagensberedning Alla reagenser som ingår i detta kit är användningsklara. En del komponenter behöver tinas upp, och/eller blandas i en vortexblandare eller mikrocentrifug före användning. Se mer information under Analysprocedur nedan. Reagenser behöver kombineras för att producera Master Mixblandningar och reaktionsblandningar. En fullständig beskrivning ges under Analysprocedur nedan. 8 Förvaring och hållbarhet Detta kit ska förvaras i mellan -18 ºC och -25 C i en frys med konstant temperatur tills det ska användas. Observera utgångsdatumet på varje kit du erhåller. Använd inte kittet efter passerat utgångsdatum. SURVEYOR Nuclease-blandningen som bereds i Steg 7 av SURVEYOR Nuclease-nedbrytning ska användas omedelbart eftersom SURVEYOR Nuclease W avaktiveras med tiden när det förekommer tillsammans med övriga komponenter i SURVEYOR Nuclease-reaktionsblandning. 9 Varningar och försiktighetsåtgärder Ingen av reagenserna i detta kit utgör en hälsorisk i de kvantiteter som förekommer. Transgenomics dokument nr. MSD-710400 kan hämtas från http://world.transgenomic.com/files/literature/710400-sv.pdf Det finns inga ämnen i detta kit med animaliskt eller humant ursprung som innebär en infektionsrisk. Detta kit får bara användas av personer som har utbildats i korrekta laboratorietekniker. Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och ögonskydd vid arbete med komponenterna i detta kit. Efter användningen ska kittets komponenter avyttras som sjukvårdsavfall i enlighet lokala lagar och föreskrifter. Alikvoter av reagens som pipetterats från rören i detta kit är endast avsedda för engångsbruk. Komponenterna i detta kit har validerats som fortfarande stabila efter 25 upptiningscykler. Använd inte detta kit om antalet upptiningscykler har överskridits. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 9
10 Förberedande provinsamling, hantering och förvaring 10 Förberedande provinsamling, hantering och förvaring SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 4 och 4 CE IVD för DHPLC-systemet har validerats för användning med DNA som utvunnits från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) kolorektala cancertumörprover. För optimal DNA-extraktion ska vävnaden fixeras i formalin i 14-24 timmar innan den bäddas in i paraffin. Tumörbiopsier är en heterogen blandning av tumörceller och icke-tumörceller. Vidare är själva tumören en heterogen blandning a tumörceller med mutationer och tumörceller utan mutationer mutations. Eftersom dessa somatiska mutationer kanske inte enhetligt distribueras genom hela tumören kan den mutationsanalys som görs av olika sektioner i samma tumör ge olika resultat. För att höja chanserna att detektera en mutation bör DNA-från vävnadens tumörregion isoleras genom att endast tumörområdet skrapas från objektglaset med en ny, steril skalpell för varje nytt objektglas. För framgångsrik användning av detta kit bör den extraherade DNA:n uppfylla kriterierna i Att tänka på avseende templat. OBS! Extraherade DNA-prover som inte används för omedelbar analys ska förvaras vid -20 ºC till -80 ºC. 11 Analysprocess 11.1 Somatisk mutationsdetektion med SURVEYOR Scan-kit - En översikt Detektion och bekräftelse av mutationer med SURVEYOR Nuclease omfattar tre steg: Steg 1 - Förbered PCR-amplikoner från muterat (test) och normalt (referens) DNA, och fortsätt efter den sista PCR-amplifieringscykeln med att smälta alla dubbla strängar och därefter långsamt låta dem svalna för optimal uppkomst av hetero- och homoduplexer (heteroduplexer uppstår när en sträng i en Wild-Type-sekvens härdas med en stäng av en muterad sekvens). Steg 2 Behandla den härdade heteroduplex/homoduplex-blandningen med SURVEYOR Nuclease. SURVEYOR Nuclease skär av båda strängarna av heteroduplex DNA så att DNA-fragment bildas. Control Wild-Type-DNA utgör, när den behandlas på liknande sätt, en bakgrundskontroll. Steg 3 - Analysera DNA-fragmenten på ett DHPLC-system. Formeringen av nya kluvna produkter, till följd av förekomsten av en eller flera avvikelser, påvisas genom förekomsten av ytterligare kromatografiska toppar. Migrationstiderna för de kluvna produkterna anger storleken på fragmenten och därmed avvikelsens eller avvikelsernas placering.
12 Stegvisa anvisningar 12 Stegvisa anvisningar 12.1 Installation/kalibrering av DHPLC När SURVEYOR Nuclease-plattan ställs in för analys av DHPLC, se Bilaga A.3 Systemkrav för denaturering med HPLC (DHPLC). 12.2 Att tänka på före NRAS-provanalys Innan prover körs på ett DHPLC-system måste en lämplig DNA-storleksmarkör köras för att tillförsäkra att systemet fungerar korrekt. Laboratoriepersonal som använder instrumentet bör kontrollera DNA-storleksmarkörens kvalitet innan analysen startas. 12.3 Att tänka på avseende templat 1. För FFPE isolerad DNA-templat, använd normala laboratorierutiner för att bedöma kvalitet och kvantitet på extraherad DNA för att se till att det finns tillräcklig templat för PCR. 2. 260/280 absorptionsförhållandet ska vara >1,80 3. För att underlätta PCR-inställningen bör den effektiva koncentrationen av templat justeras till cirka 12,5 ng/µl. Späd vid behov ut DNA-templaten med vatten för molekylärbiologi. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 11
12 Stegvisa anvisningar 12.4 Att tänka på avseende arbetsflöde Kittet är avsett att möjliggöra analys av 100 reaktioner. Mindre provsatser kan köras, men kitkontroller och en "kontroll utan templat" måste inkluderas med varje provsats. Det finns tillräckligt med kontrollsubstans i kittet för 100 reaktioner av provomgångar av alla olika storlekskombinationer. I allmänhet bör bearbetning av alla prov utföras från början till slut enligt beskrivningen i den här bruksanvisningen. Om bearbetningen av ett prov stoppas innan alla steg är klara, ska DNA förvaras i -20 C vid angivna tillfällen. Man bör dock undvika att utsätta ett fruset prov för upprepad upptining och förvaring (-18 till -25 C) av PCR-amplifierad DNA eller SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter under längre perioder (>1 vecka). Analys av prover bör följa nedan illustrerade arbetsflöde: Skrapa Vävnaden 1 DNAisolering och PCR 2 3 Gelelektroferes 5 SURVEYOR Scan Misslyckades SURVEYOR Scan Positiv Ange Robust/Svag PCR 4 SURVEYOR Nuclease-och DHPLC-analys SURVEYOR Scan Negativ 7 Sekvensbekräftelse 6 NVD 8 Kvalitetskontroll för sekvensen misslyckades Kvalitetskontroll för sekvensen godkänd 9 Mutationer i kodon G12, G13, A59, Q61, K117 eller A146 NVD Figur 3: Arbetsflöde för analys med SURVEYOR Scan NRAS kit Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 12
12 Stegvisa anvisningar Anmärkningar till figur 3 1. Isolera DNA från FFPE med vedertagen laboratoriepraxis. 2. Utför PCR och kontrollera DNA-kvaliteten genom att gelelektrofores. 3. Registrera om PCR-bandet är robust ( 20 ng/µl) eller svagt (<20 ng/µl). Om det finns flera PCR-band ska ny genomisk DNA beredas från FFPE. 4. Gå vidare till SURVEYOR Nuclease-behandling och DHPLC systemanalys med prover som angetts som antingen robust PCR eller svag PCR efter PCR-amplifiering. Observera ett det vid en svag PCR-bestämning kan finnas otillräcklig DNA för att få meningsfulla resultat genom DHPLC, men det kan finnas tillräckligt med DNA för sekvensering. 5. Se Bilaga B Felsökningsguide för exempel på misslyckade SURVEYOR Scanresultat. Alla prover med ett misslyckat SURVEYOR Scan-resultat bör köras om antingen genom att: a. upprepa PCR om det finns tillräckligt med genomisk DNA kvar b. extrahera DNA på nytt från FFPE; detta bör vara andrahandsalternativet eftersom det som regel inte är önskvärt att skära ytterligare ett FFPE-block. c. om ytterligare en sektion eller block används måste hela analysen upprepas eftersom avvikelser i nedbrytningen kan bero på tumörheterogenitet. 6. Om det inte finns några synliga klyvningstoppar ska ett negativt SURVEYOR Scanresultat registreras, d.v.s. = ingen avvikelse detekterad. 7. Om ett prov visar SURVEYOR Nuclease klyvningsprodukter (matchar inte relevant Wild- Type Control) ska dessa skickas till sekvenseringsbekräftelse. 8. Om sekvensbekräftelseanalysen inte godkänns, ska man antingen: a. upprepa PCR om det finns tillräckligt med genomisk DNA kvar b. extrahera DNA på nytt från FFPE; detta bör vara andrahandsalternativet eftersom det som regel inte är önskvärt att skära ytterligare snitt från ett FFPE-block. 9. Om sekvensbekräftelsen är godtagbar betyder resultatet antingen: a. Wild-Type-sekvens, d.v.s. ingen avvikelse detekterad (NVD -No Variant Detected); eller b. Avvikelse detekterad. Om sekvensbekräftelsen visar någon basförändring som leder till aminosyraförändring vid: i. kodon 12 ii. kodon 13 iii. kodon 59 iv. kodon 61 v. kodon 117; eller vi. kodon 146 bedöm som positiv för NRAS-mutation. Obs! Det är möjligt att ha en positiv SURVEYOR Scan-bestämning som också ger resultatet "Ingen avvikelse detekterad" vid ett sekvensbekräftelsetest. Detektionsnivån (LOD) för SURVEYOR Nuclease på ett DHPLC-system är så låg som 2% mutation i 98% Wild-Type-DNA för vissa mutationer, medan LOD för sekvensering är cirka 10-25% mutation i 90-75% Wild-Type- DNA. OBS! om ett prov är 100% muterat DNA, kan inga heteroduplex bildas och provet kommer att visas som "Wild-Type". Tumörbiopsiprover kommer emellertid att innehålla Wild-Type-celler på Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 13
12 Stegvisa anvisningar grund av tumörheterogenitet och/eller kontaminerande normal vävnad; 5% Wild-Type kan detekteras av detta kit med spår som är identiska med 5% muterat DNA. OBS! Positiva SURVEYOR Scan-resultat kan bero på andra basförändringar än de som har befunnits vara NRAS-aktiverande. Dessa mutationer är sällsynta och måste bekräftas av en annan metod för att fastställa om det positiva SURVEYOR Scan-resultatet är en NRAS-aktiverande mutation eller ej. OBS! Den formalinfixationsprocess som används vid beredning av FFPE-tumörbiopsiprover kan orsaka deaminering av cytosin. Denna deaminering omvandlas cytocin till uracil. Polymerasen kommer att "läsa" denna uracil som en tymin och införliva en adenin i de kopierade strängarna. Detta kommer sedan att se ut som en mutation där den normala G nu har bytts ut mot A som orsakar en G/C- till A/T-mutation, vilket är en artefaktmutation på grund av fixationsprocessen och inte en äkta somatisk mutation. Detta förekommer sällan, men om de kopieras tidigt under PCRcykeln kommer de att "se ut som" mutationer. De upprepas ej vid omanalys. Exempel på en potentiell cytosindeamineringsmutation som skulle kunna beaktas vid beslut av patientvård NRAS A146T. - Kodon 146: GCC>ACC (A146T) Därför rekommenderas att sådana mutationer bekräftas med duplikatanalys av samma genomiska DNA eller att alla prover omfattas av duplikatanalys från analysens början. 12.5 Amplifieringsprotokoll 1. Transgenomics förblandade dntp-lösning (PN 703065) tillhandahålls med en koncentrationsgrad av 10 mm total deoxinukleotid (2,5 mm av var och en av de fyra deoxinukleotiderna). 2. NRAS Exon 2, Exon 4A och Exon 4B Forward och Reverse PCR-primers (PN 710157F/R, 710154F/R and 710156F/R) levereras vid 10 µm. 3. Ta ut 10 µm-primrar, 10 mm dntp:er och DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN 703315) ur frysen och tina på is. 4. Vortexblanda alla komponenter efter upptining (~10 sekunder) så att de blandas noga, centrifugera en kort stund (~10 sekunder) för att tillförsäkra att ingen vätska finns kvar på rörens lock och lägg på is. 5. Förbered Master Mix-blandningen på is. 6. Använd följande tabell som vägledning för beredning av Master Mix för var och en av reaktionerna NRAS Exon 2, NRAS Exon 3 och NRAS Exon 4: Antal reaktioner: 10 Volymberäkning: Vattenvolym (µl) 330** DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl) 50 dntp (µl) 40 NRAS Primer Exon 2, 3 eller 4 Forward (µl) 25 NRAS Primer Exon 2, 3 eller 4 Reverse (µl) 25 DNA Polymerase (µl) 10 Total volym Master Mix 48,0 **OBS! Användaren bör sträva efter att ha minst 25 ng DNA per 50 µl reaktion. När de extraheras är DNA-koncentrationerna mindre än 12,5 ng/µl, öka volymen extraherats DNA proportionerligt för att tillförsäkra 25 ng per reaktion. Minska vidare volymen vatten i Master Mix-blandningarna med samma mängd för att få 50 µl per reaktion. Alla prover som prepareras med dessa Master Mix-blandningar kommer att behöva extraherad DNA som har spätts ut till ungefär samma lägsta koncentrationsgrad. Vi rekommenderar inte att koncentrationer av extraherad DNA på <5 ng/µl används. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 14
12 Stegvisa anvisningar 7. Beräkna nödvändiga volymer för varje Master Mix med användning av ovanstående tabell. Observera att: (a) För Master Mix 1, NRAS Exon 2, krävs ytterligare tre reaktioner för NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 2 samt NRAS Exon 2 kontroll utan templat (NTC1). (b) För Master Mix 2, NRAS Exon 3, krävs ytterligare tre reaktioner för NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 3 samt NRAS Exon 3 kontroll utan templat (NTC2). (c) För Master Mix 3, NRAS Exon 4, krävs ytterligare tre reaktioner för NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 4 samt NRAS Exon 4 kontroll utan templat (NTC3). OBS! Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs för att ge utrymme för visst svinn vid pipettering. 8. Märk 0,2 ml PCR-rören eller brunnarna i en platta med 96 brunnar med lämplig provinformation. 9. Märk 2,0 ml centrifugeringsrör för preparering av Master Mix -blandning. 10. Tillsätt nödvändig volym vatten för molekylärbiologi till 2,0 ml centrifugeringsrör som är märka Master Mix. 11. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase 10X PCR Buffer till Master Mix-rören. 12. Tillsätt nödvändig mängd 10 mm dntp:er till Master Mix-röret. 13. Tillsätt nödvändig mängd NRAS Forward Primers till respektive Master Mix-rör. 14. Tillsätt nödvändig mängd NRAS Reverse Primers till respektive Master Mix-rör. 15. Ta ut DNA Polymerase (PN 703310) ur frysen. 16. Centrifugera DNA Polymerase i ~10 sekunder. 17. Vortexblanda DNA Polymerase i ~10 sekunder. 18. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase till Master Mix-rören. 19. Förslut Master Mix-rören. 20. Vortexblanda Master Mix-rören i ~30 sekunder och centrifugera dem under en kort stund i ~10 sekunder före användning. 21. Förvara på is tills det används. 22. Pipettera 48,0 µl (se anmärkning ovan i steg 69 av Master Mix i lämpliga brunnar och byt pipettspets om du använder en enda kanalpipett. Se till att det inte spiller eller stänker mellan brunnarna om en repeterpipett används. Förvara plattan på is. 23. Tillsätt 2,0 µl (se anmärkning ovan i steg 6) av varje provtemplat-dna eller vatten (NTC - no template control) till lämpliga brunnar. Använd separata pipettspetsar för varje prov och undvik korskontaminering av proverna genom stänk. Förslut brunnarna med prov-dna och NTC med remsor med 8 proppar (om en platta med 96 brunnar används) eller förslut 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. 24. Endast därefter ska kittets kontrolltemplat-dna-rör (PN 710131, 710136, 710137, 710138) öppnas ett i taget. Pipettera 2,0 µl av var och en av kontrolltemplaten sist för att minska risken för att något prov-dna kontamineras. Förslut återigen varje brunn med remsor med 8 proppar (om en platta med 96 brunnar används) eller förslut 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. OBS! Det är god laboratoriepraxis att placera kontroller utan templat (NTC) i brunnar som inte ligger intill Positive Control eller prover. OBS! Se Bilaga A.1 Översikt av platta för SURVEYOR Scan kit för förslag hur en platta med 96 brunnar kan ordnas för analys av alla KRAS och NRAS exoner 2-4. 25. Vortexblanda (~1/2 hastighet) i 10 sekunder. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 15
12 Stegvisa anvisningar 26. Centrifugera i 1-2 minuter för att tillförsäkra att alla lösningar samlas i botten av brunnarna eller rören. Kontrollera att lösningarna ligger i botten av varje brunn eller rör. Centrifugera på nytt i annat fall. 12.6 Termocykelprogram för amplifieringsprotokoll 1. Använd följande termocyklerprotokoll för PCR -amplifiering och heteroduplexformering: 15 cykler 30 cykler Inledande denaturering 95 C 5 minuter Touchdown-amplifiering 95 C 30 sekunder 62 C, -0,5 ºC/cykel 30 sekunder 72 C 25 sekunder Amplifiering 95 C 30 sekunder 55 C 30 sekunder 72 C 25 sekunder Slutgiltig förlängning 1 cykel 72 C 2 minuter Heteroduplex formering 95 ºC 2 minuter 12 C 12.7 Kvalitetskontroll av PCR-produkter Paus 1. Kvaliteten och kvantiteten på amplikoner bör kontrolleras med gelelektrofores (eller motsvarande) innan du fortsätter med SURVEYOR Nuclease-nedbrytning. 2. Analysera en alikvot av PCR-produkt tillsammans med flera olika mängder av en 100-bp DNA-stege. 3. Använd stegen till att beräkna koncentrationen av amplifierad DNA. 4. Bara ett enda band >20 ng/µl som motsvarar huvud-pcr-produkten ska synas. 5. Om det finns flera band, se till att kvaliteten på tillsatt DNA-templat var tillräckligt god (se Bilaga B Felsökningsguide). 6. Om ingen produkt kan iakttas, se till att kvaliteten på tillförd DNA-templat var tillräckligt god (se Bilaga B Felsökningsguide). Om kvaliteten motsvarar specifikationerna, ska du öka volymen på templatet till 4,0 µl per 50 µl reaktion (minska vattenmängden per reaktion till 31,0 µl). 7. Inga PCR-produkter ska synas i kontrollprovet utan templat. Om DNA-produkt kan iakttas är kontrollen troligen kontaminerad, se Bilaga B Felsökningsguide. 8. Ange PCR som robust eller svag PCR. a. Robust PCR ska ha ett enda band med minst 20 ng/µl. b. Svag PCR ska ha ett enda band med mindre än 20 ng/µl. c. Fortsätt med SURVEYOR Nuclease-nedbrytning vid såväl robusta som svaga PCR-bedömningar. TIPS: I det här stadiet kan PCR-produkter förvaras vid -20 ºC eller kallare i upp till en vecka. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 16
12 Stegvisa anvisningar 12.8 SURVEYOR Nuclease-nedbrytning 1. När PCR-provet har bedömts vara av tillräckligt hög kvalitet och kvantitet, utför nedbrytning med SURVEYOR Nuclease enligt beskrivningen nedan. 2. Tina rören med 0,15 M MgCl 2 Solution och SURVEYOR Enhancer Cofactor på is. 3. Tillsätt 10,0 µl av varje PCR-amplifierat prov till ett nytt 0,2 ml PCR-rör eller brunn på en platta med 96 brunnar. 4. Bered en ny blandning 0,15 M MgCl 2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 och SURVEYOR Nuclease W (SURVEYOR Nucleaseblandning). Använd följande tabell som en vägledning för beredning av Master Mix för SURVEYOR Nucleasenedbrytning för analys av flera prover. Nedanstående exempel har volymer för en Master Mix för 10 prover. Tänk på att en Master Mix-volym som är något större än denna beräkning krävs för att ge utrymme för svinn vid pipettering. Antal SURVEYOR Nuclease-nedbrytningsreaktioner: 10 Volymberäkning: 0,15 M MgCl 2 Solution (µl) 10,0 SURVEYOR Enhancer Cofactor (µl) 10,0 SURVEYOR Enhancer W2 (µl) 10,0 SURVEYOR Nuclease W (µl) 20,0 Total volym Master Mix: 50,0 Tillsätt 5 µl SURVEYOR Nuclease Master Mix till varje PCR-amplifierat prov (µl) 10,0 Total volym SURVEYOR Nucleasenedbrytningsreaktion: 15,0 a. Centrifugera alla reagenser före användning. b. Vortexblanda varje reagens försiktigt före pipettering; centrifugera under en kort stund i ~10 sekunder efter varje vortexmoment. c. För varje nedbrytning, tillför följande komponenter till ett 0,2 ml PCR (eller större) mikrocentrifugeringsrör. 1,0 µl 0,15 M MgCl 2 Solution (PN 708027) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 708049) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer W2 (PN 710161) 2,0 µl SURVEYOR Nuclease W (PN 710160) Eller tillsätt 5 µl Master Mix som beretts enligt ovanstående tabell. 5. Vortexblanda försiktigt Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning i 10 sekunder på låg hastighet. 6. Centrifugera Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning i 10 sekunder på låg hastighet. 7. Placera Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning på is tills den är redo att användas. OBS! Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning som beretts i steg 7 ska användas omedelbart eftersom SURVEYOR Nuclease W blir inaktivt över tid vid förekomst av de övriga komponenterna i Master Mix för SURVEYOR Nucleasenedbrytning. 8. Pipettera 5,0 µl-alikvot av Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning i varje rör eller brunn med 10,0 µl alikvot av amplifierad PCR-produkt (se steg 3 ovan).
12 Stegvisa anvisningar 9. När pipetteringen är klar, centrifugera 0,2 ml PCR-rör eller plattan med 96 brunnar i 10 sekunder. 10. Vortexblanda försiktigt 0,2 ml PCR-rör eller plattan med 96 brunnar i 10 sekunder. 11. Centrifugera i 10 sekunder med låg hastighet (detta moment är extra viktigt om nedbrytningen sker i ett instrument som saknar uppvärmt lock). 12. Inkubera vid 42 C i 30 minuter. 13. Tillsätt 1,0 µl SURVEYOR Stop Solution (PN 708030) i varje rör eller brunn och vortexblanda försiktigt (total SURVEYOR Nuclease-reaktionsvolym är 16,0 µl). TIPS: SURVEYOR nedbrytningsprodukter kan lagras vid -20 ºC i upp till en vecka. 14. Ladda provnedbrytningarna i ett DHPLC-system. OBS! För föreslagna gradientinställningar för DHPLC-systemet för analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar, besök http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/geneticanalysis-kits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings. 13 Kontrollrutiner 13.1 Kvalitetskontroll av SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD Kontroll-DNA-plasmider ingår i detta kit för att tillhandahålla kvalitetskontroller vid speciella steg i analysprocessen. För amplifieringsprotokollet, erbjuder dessa kontroller ett sätt att säkerställa att Master Mix-blandningarna är korrekt preparerade och att amplifieringen fungerar korrekt. Kontrollsubstanser utan templat (där vatten tillförs istället för DNA-templat) krävs också för att kontrollera förekomsten av eventuell kontamination av kitkomponenter från ett ovidkommande DNA-templat. I nedbrytningsstadiet av SURVEYOR Nuclease, tillhandahåller amplikonerna från kontroll-dnaplasmider en effektiv kontroll av klyvningsreaktionsförhållanden (beredning av Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning och inkubationsförhållanden) har varit tillfredsställande. I analysstadiet ger DHPLC-systemets kromatogram av SURVEYOR Nuclease-nedbrutna kontrollamplikoner en vägledning huruvida klyvningsprodukttopparna motsvarande de mutationerna i NRAS exoner 2, 3 och 4 kommer att elueras även vid låga nivåer (se Figurer 4-6). Klyvningsprodukttoppar som motsvarar andra mutationer i NRAS exoner 2, 3 och 4 kan elueras i något avvikande positioner. Om PCR-amplikonerna inte motsvarar resultaten som beskrivs i Kvalitetskontroll av PCRprodukter, se Bilaga B - Felsökningsguide eller kontakta Transgenomics tekniska support innan du går vidare med ytterligare provanalyssteg. 13.2 Användning av kontrollplasmid-dna Detta kit är utrustat med fyra kontroll-dna: NRAS Control Wild-Type; PN 710441 NRAS Positive Control Exon 2; PN 710442 NRAS Positive Control Exon 3; PN 710443 NRAS Positive Control Exon 4; PN 710444 Dessa kontroll-dna är plasmider med tillägg. De Positive Control innehåller två plasmider vardera: en blandning av NRAS Control Wild-Type och en mutationsklon som skiljer sig från Wild-Type vid ett enstaka baspar. Kontrollerna tillhandahålls i separata flaskor, var och en med en koncentration på 10 5 kopior/µl. NRAS Exons 2, 3 och 4 Forward och Reverse PCR-primrar som krävs för PCR-amplifiering levereras separat i kittet. Följ instruktionerna i Amplifieringsprotokoll, SURVEYOR Nucleasenedbrytning och Analys av NRAS Exons 2, 3 & 4 med SURVEYOR Nuclease för användning av dessa kontroller. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 18
12 Stegvisa anvisningar VI REKOMMENDERAR STARKT ATT NYA ANVÄNDARE FÖRST UTFÖR EXPERIMENTEN MED ENBART KONTROLLSUBSTANSERNA INNAN TESTNING GÖRS PÅ GENOMISKA PROVER 14 Tolkning av resultat 14.1 Analys av NRAS Exons 2, 3 & 4 med SURVEYOR Nuclease För jämförelse och kontroll ska man ALLTID utföra SURVEYOR Nuclease-nedbrytning på var och en av kontrollerna (Wild-Type och Positive Control), en kontroll utan templat, samt prov-dna som ska köras med samma provplatta i samma DHPLC-system. I nedbrytningsstadiet av SURVEYOR Nuclease, tillhandahåller amplikonerna från dessa kontrollplasmid-dna en effektiv kontroll att förhållandena för klyvningsreaktion (beredning av SURVEYOR Nuclease-blandning och inkuberingsförhållanden) var tillfredsställande. I analysstadiet ger DHPLC-systemets kromatogram av SURVEYOR Nuclease-nedbrutna kontrollamplikoner en vägledning om var DNA-fragmenten efter klyvningen vid dessa specifika mutationers avvikelseställe kommer att elueras, även vid låga nivåer (se Figurer 4-6). Om antingen PCR-amplikonerna eller SURVEYOR Nuclease-klyvningsfragment som härletts av kontroll-dna inte motsvarar beskrivna resultat, se Bilaga B -Felsökningsguide eller kontakta Transgenomics tekniska support innan nästa steg i provanalysen tas. Nedanstående exempel är endast i illustrationssyfte och ska INTE användas för att fastställa identiteten hos någon viss mutation. Bekräftelse av identiteten hos en mutation krävs för att oåterkalleligt fastställa förekomsten av en specifik basförändring i exonerna 2, 3 eller 4 i NRASgenen. SURVEYOR Nuclease klyver vid alla avvikelser som uppstår till följd av heteroduplex formering mellan Wild-Type och muterat DNA, inte bara mutationer i exoner 2, 3 eller 4. SURVEYOR Nuclease bekräftar att en avvikelse förekommer. Mutationens specifika basförändringsidentitet krävs för bestämning av NRAS-aktiverande status och den måste bekräftas med en annan metod, t.ex. sekvensering. 14.2 Granskning av SURVEYOR Scan-resultat Inspektera kromatogrammen och jämför de för Wild-Type och Positive Control med provets. Fastställ om provets kromatogram liknar Wild-Type-mönstret eller ej. Om det är annorlunda bör provet betraktas som "SURVEYOR Scan-positivt" och skickas till DNA-sekvensanalys. Exempel på sådana prov finns i Figur 4-6 och Bilaga B Felsökningsguide, Problem 7 och 8. Ett prov med SURVEYOR Nuclease-mönster som skiljer sig från mönstret för Wild-Type bör skickas för sekvensbekräftelse även om det inte är identiskt med den positiva kontrollen. Ett exempel på ett sådant prov finns i Bilaga B Felsökningsguide, Problem 7. Zooma vid behov in på området av intresse och lägg provets kromatogram ovanpå Wild-Type Control för den amplikonen. Notera skillnader mellan Wild-Type Control och det analyserade provet. Viktigt! Efter en grundlig genomgång av varje prov bör datagranskaren undersöka om intilliggande prover i analysplattan har identiska positiva SURVEYOR Scan-resultat. Om identiska positiva resultat förekommer kan de bero på korskontamination av prov eller kontroll och analysen måste upprepas. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 19
14 Tolkning av resultat 14.3 Exempel på resultat Exempel på resultat som erhållits med SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC visas i Figurer 4-6, nedan. I dessa exempel har den metod som beskrivs i Stegvisa anvisningar med användning av WAVE 4500-system med såväl UV- som fluorescensdetektorer, följts exakt. För föreslagna gradientinställningar för DHPLC-system för analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar, besök http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysiskits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings. Figur 4A DHPLC genomflöde G12D-avkastning 88- och 148-bpfragment Okluven 236-bp amplikon NRAS Control Wild-Type NRAS-kontroll Exon 2 Okluven Prov 1, NRAS Exon 2 200-bp Prov 2, NRAS Exon 2 amplikon DNA-storleksmarkör DHPLCavrinning Figur 4B G12D-avkastning 88- och 148-bpfragment NRAS Control Wild-Type NRAS-kontroll Exon 2 Okluven Prov 1, NRAS Exon 2 200-bp Prov 2, NRAS Exon 2 amplikon DNA-storleksmarkör Okluven 236-bp amplikon Figurerna 4A och 4B: WAVE DHPLC-analys med UV-detektion (Figur 4A) och fluorescensdetektion (Figur 4B) av SURVEYOR Nuclease-nedbrytning av NRAS Positive Control Exon 3 och Wild-Type Control samt CRC DNA som isolerats från FFPE-sektioner. Vid visuell granskning av kromatogrammen ska de nedbrutna proverna jämföras med NRAS Control Wild-Type (blå linje). NRAS Positive Control Exon 2 (grön linje) är en blandning av Wild- Type och muterade G12D-plasmider som ger nedbrytningstoppar på 88 och 148 bp; denna kontroll visar att nedbrytningsmomentet i SURVEYOR Nuclease fungerar och visar det område i kromatografen som bör undersökas visuellt för att fastställa om ett prov ska skickas för DNAsekvensanalys. När nedbrytningsmönster jämförs för proverna 1 och 2 med Wild-Type-nedbrutet elektroferogram är det uppenbart att prov 1 (röd linje) har sannolika mutationer och bör sekvenseras för att bekräfta förekomst eller frånvaro av en mutation i relevant kodon. Prov 2 (svart linje) har liknande kromatogram som de som observeras för NRAS Control Wild-Type och behöver inte skickas för DAN-sekvensanalys. Observera att sekvenseringsresultatet är det definitiva Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 20
14 Tolkning av resultat resultatet eftersom det kan finnas andra ej relevanta mutationer som kan ge samma fregmentstorlekar. Figur 5A DHPLC genomflöde Q61K-avkastning 78- och 125-bpfragment DHPLCavrinning Okluven 203-bp amplikon NRAS Control Wild-Type NRAS-kontroll Exon 3 Okluven Prov 1, NRAS Exon 3 200-bp Prov 2, NRAS Exon 3 amplikon DNA-storleksmarkör Figur 5B Q61K-avkastning 78- och 125-bpfragment NRAS Control Wild-Type NRAS-kontroll Exon 3 Okluven Prov 1, NRAS Exon 3 200-bp Prov 2, NRAS Exon 3 amplikon DNA-storleksmarkör Okluven 203-bp amplikon Figurerna 5A och 5B: WAVE DHPLC-analys med UV-detektion (Figur 5A) och fluorescensdetektion (Figur 5B) av SURVEYOR Nuclease-nedbrytning av NRAS Positive Control Exon 3 och Wild-Type Control samt CRC DNA som isolerats från FFPE-sektioner. Vid visuell granskning av kromatogrammen ska de nedbrutna proverna jämföras med NRAS Control Wild-Type (grön linje). NRAS Positive Control Exon 3 (blå linje) är en blandning av Wild- Type och muterade Q61K-plasmider som ger nedbrytningstoppar på 78 och 125 bp; denna kontroll visar att nedbrytningsmomentet i SURVEYOR Nuclease fungerar och visar det område i kromatografen som bör undersökas visuellt för att fastställa om ett prov ska skickas för DNAsekvensanalys. När nedbrytningsmönster jämförs för proverna 1 och 2 med Wild-Type nedbrutet elektroferogram är det uppenbart att prov 1 (röd linje) har en sannolik mutation och bör sekvenseras för att bekräfta förekomst eller frånvaro av en mutation i relevant kodon. Prov 2 (svart linje) har liknande kromatogram som de som observeras för NRAS Control Wild-Type och behöver inte skickas för DNA-sekvensanalys. Observera att sekvenseringsresultatet är det definitiva resultatet eftersom det kan finnas andra ej relevanta mutationer som kan ge samma fregmentstorlekar. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 21
14 Tolkning av resultat Figur 6A DHPLC genomflöde Okluven 233-bp amplikon NRAS Control Wild-Type NRAS-kontroll Exon 4 Okluven Prov 1, NRAS Exon 4 200-bp Prov 2, NRAS Exon 4 amplikon DNA-storleksmarkör A146T-avkastning 68- och 165-bpfragment DHPLCavrinning Figur 6B A146T-avkastning 68- och 165-bpfragment NRAS Control Wild-Type NRAS-kontroll Exon 4 Okluven Prov 1, NRAS Exon 4 200-bp Prov 2, NRAS Exon 4 amplikon DNA-storleksmarkör Okluven 233-bp amplikon Figurerna 6A och 6B: WAVE DHPLC-analys med UV-detektion (Figur 6A) och fluorescensdetektion (Figur 6B) av SURVEYOR Nuclease-nedbrytning av NRAS Positive Control Exon 4 och Wild-Type Control samt CRC DNA som isolerats från FFPE-sektioner. Vid visuell granskning av kromatogrammen ska de nedbrutna proverna jämföras med NRAS Control Wild-Type NRAS Control Wild-Type (grön linje). NRAS Positive Control Exon 4 (blå linje) är en blandning av Wild-Type och muterade A146T-plasmider som ger nedbrytningstoppar på 68 och 165 bp; denna kontroll visar att nedbrytningsmomentet i SURVEYOR Nuclease fungerar och visar det område i kromatografen som bör undersökas visuellt för att fastställa om ett prov ska skickas för DNA-sekvensanalys. När nedbrytningsmönstren för prov 1 och 2 jämförs med Wild- Type nedbrutet elektroferogram, är det tydligt att proverna 1 och 2 (röda och svarta linjer)( har likartade kromatogram som NRAS Control Wild-Type och de behöver inte skickas för DNAsevkensanalys. Observera att för positiva Surveyor Scan-resultat är sekvenseringsresultatet det definitiva resultatet eftersom det kan finnas andra ej relevanta mutationer som kan ge samma fregmentstorlekar. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 22
15 Prestationsegenskaper 15 Prestationsegenskaper 15.1 LOD för mutationer med SURVEYOR Scan-kit Validering av SURVEYOR Scan-kitten för DHPLC-plattformar med användning av plasmidkloner av alla indicerade mutationer har visat att SURVEYOR Nuclease-toppar kan detekteras i en blandning av 2-5% mutation i en Wild-Type-bakgrund. Automatiserad sekvenseringsbestämning av både framåt och bakåt -strängar misslyckas ofta med att detektera mutationer i blandningar med mindre än 10% Wild-Type-DNA. Tillsammans med resultaten från SURVEYOR Nuclease är det möjligt att med högre säkerhet tolka elektroferogram om 5-10% för mutant sekvensering. Om analysen visar ett positivt SURVEYOR Scan-resultat, men utan detekterbar KRAS- eller NRAS-mutation med DNA-sekvensering, rekommenderar vi att resultatet "Ingen avvikelse detekterad" registreras. Ytterligare detaljer finns i avsnittet Att tänka på avseende arbetsflödet. 15.2 Sekvensbekräftelse Fortsätt med sekvensbekräftelse för alla positiva SURVEYOR Scan-resultat för att fastställa sekvensidentiteten för KRAS Exon 2-, 3- eller 4-mutationer. Fortsätt inte med sekvenseringsinformation om SURVEYOR Scan-resultatet var negativt. Provet kan rapporteras som Wild-Type eller ingen avvikelse detekterad. Universal Sequencing Primer som inkluderas i kittet är avsedda för sekvensbekräftelse. Framåtprimer är PN 710153F (Universal Sequencing Primer 1) och bakåtprimer är PN 710153R (Universal Sequencing Primer 2). 15.3 Analysprocessens begränsningar Kontaminerande ämnen som överförs genom extraktion av formalinfixerade paraffininbäddade prover kan inverka negativt på PCR-amplifieringen och nedbrytningsprocessen med SURVEYOR Nuclease. Rutinerna för kvalitetskontroll som beskrivs under Kvalitetskontroll av PCR-produkter säkerställer att extraherad DNA är lämplig för användning i detta kit. Detta kit har validerats för analys av formalinfixerade paraffininbäddade kolorektala cancertumörprover. Det har inte validerats för diagnostisk användning med andra cancertyper eller med färska eller frysta biopsiprover. Läs i Bilaga B- Felsökningsguide, nedan, för felsökning av onormala resultat och information om faktorer som kan påverka analysen. Försiktighet måste iakttas för att undvika överföring och korskontamination med detta kit. På grund av analysmetodens extrema känslighet, måste försiktighetsåtgärder vidtas vid följande punkter: Se till att alla prover hanteras på ett sådant sätt att korskontamination mellan prover inte kan förekomma Arbeta i en PCR-arbetsstation eller annat lämpligt utrymme där arbetsområdet kan utsättas för UV-ljus innan PCR-amplifieringsreaktionerna ställs in. Använd en separat PCR-arbetsstation eller ett separat rum för att öppna proverna efter PCR-amplifiering för kvalitetskontroll med gelelektrofores. Förberedelse för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning bör göras i ett separat rum eller på en annan PCR-arbetsstation än den arbetsstation där inledande PCR ställdes in. Se till att kittets plasmidkontroller hanteras separat från testproverna under alla stadier i analysen. o Kontrollera att alla lösningar, kontroll utan templat, samt prov-dna-brunnar är förslutna innan rören med kontrollplasmid-dna öppnas.
15 Prestationsegenskaper o o KONTROLLER SKA HANTERAS SIST. Tillsätt kontrollplasmid-dna till relevanta rör först EFTER DET ATT ALLA kontroller utan templat och provbrunnar har förslutits. När kontroll-dna-rören har förslutits ska ALLA rör och lock torkas av med ett medel som utplånar DNA (t.ex. 10% blekmedel) innan de överförs till ett annat område. Se till att pipettering av prover i plattor med 96 brunnar inte möjliggör provkontamination av intilliggande brunnar på grund av stänk vid blandningen eller på grund av att pipettspetsarna inte bytts ut. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 24
Bilaga A Bilaga A A.1 Översikt av platta för SURVEYOR Scan kit Den översikt av plattan som föreslås nedan är för SURVEYOR Scan-analys för alla sju KRAS och NRAS exoner samtidigt i 10 prover. Förklaring: Ex = Exon; WT = Wild-Type; Mut = Mutation; NTC = No Template Control (kontroll utan templat) A.2 Kontrollernas DNA-stämplar Sekvenserna med en "stämpel" anges nedan. Förklaring: De vanligaste mutationsområdena markeras med Lila. Sekvenser med VERSALER är kodande baser; ej kodande baser anges med gemener. Kontrollernas genetiska "stämpel" är markerad i Gult; denna avvikelse från NRAS Wild- Type-sekvensen, i en region som inte förväntas ha mutationer, kan användas för att felsöka provkontamination av Positive Control. Se Bilaga B - Felsökningsguide, Problem 8, för ett exempel på en SURVEYOR Scan-härledning av sådan kontamination. NRAS Exon 2-"stämpel" Amplikonstorlek: 236 bp. För att skapa NRAS har Exon 2-kontrollplasmidens genetiska stämpel aca ändrats till tgt. Kodon 12 och 13 har också markerats nedan. ccatgtggttcttgctggtgtgaaatgactgagtacaaactggtggtggttggagcaggtggtgtt NRAS Exon 3-"stämpel" Amplikonstorlek: 203 bp. För att skapa NRAS har Exon 3-kontrollplasmidens genetiska stämpel GAC ändrats till CTG. Kodon 59 och 61 har också markerats nedan. ACAGCTGGACAAGAAGAGTACAGTGCCATGAGACTGCAA NRAS Exon 4-"stämpel" Amplikonstorlek: 233 bp. För att skapa NRAS har Exon 4-kontrollplasmidens genetiska stämpel CAA ändrats till GTT. Kodon 117 och 146 har också markerats nedan. AACAAGTGTGATTTGCCAACAAGGACAGTTGATACAAAAGTTGCCCACGAACTGGCCAAGAGTTACGGG ATTCCATTCATTGAAACCTCAGCCAAG Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 25
Bilaga A A.3 Systemkrav för denaturering med HPLC (DHPLC) A.3.1 DHPLC-specifikationer för SURVEYOR Scan-användningar Följande specifikationer är minimikrav för DHPLC-systemets specifikationer för att utföra analyser med SURVEYOR Scan KRAS- och NRAS-kittet. Tillförselsystem för högpresterande gradientlösning Binär gradient kapacitet; högtryck eller lågtryck Flödeshastighetskontroll, minsta område: 0,7 1,6 ml/min Flödeshastighetsprecision: ± 2% (H 2 O vid 20 ºC) Lösningsavgasare Autoprovtagare Temperaturkontroll för kylning av plattor, inställningsbar: 4 till 14 ºC Injektionsvolym: 5-50 µl Separationskassett Utformad för separation av dsdna-fragmentstorlek, fragmentstorlekar 50 till 250 bp Ugn med temperaturkontroll med hög precision Temperaturområde: 40 till 70 ºC Temperaturprecision: ± 0,2 ºC Temperatur-reproducerbarhet: ± 0,2 ºC Linjäritet över hela temperaturområdet: ± 2,0 ºC Detektionsalternativ 1 UV-/VIS-detektor Område för våglängd: 190-700 nm UV-källa: Deuteriumlampa Detektionsalternativ 2 Fluorescensdetektor Område för våglängd: excitation: 200-85 nm; emission: 250-900 nm Fluorescenskälla: 150 W xenonlampa Pump för fluorescerande färg Fast flödeshastighet vid 0,1 ml/min 20%/+50% Lågt pulsationsflöde A.3.2 Systemdrift För inställning och drift av DHPLC-systemet, läs och följ tillverkarens rekommendationer för analys av dsdna-fragment i storleksområdet 50 bp till 250 bp, med inriktning på storleksurskiljning om 10 bp eller bättre. Detta är storleksområdet för fragment efter SURVEYOR Nuclease-nedbrytning med användning av detta kit. För föreslagna gradientinställningar för DHPLC-system för analys av SURVEYOR Nucleasenedbrytningar, besök http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crcrascan-kits-eu/dhplcsystemsettings. A.3.3 Underhåll av DHPLC-kassetter Följ tillverkarens anvisningar beträffande underhåll av DHPLC-kassetter. OBS! Analys av SURVEYOR Nuclease-reaktioner kräver mer frekventa och striktare rengöringsprotokoll än de som används för vanlig PCR-analys. Konsultera riktlinjerna för ditt DHPLC-system för mer information. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 26
Bilaga A A.4 Laboratorieinstallation för PCR-analyser För tillförlitliga och kontaminationsfria PCR-resultat ska god laboratoriesed iakttas när PCRlaboratoriet utformas. När laboratoriet planeras ska behovet av avstånd mellan förberedelse för PCR-amplifiering och aktiviteter efter amplifiering beaktas. De är viktigt att separera (i) DNA-isolering; (ii) PCRamplifiering; och (iii) aktiviteter efter PCR, t.ex. att öppna amplifierade prover vid förberedelse för att köra geler och förbereda andra analyser, t.ex. SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar och DNAsekvensering. Det är också viktigt att laboratorieutrustning och material tilldelas varje område och att de endast används i det specifika området. Genom att torka av ytorna med 10% (v/v) blekmedel, som blandas varje vecka, kommer underlättas eliminering av DNA-fragment 500 bp som templat för PCR. Det kan vidare vara gynnsamt att behandla plastmaterial och lösningar med UV-ljus med kort våglängd i 7-10 minuter med användning av en UV-korslänkare. Obs! Enzymer och DNA som ska amplifieras får inte UV-behandlas. Genom att använda lämplig skyddsutrustning, byta handskar ofta samt torka av handskbeklädda händer med 10% (v/v) blekmedel före inträde i en arbetsstation kommer att var till stor hjälp för att reducera risken för kontamination. Det bör minst finnas ett arrangemang som liknar det tvårumsarrangemang som visas i nedanstående diagram som är specifikt utformat för PCR och analys med SURVEYOR Nuclease. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 27
Bilaga A A.5 Litteraturlista 1. Amgen News Release (2013) New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix (panitumumab) in patients with metastatic colorectal cancer. http://wwwext.amgen.com/media/media_pr_detail.jsp?-year=2013&releaseid=1820728 2. Peeters M et al (2013) Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 1902-12. 3. De Roock W et al (2010) Association of KRAS p.g13d mutation with outcome in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. JAMA 304 1812-20. 4. Peeters M et al (2013) Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab. J Clin Oncol. 31 759-65. 5. Andre T et al (2013) Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS Wild- Type metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy: a GERCOR efficacy, tolerance, and translational molecular study. Ann Oncol. 24 412-9. 6. Loupakis F et al (2009) KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 Wild-Type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 101 715-21. 7. De Roock W et al (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol. 11 753-62. 8. Qiu P et al (2004) Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques 36 702-707 9. Kuang Y et al (2009) Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15 2630-6 10. Mitani N et al (2007) Surveyor nuclease-based detection of p53 gene mutations in haematological malignancy. Ann. Clin. Biochem. 44 557-9 11. Engelman JA et al (2006) Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J. Clin. Invest. 116 2695-2706 Se även http://world.transgenomic.com/files/literature/482146.pdf för referenser om SURVEYOR Nuclease och dess tillämpningar. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 28
Bilaga B Bilaga B Felsökningsguide Effektiv användning av SURVEYOR Scan kit för DHPLC är beroende av att ett antal olika steg genomförs framgångsrikt. Ett av de mest avgörande stegen är PCR-amplifiering som måste resultera i produktion av specifika, jämnstora DNA i tillräcklig kvantitet för att kunna detekteras efter hybridisering och klyvning. Detta beror i sin tur på kvaliteten på det ursprungliga provet. Att utföra analysen med DNA som inte motsvarar kvalitetsvillkoren avseende kvalitet och kvantitet rekommenderas inte. OBS! Om det är första gången du använder SURVEYOR Nuclease ska du utföra experimenten i avsnittet Använda kontrollplasmid-dna efter det att du har läst och förstått avsnittet Stegvisa anvisningar. Se till att du har resultaten från kontrollplasmid-dna innan du kontaktar Transgenomics tekniska support. Denna felsökningsguide omfattar en rad problem som du kan komma att stöta på medan du använder SURVEYOR Scan-kitter för DHPLC samt förslag på hur du kan lösa dem. Läs i instrumenthandboken för DHPLC-systemet för detaljerad information om användning och underhåll av instrumentet. Handboken innehåller specifika processer för att kontrollera och underhålla kolumnprestation och inkluderar felsökningsinformation. Problem 1 Låg PCR-avkastning eller avsaknad av PCR-produkt vid analys på agarosgel LÅG PCR- AVKASTNING God PCR- Avkast -ning Dålig PCRavkast -ning RNAband MÖJLIG ORSAK Dålig kvalitet på DNAtemplat För mycket RNA i provet som orsakar att DNA-koncentrationen beräknas för högt Termocyklern är inte kalibrerad Otillräckligt med templat LÖSNING Gör om reningen av DNA; gå igenom den använda reningsmetoden Om FFPE-extraherat material är alltför fragmenterat kan alternativa FFPE-block behövas. Upprepa RNase-behandlingen av DNA-provet och upprepa DNA-reningen. Kalibrera termocyklern. Öka mängden templat. OBS! Högkvalitativ DNA från FFPE ska användas. DNA bör ha en koncentration på25 ng/µl enligt bestämning genom absorption av 260 nm, ha en absorptionsgrad vid 260/280 nm som överstiger 1,8 samt vara högre än 90% DNA (d.v.s. fritt från den mesta trna- och rrnakontaminationen enligt visuell bedömning på agarosgel). Förvara DNA-prover vid en temperatur mellan -20 C och -80 C. Analys av DNA-templat som extraherats från paraffininbäddad vävnad kräver iakttagande av ett flertal försiktighetsåtgärder. Extraherat DNA kan behandlas med uracil DNA-glykosylas för att förebygga amplifiering av DNA-fragment som innehåller deaminerade C-rester. En hög procentandel av det A 260 -absorberande material som extraheras från paraffininbäddad vävnad kommer ofta inte att amplifieras väl under PCR. Genom att använda en större mängd DNA till starten kan man ofta producera en tillräcklig mängd med amplifieringsprodukt. En annan sak att tänka på är att välja FFPE-tumörsektioner med en hög andel tumörceller. Mikrodissektion kan också användas, men detta är tidskrävande och torde inte rekommenderas vid generell laboratorietestning. Bruksanvisning för SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD för DHPLC Sid. 29