r svensk patentansökan

SVERIGE (12) PATENTSKRIFT (13) C2 (11) 515 216 (19) SE (51) Internationell klass 7 CO7K 14/29, A61K 39/02, GO1N 33/569 PATENT- OCH gäl (45) Patent meddelat 2001-07-02 (41) Ansökan allmänt tillgänglig 1999-08-21 (21) Patentansöknings- nummer 9800504-4 (22) Patentansökan inkom 1998-02-20 Ansökan inkommen som: (24) Löpdag (62) Stamansökans nummer 1998-02-20 r svensk patentansökan ( 86) Internationell vningsdag fullföljd internationell patentansökan REGISTRERINGSVERKET med nummer (86) Ingivningsdag för ansökan om europeisk patent omvandlad europeisk patentansökan (83) Deposition av mikroorganism med nummer (30) Prioritetsuppgifter (57) SAMMANDRAG: Den aktuella uppfinningen avser en ny peptid, diagnostiskt reagens och kit för detektion av rickettsioser, närmast för detektion av fästingburna bakterier nära besläktade med Rickettsia helvetica. Dessutom avser uppfinningen ett vaccin mot rickettsioser innehållande nämnda peptid. Siffrorna ifon inom nmprne parentes anger ne internationell nentoelietfeigkd identifieringskod, INID-kod. NDkd Bokstav osa inom nmkamragritrainl klammer anger internationell dokumentkod. oueto.

1 Bakgrund till uppfinningen Den aktuella uppfinningen avser en ny peptid, diagnostiskt reagens för detektion av rickettsioser, närmare bestämt för detektion av fästingburna bakterier nära besläktade med Rickettsia helvetica. Vidare avser uppfinningen ett vaccin mot rickettsioser och en metod för detektion respektive behandling av rickettsioser. Fylogenetiskt kan livet på jorden indelas i tre huvudgrupper; eukaryoter, eubakterier och archeabakterier. Eukaryoterna utgörs av cellkärneförsedda högre organismer medan archeabakterier består av bakterier som anpassats till extrema förhållanden i miljön som heta källor, extrema salthalter eller förmågan att använda metan som kolkälla i sina katabola processer. Det stora flertalet bakterier och även den så kallade blågröna algen är eubakterier. Av dessa är ett fåtal (dvs. Rickettsiae och Chlamydiae ) så specialiserade att de är obligat intracellulära parasiter. Eukaryota organeller, som tex mitokondrier har i genetiska evolutionsstudier visats vara parasiter eller symbionter som lever inne i andra celler. Dessa har ett nära släktskap med Rickettsiae. Släktet Rickettsiae har till nyligen ansetts bestå av tre grupper strikt intracellulära bakterier, nämligen tyfus (TG), fläckfeber (SFG) och skrubbtypfus (STG) grupperna. Klassifikation i species är baserad på geografisk spridning, artropod värd, intracellulär lokalisation, membranstruktur, odlingsegenskaper och serologiska mönster. Tyfusgruppen (TG) inkluderar species R. prowazekii och R. typhi. Medlemmarna i TG återfinns huvudsakligen belägna i cytoplasman. Ett annat vanligt karakteristika är serologisk korsreaktivitet i Weil-Felix agglutination med Proteus OX19. TG Rickettsiae uppträder på spridda håll i världen och överförs till människa med löss eller loppor. SFG Rickettiae överförs huvudsakligen med fästingar och omkring 20 skilda species av SFG har hittills beskrivits. Species-definitionen av SFG har baserats på serotyp bestämning med komplement-fixeringstest, toxin-neutralisationstest hos möss, kors-immunitetstest hos

2 marsvin, eller mikroimmunofluorescenstest (MIF). Dock är den serologiska uppdelningen av nyligen isolerade stammar svår beroende på en korsreaktivitet mellan kända Rickettsiae.. Den tredje gruppen Rickettsiae, skrubbtyfus gruppen, består av enbart ett beskrivet species, Orientia tsutsugamushi. Detta species uppträder naturligt i södra och sydöstra Asien och överförs av larven till ett kvalster (Leptotrombidium spp.). Vidare har skillnader i cellväggsstrukturen och ribosomsekvenserna hos dessa visats i förhållande till de andra grupperna. Europeiska fästingar har visats bära SFG Rickettsiae som R. helvetica i Schweiz, R. slovaca i Ryssland och R. conorii i Frankrike. Dock har ingen Rickettsiae rapporterats från fästingar i Skandinavien (Sverige, Danmark, Norge, Finland och Island). Den kliniska betydelsen av rickettsiainfektioner kan lätt undervärderas. Flera studier har visat att tecken på och symptom av rickettsia-sjukdom kan variera avsevärt. Detta gäller tex för Rocky Mountain "spotless" feber, där den kliniska bilden är snarlik den klinik man ser vid Lyme's sjukdom, men där de serologiska fynden talar för en infektion med R. rickettsii. Ett liknande exempel, är studien av ett nytt rickettsia-agens, "ELB", där den definitiva kliniska diagnosen var murin tyfus. Utvidgade undersökningar visade att "ELB-ämnet" är ett distinkt rickettsia species med det föreslagna namnet R.felis. Behandling av dessa infektioner är idag nästan exklusivt beroende av antibiotika eller kemoterapeutika. Det vanligaste problemet vid antibiotikabehandling är ekologiska rubbningar av normalfloran. Ett annat, ofta svårare, problem vid behandling av bakteriella infektioner orsakade av intracellulärt växande bakterier är svårigheten att uppnå tillräckligt höga koncentrationer av preparatet under tillräckligt lång tid för att avdöda bakterier i stationär tillväxtfas. Aktuella terapier för rickettsia-infektioner är antibakteriell behandling med kloramfenikol, tetracykliner och ibland rifampicillin. Diagnos av rickettsiainfektionen kan fås antingen genom odling av organismen eller genom analys av

3 kroppsvätskor från infekterade individer, det senare alternativet föredras eftersom odling av Rickettsiae ofta är svårt och osäkert. För de i Europa icke förekommande, extremt patogena Rickettsiae, som R. prowazekii (lusburen fläckfeber), R. rickettsii (Rocky Mountain spotted fever) och Orientia tsutsugamushi (Skrubb tyfus) har diagnostiska kit beskrivits. Se som exempel, US 7429936 som beskriver ett rekombinant protein för diagnos av R rickettsii. Detta protein kan även användas för att vaccinera människor mot Rocky Mountain spotted fever. I Journal of Clinical Microbiology, Jan 1997, p 243-247, har föreliggande uppfinnare visat att 1,7% av Skandinaviska Ixodes ricinus fästingar är positiva för rickettsia DNA. Fästingar är kända för att vara den vanligaste artropodreservoaren och vektorn för SFG Rickettsiae. Ännu är det inte visat att Rickettsiae förekommer endemiskt eller epidemiskt bland människor eller djur i Skandinavien. 16S rrna genen från den isolerade stammen amplifierades och sekvenserades och en 1380 bp lång sekvens från denna gen jämfördes med motsvarande sekvens hos tidigare beskrivna rickettsia species. Jämförelsen visade en 100%- ig homologi med R. helvetica. Species av släktet Rickettsiae är nära besläktade och de genetiska skillnaderna mellan 16S rrna genen är enbart 2 %. Till exempel skiljer 11 nukleotider detta isolat från R. conorii, ett species endemiskt i södra Europa och fylogenetiskt, den mest besläktade karakteriserade SFG Rickettsia och vidare den enda Rickettsia som har påvisats i I. ricinus än så länge. I jämförelse med R. prowazekii, som är mindre besläktad och tillhör tyfus-gruppen, så skiljer sig denna stam i 25 nukleotid-positioner. RFLP-mönstret hos citratsyntetas-genen förbättrar diskrimineringen mellan Rickettsiales. RFLP mönstret för denna stam, i jämförelse med kända typstammar, är mest lik mönstret för SFG men distinkt skilt från det publicerade mönstret för R. helvetica. Baserat på nukleotidsekvens resultatet, borde den detekterade Rickettsia sp. klassificeras som en fläck feber (SFG) Rickettsia. Vidare talar RFLP-mönstret för att denna stam kan vara en subtyp till R. helvetica.

4 Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfmnare har indikationer på att den Rickettsia som hittats i 1. ricinus fästingar är patogen för människor. Av denna anledning föreligger det ett behov av diagnostik och behandling av rickettsioser i Skandinavien. En avsikt med uppfinningen var att möjliggöra riktig diagnostik av rickettsia infektioner i Skandinavien. En annan avsikt var att tillhandahålla effektiv behandling av infekterade individer. Dessa och andra avsikter uppnås som en följd av uppfinningen. Sålunda avser uppfinningen, i en första aspekt, en peptid/protein innehållande den aminosyresekvens som visas i Sekvenslista nr 1. Peptiden/proteinet erhålles från naturliga källor eller produceras på syntetisk eller rekombinant väg. I en andra aspekt avser uppfinningen ett diagnostiskt reagens innehållande ovan nämnda peptid/protein eller immunrespons genererande delar eller varianter därav för detektion av rickettsioser, i synnerhet för detektion av infektioner med bakterier nära besläktade med Rickettsia helvetica. Det diagnostiska reagenset kan vara fritt eller bundet till lipider eller kolhydrater. I en tredje aspekt avser uppfinningen ett diagnostiskt kit innehållande det ovan nämnda diagnostiska reagenset som är i form av en lösning eller bundet till solid fas. I en konkretiserad form av denna aspekt, innehåller det diagnostiska kittet en märkt anti-ig antikropp för detektion av däggdjurs IgA, IgG eller IgM antikroppar mot ett antigen (det vill säga det ovan nämnda diagnostiska reagenset) från bakterier nära besläktade med R. helvetica. Kitet är lämpligen utformat för konventionella assays som ELISA, EIA, RIA, IRMA etc. Däggdjurs antikroppar använda som prov insamlas från kroppsvätskor som serum, blod, cerebrospinalvätska, tårvätska, semen eller svett. I en ytterligare utföringsform av denna aspekt innehåller kitet ett märkt T-cells igenkännande agens för detektion av rickettsioser, i synnerhet för detektion av det cellulära immunsvaret mot ett antigen (det vill säga det ovan nämnda diagnostiska reagenset) från R. helvetica eller bakterier nära besläktade med

5 densamma. I detta fall är kitet utformat som till exempel en konventionell Immuno Spot Assay. I en fjärde aspekt avser uppfinningen ett vaccin innehållande den ovan nämnda peptiden eller immunresponsgenererande delar eller varianter därav för behandling av rickettsioser. Behandlingen omfattar administrering, till en individ i behov därav, av vaccin i ett passande adjuvans i en farmakologiskt effektiv mängd för att framkalla immunrespons hos individen, vilket skyddar individen mot rickettsios. Detaljerad beskrivning av uppfinningen Den typiska kliniska bilden vid rickettsios är hög feber, huvudvärk och utslag. Beroende på vilket rickettsia-species som orsakar sjukdomen kan den kliniska bilden även inkludera lymfadenopati, myalgi, artralgi och vissa former presenterar sig med neurologiska, renala och kardiella problem. Symptomen av sjukdomen kan variera från milda till svåra och durationen är vanligen mellan 2-3 veckor. De få beskrivna sjukdomsfallen och mångfalden av symptom komplicerar diagnosen. Liknande kliniska bilder kan uppträda vid vissa icke rickettsiaorsakade bakteriella och virala infektioner som meningococcemi, mässling, tyfoid feber, bakteriell meningit, sekundär syfilis, leptospiros, återfallsfeber, infektiös mononukleos och röda hund. Ifall utslag inte uppträder behöver alla febrila tillstånd tas i beaktande. Rickettsioser har också en benägenhet att bli latenta infektioner, en hypotes bevisad för R. prowazekii, en upptäckt för vilken Henri Nicolle erhöll 1928 års Nobelpris i Fysiologi och Medicin. Även för andra rickettsia species har en liknande latent infektion föreslagits (Woddword, 1953, 1997). En sådan pyrande infektion kan efter några år leda till svåra sekvele. Isolat av Rickettsiae av okänd patogenicitet för människa har en tendens att betraktas som "icke-patogen" för människa. Under de sista åren har ett antal "icke-patogena" Rickettsiae visats orsaka skilda sjukdomar och har därför omvärderats som patogena. Vår hypotes är att ifall den primära infektionen är mild, och därför sällan eller inte alls blir diagnostiserad, men fortfarande utvecklas vidare till en latent infektion orsakande allvarliga sekvele, så kommer dessa infektioner och organismer att bli några av de mest angelägna att studera.

6 Serologiska assays är de enklaste diagnostiska testen att utföra, eftersom serum enkelt kan sändas till ett referenslaboratorium. Ju mer specifika immunogena reaktioner man kan utföra desto mer specifikt blir testet och färre korsreaktioner uppträder. De immunogena egenskaperna hos bakterien är huvudsakligen associerade med de strukturer som exponeras på organismens yta. Av sådana strukturer finns två grupper.1: En är yttermembranproteinerna, OMPs och 2: Den andra är LPS (lipo-poly-sackariderna) eftersom Rickettsiae är Gram-negativa bakterier. LPS som metod har använts under närmast ett århundrade i Weil-Felix reaktion men är väldigt ospecifik. I enlighet med uppfinningen användes 17 kda OMP proteinet. Genen som kodar för detta protein amplifierades med hjälp av två specifika primers i en standardiserad PCR assay. Den amplifierade produkten sekvenserades med hjälp av Sanger dideoxy-kedje-terminationsmetoden och resultatet ges i Sekvenslista nr. 2. Denna sekvens översattes till aminosyror och en specifik peptid valdes motsvarande 28 aminosyror från baspar 276-360. Denna 28 aminosyrors antigena peptid kan produceras antingen genom rening från odlade species besläktade med Rickettsia helvetica uttryckande denna peptid i 17 kda OMP, från rekombinanta organismer med en vektor med en infogad sekvens innehållande bp 277-360 i enlighet med Sekvenslista nr. 2 eller varianter därav, eller genom ren kemisk syntes. Uppfinningen kommer nu att beskrivas närmare nedan tillsammans med några icke-begränsande exempel tillsammans med bifogade Sekvenslistor och Figurer. Exempel 1: Amplifiering och sekvensering av rickettsiagen Följande specifika primerpar konstruerades 17up 17LOW 5 -AAAATTCTAAAAACCAT 5 -TCAATTCACAACTTGCC Från en samling av frilevande I. ricinus fästingar, isolerades total DNA efter sönderdelning och tillsättande av 300 bil lätt salthaltig TE buffert (10mM Tris ph 7.4, 1 mm EDTA, 10 mm NaC1), 20 pil, 20% natrium dodecyl sulfat (SDS och 5 ;IL 10 mg/ml Proteinas K (Boehringer, Mannheim). Blandningen inkuberades vid 55 C under 1 h och upphettades under 10 minuter vid 95 C. Extraktion

7 utfördes två ggr med mättad fenol, en gång med en blandning av fenol/kloroform och slutligen en gång med kloroform. DNA:t fälldes övernatt med tillsats av 1/10 vol. 4 M natrium acetat och 3 vol. 99% etanol och samlades ihop med centrifugering vid 20.000 rpm i en mikrocentrifug. Den pellet som bildades tvättades med 70% alkohol och torkades under vacuum och löstes i 50 jil destillerat vatten och användes som templat för PCR. PCR-amplifiering. De primers som ovan beskrivits användes under förhållanden med värmecykler 93 C 5 min. (93 C 30 sek.-52 C 60 sek.-72 C 30 sek.) upprepat 35 ggr, vilket gav ett ungefärligt 600 baspar (bp) långt fragment täckande hela genen och angränsande regioner samt kodande för 17 kda yttermembranproteinet. De generella kemiska förhållanden under vilka PCR amplifieringen utfördes bestod av en blandning av 1 U Taq DNA polymeras (Boehringer, Mannheim) 2,5 jil 10 ggr buffert innehållande enzym, 1 pli 25 mm MgC12, 2,5 ial 2 mm dntp:s, 5 pmol av varje primer, 1 ;IL DNA templat och dubbelt destillerat vatten till 25 pl. Reaktionen utfördes i en Perkin Elmer 9600 thermocycler, och de amplifierade produkterna analyserades på en 1,5% agaros (Kodak) gel i 0,5 Tris borat EDTA (TBE) buffert. Renat DNA från Rickettsia prowazekii valdes som positiv kontroll. PCR buffert hanterad på samma sätt som fästingproverna utgjorde negativ kontroll. Huvuddelen av den kodande sekvensen av denna gen visas i Sekvenslista nr. 2 och utfördes med hjälp av direkt fast fas DNA-sekvensering. Immobilisering av de biotinylerade PCR-produkterna följdes av sträng separation och templatpreparation utfördes med hjälp av super paramagnetiska pärlor, Dynabeads M- 280 Streptavidin (Dynal, Oslo, Norge). Nukleotidsekvensen av 17 kda OMP genen bestämdes i båda riktningarna genom automatiserad fast fas DNA sekvensering med ALF ( Automatiserad Laser Fluorescence) system (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige).Sekvensering utfördes även manuellt med 35 S datp (Amersham) och Sequenase II (USAB, Ohio) i enlighet med leverantörens instruktioner.

8 Exempel 2: Konstruktion av antigen rickettsia-peptid En teoretisk beräkning av de antigena domänerna utfördes användande Jameson-Wolf algorithm i programmet DNA StarData. Jameson-Wolf skapar ett antigenicitetsindex genom att kombinera värden för hydrofilicitet (Hoop-Wood H (<2> 0,5 <1> 0 <-1>-0,5 <-2>)), ytfasthet (Emini S ( <1> 1.0 <0>)), flexibilitet (Karplans-Shultz F ( <1> 1.0 <0>)) och de sekundära struktur egenskaperna av Chou-Fasman (CF (T=2, t=1, 0) samt Garnier-Robson (GR(T=2, t=1, 0,3) genom följande formel A = 0,3H + 0,15S + 0,15F + 0,2CF + 0,2GR Metoden resulterar i en graf, se Fig. 1, som indikerar antigena lägen på platsen för toppvärdena. Den topp breddande funktionen ger en spridning av toppar inom områdena 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 80%, 60%, 40%, 20% från maximum, där toppvärdet för de nio restvärdena omger varje lokalt maximum. I grafen för antigenpåvisning, där peptidsekvensen i enlighet med uppfinningen motsvarar regionen av aminosyror mellan 93-120, visas tre höga toppvärden uttryckande hög antigenicitet. Denna 28 aminosyrors peptid är visad i Sekvenslista nr. 1. En konfirmerande metod för att visualisera antigeniciteten är Western blot assay. 5 pl av renad organism löses i Laemmli lösning (4%SDS, 10% 2- merkaptoetanol, 0,5% bromfenol blått, 0,125 M Trishydroklorid (ph 6,8), 25% glycerol) vid rumstemperatur och SDS-PAGE utföres med en 7,5% separationsgel och 3,9% stacking gel. Gelen körs i en Mini-Protein II cell (Bio-Rad) vid 10mA i isbad), och proteinband visualiserades med färgning med Coomassie blå. En molekyl viktstandard för vida områden (Bio-Rad) användes för att uppskatta molekylvikten hos de elektroforetiskt separerade banden. En identisk gel överfördes till nitrocellulosa papper i en Trans-blot apparat (Bio-Rad) vid 50 V under 1 h i isbad. Ospecifika bindningsställen blockerades övernatt med 5% fettfri torrmjölk (TBS (1mM Tris hydroklorid (ph 7,5), 250 mm NaC1, 0,01% Merthiolat). Efter tvätt 10 minuter tre ggr i TBS, tillsattes antisera från index patienten, spätt 1/100 i 3% fettfri torr mjölk-tbs. Nitrocellulosa papperet inkuberades på skak i 2 h. Reaktiva antikroppar detekterades med peroxidaskonjugerade anti-human Ig (Bio Meriux, Marcy l'etoile, France) spädda 1/200 i

9 3% fettfri torr mjölk-tbs. Efter tre ytterligare tvättar i TBS, detekterades det bundna peroxidaset med en lösning innehållande 0,015% 4-kloro- l -naftolol, 0,015% väteperoxid, och 16% metanol i TBS. Så fort som banden blev synliga, stoppades reaktionen med upprepade tvättar i destillerat vatten och ett distinkt band uppträdde vid 17 kd. Exempel 3: Diagnostisk användning av den uppfunna peptiden Ett diagnostiskt reagens innehållande den antigena delen av nämnda OMP kan användas för detektion/ diagnostik/ kvantifiering av antigena responset hos människa och andra däggdjur efter kontakt med bakterier nära besläktade med R. helvetica som uttrycker ett protein innehållande peptiden i uppfinningen. Diagnostiken kan utföras genom en rad olika metoder till exempel; Indirekt immunofluorescens; Western blot assays (se exempel 2). Alternativt testas det cellulära svaret med, till exempel, användning av en Immuno spot assay. Exempel 4: Terapeutisk användning av den uppfunna peptiden Den antigena delen av nämnda OMP kan också blandas eller kopplas till ett adjuvans (till exempel Freunds eller Iscomes) för att användas som vaccin. Vaccinet kan antingen användas terapeutisk eller profylaktiskt.

10 SEKVENSLISTOR Information för Sekvenslista nr. 1: Längd: 28 as Typ: aminosyra Ala Ala Pro Ser Gly Ser Asn Val Glu Trp Arg Asn Pro Asp Asn 5 10 15 Gly Asn Tyr Gly Tyr Val Thr Pro Asn Lys Thr Tyr Arg 20 25 Information för Sekvenslista nr.2: Längd: 454 bp Typ: DNA ATG ATA CTA TTA TCT AAA ATT ATG ATT ATA GCT CTT GCA GCT TCT 30 ATG TTA CAA GCC TGT AAC GGT CCG GGT GGT ATG AAT AAA CAA GGT 60 90 ACA GGA ACA CTT CTT GGC GGT GCC GGC GGT GCA TTA CTT GGT TCT 120 CAA TTT GGT AAA GGT AAA GGG CAA CTT GTC GGA GTA GGT GTA GGT 150 180 GCA TTA CTT GGA GCA GTT CTT GGC GGG CAA ATC GTT GCA GGT ATG 210 GAT GAG CAG GAT AGA AGA CTT GCA GAG CTT ACC TCA CAG AGA GCT 240 270 TTA GAA GCA GCT CCT AGC GGT AGT AAC GTA GAG TGG CGT AAT CCG 300 GAT AAC GGC AAT TAC GGT TAC GTA ACA CCT AAT AAA ACT TAT AGA 330 360 AAT AGC ACT GGT CAA TAT TGC CGT GAG TAC ACT CAA ACA GTT GTA 390 ATA GGC GGA AAA CAA CAA AAA GCA TAC GGT AAT GCA TGC CGC CAA 420 450 CCT G

11 Svenska patentansökan nr. 9800504-4 PATENTKRAV 1. Peptid innefattande aminosyrasekvensen som visas i Sekvens-lista nr. 1. 2. Peptid i enlighet med krav 1, vilken erhålles från naturliga källor, eller produceras på syntetisk eller på rekombinant väg. 3. Gen kodande för peptiden i enlighet med krav 1 eller 2 innehållande alla varianter beroende på den degenererade genetiska koden. 4. Diagnostiskt reagens innehållande peptiden i enlighet med krav 1 eller 2 eller immunresponsgenererande delar eller varianter av sekvensen enligt Sekvens-lista nr. 1 för detektion av rickettsioser. 5. Diagnostiskt reagens i enlighet med krav 4, för detektion av infektioner med bakterier nära besläktade med R. helvetica uttryckande peptid i enlighet med krav 1. 6. Diagnostiskt reagens i enlighet med krav 4 och 5, som är fritt eller bundet till lipider eller kolhydrater. 7. Diagnostiskt kit innefattande ett diagnostiskt reagens i enlighet med krav 4-6. 8. Diagnostiskt kit i enlighet med krav 7, i vilket reagenset är i form av en lösning eller bundet i fast fas. 9. Diagnostiskt kit i enlighet med krav 6-8, innefattamde en märkt anti-ig antikropp för detektion av däggdjurs IgA, IgG eller IgM antikroppar mot ett antigen från bakterier nära besläktade med R. helvetica. 10. Diagnostiskt kit i enlighet med krav 6-9, i vilket däggdjurs antikropparna innehålls i kroppsvätskor såsom serum, blod, cerebrospinalvätska, tårvätska, semen eller svett.

12 11. Diagnostiskt kit i enlighet med krav 6-8, innehållande ett märkt T-cellsigenkännande agens för detektion av rickettsioser. 12. Diagnostiskt kit i enlighet med krav 11, för detektion av cellulära immunsvaret mot ett antigen från bakterier nära besläktade med R. helvetica. 13. Vaccin innefattande peptider i enlighet med krav 1 eller 2 eller immunresponsgenererande delar eller varianter av sekvensen enligt Sekvens-lista 1 för behandling av rickettsioser.

A A B B T T C 2.77 1111e1i el; 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150,59 Pä K:: M M Alfaregioner - Garnier-Robson Alfaregioner - Chou-Fasman Betaregioner - Garnier-Robson Eg Betaregioner - Chou-Fasman Vändningsregioner- Garnier-Robson Vändningsregioner - Chou-Fasman o Spiralregioner - Garnier-Robson 0 Hydrofilicitetsplot - Kyte-Doolittle CN 3.4 Alfa, amfipatiska regioner - Eise Beta, amfipatiska regioner - Eisenb Flexibla regioner - Karplus-Schulz 0 Antigent index - Jameson-Wolf u Yt-sannolikhetsplot - Emini