Anna Engberg Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling C HT 2004
Innehåll Historisk bakgrund...3 Hyaluronans kemiska struktur...4 Syntes av hyaluronan...4 Hyaluronans egenskaper och biologiska aktivitet...5 Extraktion och isolering av hyaluronan...7 Klinisk effekt och användning...8 Läkemedelsutveckling...9 Referenser...11 2
Hyaluronan Utan hyaluronan skulle människan inte existera. Hyaluronan är naturligt en av kroppens viktiga byggstenar och fyller många funktioner, allt från att skydda kvinnans ägg till att fungera som smörjmedel i leder och muskler. En viktig egenskap hos hyaluronan är dess förmåga att binda vatten vilket ger struktur åt vävnader. Utvecklingen runt hyaluronan har gått fort framåt och idag används hyaluronan inom många områden i sjukvården. Historisk bakgrund Hyaluronan, som tidigare kallades hyaluronsyra (eng. hyaluronic acid) upptäcktes 1934 av Karl Meyer som också renade och strukturbestämde föreningen. Han isolerade den tidigare okända kemiska substansen från corpus vitreum (glaskroppen, vitreous body) på ett koöga och upptäckte att substansen innehöll två sockermolekyler, en uronsyra och ett aminosocker. Namnet hyaluronsyra kommer från hyaloid, som betyder glasaktig eller vitrös (vitreous) och uronsyra. Idag kallas makromolekylen hyaluronan istället för hyaluronsyra eftersom den uppträder som en polyanjon in vivo och inte som den protolyserade syraformen. Hyaluronan användes första gången kommersiellt 1942, då Endre Balazs ansökte om ett patent för att använda den som ett substitut för äggvita i bageriprodukter. Han blev den ledande experten på hyaluronan och gjorde de flesta upptäckterna kring hyaluronan de nästföljande 50 åren. En viktig del av forskningen kring hyalyronan har, under ledning av Endre Balazs och Torvald Laurent, handlat om dess fysikaliska kemi. Den kunskap som vunnits genom denna grundforskning har sedan kunnat utnyttjas vid utvecklingen av flera olika produkter. 3
Hyaluronans kemiska struktur Hyaluronan är en polysackarid som tillhör klassen glykosaminoglykaner. Hyaluronans struktur är den enklaste av glykosaminoglykanerna men skiljer sig från dem genom att den inte innehåller sulfat. Molekylvikten varierar stort mellan 300 kda till 4000 kda beroende på i vilken vävnadstyp den finns. Molekylen ser likadan ut i alla organismer. Den repeterande disackariden i hyaluronan består av glukuronsyra och N-acetyl-glukosamin som binds till varandra med en glykosidisk β(1,3)-bindning. Disackariderna hålls i sin tur samman med β(1,4)-bindningar. Hyaluronans kemiska struktur. Syntes av hyaluronan Syntesen av hyaluronan skiljer sig kraftigt från syntesen av andra glykosaminoglykaner. De flesta glykosaminoglykaner syntetiseras i golgiapparaten inne i cellen och fästs på proteiner. Hyaluronan syntetiseras istället vid plasmamembranet och kräver inte ett kärnprotein som primer. Hyaluronan syntetiseras av UDP-N-acetylglukosamin och UDP-glukoronsyra. Enzymet som syntetiserar hyaluronan finns i membranet och en kedja av hyaluronan växer ut från cellmembranet in i det extracellulära utrymmet. Hyaluronan syntetiseras 4
genom att UDP-N-acetylglukosamin och UDP-glukoronsyra omväxlande läggs till den växande kedjan. 5
Polymeren växer från den reducerade änden hos kedjan vilket också skiljer sig från syntesen av andra glykosaminoglykaner. Hyaluronans syntes hämmas inte av samma ämnen som hämmar andra glykosaminoglykaners syntes, vilket återigen bekräftar hypotesen att syntesen av hyaluronan skiljer sig helt från andra glykosaminglykaners syntes. Flera tillväxtfaktorer och cytokiner aktiverar syntesen av hyaluronan. De repeterande disackariderna bildar stora, linjära polymerer av hyaluronan. Antalet repeterande disackarider i en färdigsyntetiserad hyaluronan kan uppnå 10 000. Längden hos en disackarid är ungefär 1 nm, men en molekyl av hyaluronan med 10 000 repeterande enheter kan bli längre än 10 µm om molekylen sträcks. Hyaluronan stabiliseras med vätebindningar. Hyaluronans egenskaper och biologiska aktivitet Hyaluronan är ett hydrofilt och viskoelastiskt ämne som har smörjande egenskaper. Detta naturliga socker finns i alla vävnader och kroppsvätskor i alla däggdjur och även i mikroorganismer. Hyaluronan finns hos vissa typer av streptokocker och syntesen av hyaluronan hos streptokockerna påminner om syntesen av hyaluronan hos däggdjuren. Hos däggdjuren finns hyaluronan i huden, ögat, brosket och i kroppsvätskor (t.ex. i ledvätska). Störst mängd hyaluronan finns i dermis och epidermis i huden. Där finns ungefär 7-8 g hos en vuxen människa och det motsvarar ungefär 50 % av den totala mängden i kroppen. Hyaluronan finns också i blodet där det kommer från lymfkretsloppet i perifer vävnad. Det är dock bara en liten del av den totala mängden hyaluronan som finns i blodcirkulationen. En del av det cirkulerande hyaluronan kataboliseras troligtvis av njure och mjälte. Endotelcellerna i levern bryter också ned hyaluronan till monosackarider. Även andra typer av vävnader bryter ned hyaluronan, som har en halveringstid på mellan en halv dag och några dagar. 6
I lederna har hyaluronan en viktig uppgift som smörjmedel. Troligtvis finns det även andra proteiner som har denna funktion. Hyaluronan har både elastiska och viskösa egenskaper vilket bland annat gör att brosket i lederna skyddas mot belastning och nötning. De viskösa egenskaperna används då leden utsätts för skjuvspänning, det vill säga då en yta glider mot en annan yta. Då fungerar hyaluronans molekyler i ledvätskan som skyddande smörjmedel. De elastiska egenskaperna hos hyaluronan används vid belastning av lederna. Då tar hyaluronan i ledvätskan upp stötar och skyddar brosket mot att tryckas ihop. En viktig egenskap hos hyaluronan är att den kan binda stora mängder vatten, upp till 1000 gånger sin egen vikt. En annan viktig funktion hos hyaluronan är dess förmåga att binda vissa molekyler till önskade ställen i kroppen. Hyaluronan formar nät som gör att den kan reglera fördelningen och transporten av en stor del av plasmaproteinerna in i vävnaderna. Makromolekyler som proteiner eller andra inflammatoriska ämnen har svårt att ta sig igenom näten medan små molekyler som vatten, elektrolyter och näringsämnen fritt kan diffundera genom näten och exempelvis ge näring åt brosk. Produktionen av hyaluronan ökar under celldelningen, speciellt under mitosen. Hyaluronan hjälper troligen cellerna att skilja sig från matrisen, vilket gör det lättare för dem att dela sig. Hyaluronan binder specifika receptorer (hyaluronanspecific bindning proteins) på cellytan, vilket gör att de sitter fast vid det önskade stället. Dessa receptorer har hittats på flera olika celltyper, till exempel lymfocytreceptorn CD44 och RHAMM (Receptor for hyaluronan-mediated motility). Interaktioner mellan hyaluronanreceptorer och extracellulära polysackarider antas ha med cellmigration att göra. Hyaluronans koncentration ökar i de områden där cellmigrationen börjar, vilket kan betyda att hyaluronan öppnar vägar som cellerna kan migrera igenom. Hyaluronan är involverad vid morfogenes och celldifferentiering. Cancerceller har ofta stora mängder hyaluronan och starka intracellulära fläckar av hyaluronan kan användas som indikator för att ge prognos vid cancerbehandling. Det är dock ett ganska dåligt sätt att ställa diagnos på vid cancerbehandling. 7
Produktionen av hyaluronan ökar också vid inflammation och den viskösa lösningen verkar generellt hämma cellernas aktivitet. Hyaluronan tycks också öka fagocytos i monocyter och granylocyter men betydelsen av detta är okänd. Hyaluronan finns ofta i det pericellulära utrymmet (omgivningen runt cellen), där den antagligen skyddar cellen mot lymfocyter och virus. Embryot är täckt med ett tjockt lager hyaluronan under vissa stadier av utvecklingen. Detta lager är troligen viktigt för att cellerna ska kunna differentiera. Hur dessa lager sitter fast på cellytan och vilka molekyler de innehåller är okänt. Halten av hyaluronan varierar stort beroende på vävnadstyp. Den högsta koncentrationen av hyaluronan har upptäckts hos tuppen, i tuppkammen. Höga koncentrationer finns också i navelsträngen, ledvätska, brosk, hornhinnan och huden hos människan. Extraktion och isolering av hyaluronan Ska hyaluronan användas medicinskt måste den renas noggrant så att inga inflammatoriska fraktioner finns kvar. Icke-inflammatoriska fraktioner med natriumhyaluronat erhålls från tuppkammar genom en patenterad procedur. Då extraheras hyaluronan med blandning av vatten och kloroform (förhållandet 20:1). Den inflammatoriska fraktionen tas bort genom flera extraktioner med kloroform vid olika ph-värden och jonkoncentrationer. Den rena hyaluronan fås tillslut genom fällning med etanol. Fällningen tvättas med aceton och vakuumtorkas. Idag framställer läkemedelsföretag också icke-animaliskt hyaluronan. Fördelen med icke-animaliskt hyaluronan är att renhetsgraden är mycket hög, vilket gör att risken för allergiska reaktioner och överföring av smittoämnen är minimal. Dessa problem kan förekomma i produkter där hyaluronan är extraherad från djur eller människa. Genom att stabilisera hyaluronan så förlängs den terapeutiska effekten. Icke-stabiliserad hyaluronan har en varaktighet som är några dagar till högst en vecka. Stabiliserad hyaluronan ger en effekt som varar upp till ett år. 8
Klinisk effekt och användning Den första medicinska användningen av hyaluronan hos människor var som ersättning eller tillägg till glaskroppen vid ögonkirurgi i slutet av 1950-talet. Hyaluronan som användes isolerades till en början från människans navelsträng men snart isolerades hyaluronan från tuppkammar istället, vilket gav en mycket ren förening med hög molekylvikt. Hyaluronan används fortfarande vid ögonoperationer, som till exempel intraokulära linsimplantat och glaukom (grön starr). Användningen av hyaluonan förebygger mekaniska skador hos känsliga vävnader i ögat. Eftersom hyaluronan är en naturligt förekommande förening i ögats vävnad så bryts den naturligt ned av enzymer som finns i ögat normalt. Ett av de mest framgångsrika medicinska användningsområdena av hyaluronan är natriumhyaluronat (NaHA) för behandling av artros. Artros är en progressiv sjukdom där brosket i vävnader som skyddar lederna bryts ned. Brosket bryts gradvis ned tills benen, som hos friska människor är separerade av brosket, gnider mot varandra. Detta skadar ben och vävnader, vilket ger smärta i lederna. Hyaluronan injiceras direkt i knäleden där den stöder knäets naturliga ledvätska, vilket gör att smärtan i knäet minskar och rörligheten förbättras. Denna behandling kallas också viskosupplementation och ett sort antal patienter med artros har blivit bättre av denna behandling. NaHA började användas i Japan 1987 och sedan dess har fler länder börjat använda NaHA vid behandling av artros. Injektion av hyaluronan används också som alternativ till kirurgi vid olika typer av inkontinens. Dessutom så kan leversjukdomar och olika inflammationssjukdomar, som till exempel reumatoid artris (reumatism) diagnostiseras genom att analysera hyaluonan i serum. 9
Även till vardags används flera olika produkter som innehåller hyaluronan. Hyaluronans förmåga att binda stora mängder vatten och dess höga viskoelastisitet gör att hyaluronan används i en del kosmetiska produkter för att huden ska se ung och fräsch ut. Trots att hyaluronan finns naturligt i huden och binder vatten, så försämras de vattenbindande egenskaperna hos hyaluronan i huden med åldern. Detta beror på att hyaluronan depolymeriseras. Hyaluronan används också för att korrigera rynkor och veck, forma ansiktskonturer och skulptera läppar. Då injiceras en liten mängd hyaluronan på önskat ställe. Hyaluronan lämpar sig för tvärbindning och immobilisering på olika sätt för att ge hydrofila, smörjande och biokompatibla föreningar som kroppen uppfattar som inerta när de implanteras. Genom att derivatisera och komplexbinda hyaluronan med andra substanser erhålls bioaktiva substanser (t.ex. antitrombotiska eller antibakteriella). Läkemedelsutveckling Utvecklingen av hyaluronan och dess derivat har gått mycket fort under de senaste åren. Hyaluronan är idag ett nytt och viktigt ämne som används inom flera olika områden i sjukvården, både medicinskt och som biomaterial. Medicinskt produceras hyaluronan kommersiellt av minst ett dussin företag i Sverige, USA, Canada, Italien, Israel och Japan. De nyaste upptäckterna och användningarna handlar om att använda hyaluronan för att reparera och rekonstruera skadade vävnader. Det forskas också om att använda hyaluronan vid transport av läkemedel i kroppen samt för att behandla cancer. Eftersom hyaluronan kapslar in cellen och skyddar den mot angrepp från kroppens immunsystem så öppnas möjligheter att med denna inkapslingsteknik skapa helt nya produkter. Inom cellterapi undersöks olika metoder för behandling av olika sjukdomar som till exempel insulinberoende diabetes. 10
Nyligen har forskare undersökt en ny formulering av insulin, ett hyaluronaninsulin komplex. Undersökningen har gjorts genom att studera hur peptider och hyaluronan beter sig i starkt sura lösningar som innehåller elektrolyter. In vivo aktiviteten hos den orala formuleringen utvärderades genom att mäta minskningen av halten glukos i blodet hos råttor med diabetes. Resultaten visar att hyaluronaninsulin komplexet leder till minskad halt glukos i blodet. Hyaff-11 är en nyligen utvecklad hyaluronanbaserad polymer som bryts ned naturligt i kroppen. Lyckade försök har gjorts att odla olika typer av celler i vitro på detta biomaterial. Denna väv med celler skulle sedan kunna användas som implantat för att exempelvis reparera brosk. 11
Referenser Biocoat Incorporated. [besöktes 2005-01-05] Grigolo B, Lisignoli G, Piacentini A, Fiorini M, Roseti L, De Franceschi L, et al. Tissue engineering for cartilage repair: in vitro properties of a hyaluronanderivative. Chir Organi Mov. 2003; 88(4):351-5. Abstract Jederstrom G, Andersson A, Grasjo J, Sjoholm I. Formulating insulin for oral administration: preparation of hyaluronan-insulin complex. Pharm Res. 2004; 21(11):2040-7. Abstract Lammi Mikko. Proteoglycans. 2001 [besöktes 2005-01-06] Laurent TC och Fraser JR. Hyaluronan. The FASEB Journal, 1992; 6: 2397-2404. Abstract Monter BMC (A9 plan 1), Uppsala, 2004-12-08 Q-med. [besöktes 2005-01-06] Restylane [besöktes 2004-12-08] Samuelsson G. Drugs of Natural Origin. 4 th edition. Stockholm: Apotekarsocieteten; 1999 Seikagaku corporation. Glycoforum. [besöktes 2005-01-06] Zavan B, Cortivo R, Tonello C, Abatangelo G.Gland cell cultures into 3D hyaluronan-based scaffolds. Mater Sci Mater Med. 2003; 14(8):727-9. Abstract 12