Mitokondriella sjukdomar Gittan Kollberg Avd för klinisk kemi Sahlgrenska Sjukhuset Göteborg
Mitokondriell sjukdom Definition Oxidativ fosforylering Genetik och ärftlighet Biokemisk utredning av mitokondriefunktion Diagnos
Mitokondriesjukdom - definition Intermembrane space Inner membrane Electron transport Mitochondrial matrix Mitokondriell sjukdom är per definition när den oxidativa fosforyleringen inte fungerar Kroppens organ får inte den energi som krävs för att upprätthålla viktiga funktioner Energikrävande vävnader som till exempel muskler, hjärna och endokrina organ drabbas oftast värst Reproduced from: Zeviani and Di Donato, Brain, 127:2154 (2004) Figure reproduced from: Zeviani and Di Donato, Brain, 127:2154 (2004)
Mitokondrie-DNA Intermembrane space Inner membrane Electron transport Mitochondrial matrix Mitokondrie-DNA (mtdna) kodar för 37 gener: 13 proteiner, 22 trna och 2 rrna. Proteinerna är alla subenheter i komplexen där den oxidativa fosforyleringen äger rum Figure reproduced from: Zeviani and Di Donato, Brain, 127:2154 (2004)
Nuclear DNA Respiratory chain proteins Other mitochondrial proteins mtrna mtdna proteins Figure: Gittan Kollberg, Göteborg Mitokondrie
Ärftlighet - familjestudier Autosomal dominant ärftlighet Autosomal recessiv ärftlighet eller sporadiskt fall Maternell ärftlighet Figure: Gittan Kollberg, Göteborg X-bunden ärftlighet
Varför göra mitokondrieundersökning? För att studera funktionen i andningskedjan hos patienter med en misstänkt mitokondriesjukdom För att bekräfta eller utesluta mitokondriesjukdom För att undersökningen kan ge en uppfattning om VAR felet sitter om mitokondriesjukdom bekräftas Om mitokondriesjukdom utesluts kan undersökningen ändå ibland ge information om vilken annan metabol sjukdom det kan vara Många patienter är barn med en sjukdom där orsaken är okänd - kan man finna orsaken och även koppla till variation i någon gen finns det möjlighet att göra fosterdiagnostik och/eller genetisk vägledning
Mitokondrier i muskelvävnad Electron micrography of sarcomers, glycogen and mitochondria Photo: Gittan Kollberg
Schemat visar hur flödet ser ut på vår enhet när en fullständig mitokondrieutredning görs. Varje utredning kräver förstås en väl fungerande organisation och ett samarbete utöver det som presenteras i detta schema. Figur: Frida Oddhammar, Klinisk kemi, metabola sjukdomar, Sahlgrenska
Biokemisk undersökning av mitokondriefunktion Andningskedjans funktion kopplat till oxidativ fosforylering mäts bäst i mitokondrier preparerade från färsk muskelvävnad Analysen bör starta så snart som möjligt efter att muskelbiopsin är tagen Några dagar innan förbereds alla substrat så att det blir exakt rätt koncentration som tillsätts när man mäter funktionen På morgonen innan biopsin kommer görs alla förberedelser som krävs så att allt står klart när biopsin kommer sen är det bara att vänta
och vänta
Biopsin kommer Mitokondriepreparationen måste börja inom en timma efter att biopsin tagits och kommer därför med bud som levererar den direkt till vårt lab Med muskelbiopsin kommer också ett flertal andra prover som tas om hand samma dag Fett och senor tas bort så att muskeln blir så ren som möjligt
Mitokondriepreparation Muskelbiten vägs och klipps i så små bitar som möjligt i ett sucros-edta-heparin-medium Muskelbiten homogeniseras tillsammans med medium i en Potter-elvehjem homogenisator Blandningen centrifugeras så att mitokondrierna finns i supernatanten Supernatanten centrifugeras på högre varvtal så att mitokondrierna bildar en pellet på rörets botten
Oxymetri mätning av syreförbrukning Med en clark-elektrod kan man mäta syrekonsumtion hos mitokondrierna vid tillsats av olika substrat och ADP Elektroden separeras från mätcellen genom ett tunt membran som är permeablelt för molekylärt syre Mätcellen tvättas mellan varje omgång substat+mitokondrier+adp som tillsätts Figure from: Wikipedia Tillsatta substrat och inhibitor 1. Pyruvat+Malat 2. Glutamat+Malat 3. Palmitat+Malat 4a. Rotenon 4b. Succinat 5. Askorbat+TMPD
Efter körningen kan vi beräkna hur mycket syre per minut som konsumerats för varje enskilt substrat På nyare apparat som främst används numera är beräkningarna datoriserade även om manuellt räknande fortfarande kan förekomma
ATPas-aktivitet - Komplex V DNP Genom att tillsätta Dinitrofenol (DNP) frikopplas andningskedjan från komplex V och man kan mäta den omvända reaktionen av aktiviteten för komplexet
Lowry proteinkoncentration beräknas Uppmätta värden på ATPasaktivitet, syreförbrukning och senare också aktivitet på enskilda komplex relateras till koncentrationen av mitokondrieprotein
Sedan är det mer som ska göras Odling av fibroblaster Preparation av lymfocyter Mätning av Laktat/Pyruvat i blod och likvor Karnitin + Acylkarnitiner Preparation av DNA Mutationsanalys Några vanliga punktmutationer i mtdna Deletioner i mtdna CoQ10 Enzymaktivitet av enskilda komplex med mera
Några exempel på vad den biokemiska utredningen kan visa Kombinerad Komplex I+IV defekt kan tyda på mutation i en mitokondriell trna-gen Generellt låga nivåer av allt kan vara mtdna depletion Låg oxidation av pyruvat och resten normalt i kombination med att laktat/pyruvatkvoten är låg trots förhöjt laktat kan vara PDHc-brist Kombinerad Komplex I-III-brist kan tyda på defekter i järn-svavel-komplex-bildningen Isolerad Komplex I-defekt kan vara mutation i antingen mitokondriell eller nukleär gen för subenhet i komplex I Isolerad Komplex IV-brist kan vara mutation i mitokondriell eller nukleär gen för subenhet eller assemblyfaktor för komplex IV Låg oxidation av palmitat i kombination med förhöjda nivåer av acylkarnitiner av varierande längd kan vara multipel acyl-coa dehydrogenas-brist Block vid Komplex III men normal succinatdehydrogenas-aktivitet kan vara CoenzymQ10-brist eller mutation i gen för subenhet eller assemblyfaktor för komplex III
Diagnos Alla resultat sammanfattas och diskuteras i samråd med övriga utredningar som gjorts kring patienten När klinik, muskelmorfologi, biokemi ställs samman så kanske vi kan ställa diagnos om inte så fortsätter utredningen Målet är alltid att patienten ska få en diagnos