Rening, inmärkning och användning av ett målprotein Protein A / Fc co-crystal complex Protein A domain Antibody Protein A binding Protein A domain CH 3 CH 2 Deisenhofer 1981
Upplägg av labben Framtagning av målproteinet Z Upparbetning av E. coil lysat Proteinrening med IMAC Gelfiltrering Koncentrationsbestämning Inmärkning med fluorofor Amin eller cysteinkoppling Separation av Z med och utan fluorofor HPLC Analys av Z med och utan fluorofor Masspektrometri BIAcore Betsämning av IgG-halt i ett okänt prov Gyros Z domänens struktur C 58 aa Trehelix-knippe H3 H2 H1 N
VH VL Interaktionen mellan en antikropp och Z Antigen binding Fv CL CH1 CH1 CL Fab Fc CH2 CH3 CH2 CH3 Z bindning Reningshandtag, His 6 Fusion mellan målproteinet och en His 6 -tag Vanligt vid produktion av rekombinanta proteiner Enkel, ganska specifik rening som är oberoende av målproteinet Kan renas under denaturerande förhållanden, bra då proteinet bildar inklusionkroppar i värden och är allmänt olösligt Eluering sker med lågt ph eller kompetitivt med något som binder till metalljoner t ex EDTA
Koncentration Ett sätt att mäta proteinkoncentration är med hjälp av absorbans Ett proteins extinsionskoefficient kan beräknas utifrån proteinets aminosyrasekvens Ljus med våglängden 280 nm absorberas av de aromatiska aminosyrorna, främst Tryptofan. Lambert-Beers lag: (A =! " l " C) gör att koncentrationen kan bestämmas om Absorbansen är känd Gelfiltrering
Inmärkning av protein med fluorofor Cystein -COOH Två varianter av inmärkning -COOH Z Z H 2 N- His 6 Cystein har en tiolgrupp som utnyttjas för en riktad inmärkning med fluoroforen Cy5 H 2 N- His 6 Fluoroforen Cy5 kopplas till primära aminer i aa-sekvensen Ospecifik inmärkning eftersom man inte kan kontrollera hur många av aminerna som märks in High performance liquid chromatography (HPLC) Hög upplösning är ett krav för att kunna separera molekyler som är lika, t ex Z med och utan fluorofor Upplösningen (separationen) ökar med mindre partikelstorlek (Större yta # fler antal teoretiska bottnar) Mindre partikelstorlek leder också till ökat mottryck HPLC system är byggda för att klara höga tryck. Högt tryck är nödvändigt för att hålla nere tiden det tar att separera analyterna
Reversed phase chromatography (RPC) Loading Binding Elution ligand ligand ligand Binding of the protein in a polar mobile phase Elution by changing the composition of the mobile phase to become more non-polar RPC stationary phase Hydrophobic ligands immobilized on porous solid supports Parameters affecting the separation: Type of matrix # typically rigid, to withstand high pressure Bead size # smaller particles give higher resolution Pore size # wide pores give efficient transfer of molecules Type of ligand # more hydrophobic molecule requires less hydrophobic ligand Ligand density # aging of columns releases ligand and leaves exposed silanol groups
RPC matrix Types of matrices used: Synthetic polymer Monosized, rigid polystyrene/divinyl benzene Bead size: 5 µm Important factors: Pressure stability (high degree of cross-linking is necessary) Chemical stability (silica gels are base-sensitive!) Kromatogram från HPLC 2500 Absorbans 2000 1500 1000 500 0-500 0 5 10 15 20 25 30 Tid (minuter)
Fluorescens Energi S 1! S 0 h$ ex 1 2 3 S 1 h$ em 1 Ljus av en viss våglängd, h$ ex, absorberas av fluoroforen som då exciteras från S 0 till S! 1 2 Energi avges och resulterar i ett relaxerat tillstånd S 1 3 När elektronen återgår till S 0 emitteras ljus med en specifik våglängd, h$ em Intensitet Excitation spektrum Emission spektrum Excitation vid kortare våglängd Emission vid längre våglängd Våglängd Masspektrometri -Används för att mäta molekylers vikt. 1. Provet blandas med en matris och lösningen pipetteras sedan till en platta, en så kallad MALDI-target. 2. Provet beskjuts med korta laserpulser. Prov- och matrismolekylerna lämnar target och jonisering sker.) 3. Jonerna accelereras i ett elektriskt fält till samma kinetiska energi. Därefter färdas jonerna i ett flygrör fram till detektorn. Flygtiden beror av molekylernas massa och laddning (TOF: Time of flight). Inne i masspektrometern är det vacuum. 4. Den uppmätta tiden är korrelerad till molekylens massa och laddning. Om laddningen är känd kan man räkna fram molekylens massa OBS! Schematisk bild.
Masspektrometri m z = m + nh + nh + Studie av protein-protein interaktion Surface plasmon resonance (SPR Mäter interaktionen mellan biomolekyler genom att mäta massan av biomolekyler nära en yta
Sensorgram 400 350 300 250 E40A 200 E3A wt 150 100 50 E32A 0 Y20A -50 0 500 1000 1500 Time[s] Gyrolab Bioaffy - immunoassays
User designs single or multiplex assays Single assay: Up to 104 datapoints Multiplex assay: 1 sample Fluorescent Detection In Situ (on Matrix)
Mouse cytokines 100 10 IL-6 IFN% IL-2 TNF& Response 1 0.1 0.01 10 100 1000 10000 Concentration (pg/ml) Riktlinjer för rapportskrivning En rapport/två elever Alla moment ska gå att följa samt repetera med samma resultat (även av någn som ej läst manualen) Lämnas in som pdf-fil till e-mail: seppen@biotech.kth Frågor angående lab/rapport kan lämpligen skickas till samma adress Din rapport kommer att bedömas av fyra kurskamrater och du kommer att läsa två andra rapporter Kommentarer skickas via e-mail och distribueras till rätt labgrupp av mig (skriv namn på allt). Deadline finns i labschemat Rättad rapport får ni tillbaka med kommentarer via e-mail. Genom att förstå teorin bakom laborationerna, och presentera en bra rapport, är mycket vunnet inför den kommande tentaläsningen!
Rapport Introduktion Målet: varför märks proteinet in? Teori: berätta om målmolekylen och dess egenskaper som ni kommer att utnyttja Material och metoder Data som behövs för att upprepa försöket (flöde, buffert, ph, volymer, utförande, kemikalier, material och utrustning. Här behövs oftast inga exakta förfaranden. Endast viss information är nödvändig för att upprepa allt. Koncentrationer i slutlösning, inkubationstider, flöden, gradienter m.m. Rapport Resultat Sammanfattning av resultat och primärdata Underlag för resultat (diagram, eventuella gelbilder m.m.) skall redovisas i form av numrerade bilagor. Referenser till dessa bilagor skall finnas i resultatavsnittet. Märk toppar etc i bilagorna. Alla beräkningar skall redovisas tydligt, vara lätta att följa, innehålla enheter samt förklaring/hänvisning till varifrån primärdata och konstanter är tagna.
Rapport Diskussion Här ska alla resultat kommenteras och slutsatser dras. Utbyte, varför dåligt/bra, vad kan förbättras? Inmärkning, varför dåligt/bra Molekylvikt, stämmer den, varför inte?» etc Utvärdering av laborationen. Här ges synpunkter på hela labbkursen. Viktigt för mig och kommande kurser! Bedömning av rapport Går det att förstå varför försöket är gjort? Går det att följa upplägget? Finns alla primärdata redovisade? Kan man förstå och följa beräkningarna? Är beräkningarna rätt? Kan man se varifrån siffror och resultat är hämtade? Finns bilagor och figurer refererade på ett förståeligt sätt? Är slutsatserna logiska?