Steady state spektroskopi samt bestämning av luminescenslivslängden

Transkript

1 Steady state spektroskopi samt bestämning av luminescenslivslängden för Ru(bpy)3 2+ i frånvaro och närvaro av utsläckare. Innehåll: Jabłonskidiagrammet. Praktisk absorptions och fluorescensspektroskopi. Fotokemiska reaktioner och begreppet fluorescensutsläckning. Tillämpning av steady state approximationen. Kvantutbyten. Tidsupplöst emission. Beräkning av hastighetskonstanten för bimolekylära reaktion ur livslängdsdata. Denna laboration behandlar delvis samma frågeställningar som fluorescenslaborationen i Kemiska reaktioner. Handledningen till denna bifogas. I denna kurs genomförs experimenten dock med högre precision och vi kommer även att göra tidsupplösta mätningar av emissionslivslängder. Bakgrund Absorptionsspektroskopi När ljus av intensiteten I passerar ett tunt skikt av en lösning med koncentrationen c ändras ljusstyrka n enl igt di = κc dx där dx är lösningsskiktets tjocklek, c lösningens koncentration, och κ är en proportionalitetskonstant som är specifik för substansen ifråga och den våglängd vid vilken mätningen görs. Med randvillkoret I(x=0)=I 0 är lösningen till ovanstående differentialekvation när man integrerar över hela provets tjocklek l ln (I 0 /I) = κcl Vanligen arbetar man med tiologaritmer och skriver om ovanstående uttryck till log 10 (I 0 /I) = εcl= A A kallas absorbans, och ε betecknas molär absorptivitet eller extinktionskoefficient. Ibland används även storheten transmittans T : T = (I / I 0 ) vilket innebär att: A = log 10 T Vid absorbansmätningar (se lärobok och föreläsningsanteckningar) mäter man ljusintensiteten före (I 0 ) och efter (I) provet. Det exponentiella sambandet mellan genomsläppt ljus och absorbans leder till att mätområdet uttryckt i absorbansenheter är relativt begränsat. Spektrofotometrar av god kvalitet kan med någorlund god precision mäta absorbanser upp till ca fyra (då 1 del ljus av 10 4 passerar provet). 1

2 Fluorescensspektroskopi HCB 10/08 Spektrometerns uppbyggnad har behandlats på föreläsningen (se även Fig. 1). Nedan kommer några praktiska aspekter att nämnas. Figur 1: Ett schematiskt diagram över en emissionsspektrometer Den totala emissionen från ett prov bestäms av koncentrationen exciterade molekyler. Denna är i sin tur en funktion av hur många fotoner provet absorberar. Eftersom detta bestäms av transmittansen T är alltså emissionsintensiteten inte proportionell mot koncentrationen (d.v.s. absorbansen; se ovan). Endast vid låga absorbanser, då 10 A är linjärt med koncentrationen kan emissionen anses vara proportionell mot koncentrationen (och absorbansen). Vid högre koncentrationer påverkar den s.k. inre filtereffekten emissionsspektrumet kraftigt (Fig. 2). Figur 2: Orsaken till den inre filtereffekten. Vänster: Emissionsintensitet respektive excitationsljusintensitet i en punkt i provet som funktion av absorbansen fram till denna punkt. Höger: Schematisk bild av hur excitationsljusintensiteten varierar i provet. Starkare blå färg är högre excitationsintensitet. Den grå cirkeln representerar det volymelement i vilken emissionen detekteras. 2

3 Den blåa linjen symboliserar excitationsljusets variation när det passerar ett koncentrerat prov, den röda linjen emissionsintensiteten. När excitationsljuset passerar provet kommer det att absorberas. Emissionsintensiteten är dock inte proportionell mot absorbansen, utan mot antalet absorberade fotoner. Uttrycket i transmittans är alltså emissionen proportionell mot 1 I/I 0. Det senare är 1 10 A, där A är absorbansen i provet. Excitationsljuset kommer att absoberas när det passerar provet. Detektorn "ser" endast en liten volym (var någonstans i provet denna är är en justeringssak). Vid höga absorbanser har excitationsljusets intensitet hunnit falla kraftigt. Detta leder till att en graf över emissionsintensitet mot absorbans är kraftigt olinjär och går genom ett maximum (se t.ex. för Rhodamin B i Fig 3 nedan). Endast vid låga absorbanser (<~0.25) är emissionen proportionell mot absorbansen. En tumregel är att man bör hålla absorbansen under 0.1 för att befinna sig inom det linjära området. Figur 3: Den uppmätta fluorescensintensiteten för Rhodamin B som funktion av provets absorbans. Lägg märke till att lineariteten är god endast upp till en absorbans av omkring 0.25, samt att den uppmätta emissionsintensiteten faktiskt minskar med ökande absorbans över omkring 1.3. (i) Emissionsspektra För att ta upp ett emissionsspektrum låter man excitationsmonokromatorn stå på en fix excitationsvåglängd (λ ex ) och mäter emissionens intensitet vid olika emissionsvåglängder (λ em ). För de flesta fluoroforer gäller i lösning att intern omvandling ("internal conversion") till det lägsta exciterade grundtillståndets vibrationsgrundtillstånd är snabbare än radiativ deaktivering (Kashas regel), varför excitationsvåglängden i princip inte är av betydelse så länge fluoroforen absorberar vid densamma (Fig. 3). 3

4 S 1 * Intern omvandling (kic) kic >> kr Excitation (λ ex ) Emission (λ em ; k r ) S 0 Figur 3: Jabłonskidiagram. Absorption och emission är inritade. Andra deaktiveringsprocesser (t.ex. utsläckning, icke radiativ deaktivering, ytkorsning) betraktas inte här. (ii) Excitationsspektra Ett excitationsspektrum tas vid en konstant emissionsvåglängd λ em och varierande excitationsvåglängd λ e x (d.v.s. motsatsen till hur man mäter ett emissionsspektrum). Om Kashas regel gäller skall excitationsspektrumet likna absorptions (varför?). Dock kommer excitationsspektrumet att distorderas om spektrumet absorbansen blir för hög (varför?). (iii) Korrigerade spektra I praktiken är fluorescensmätningar behäftade med ett flertal instrumentberoende artefakter. Lyckligtvis kan man i hög utsträckning kompensera för dessa. Samtliga delar i detektionssystemet (optik, monokromator och detektor) har mer eller mindre våglängdsberoende egenskaper. Till exempel varierar både monokromatorns genomsläpplighet och detektorns känslighet (Fig. 4) kraftigt med våglängden (jämför med ögats känslighet för olika färger). Känslighetskurvorna beror förstås på vilka komponenter man använt vid konstruktionen av fluorimetern. Figur 4: Våglängdsberoende av olika detektorers känsligheter [Harris, Quantitative Chemical Analysis (2003, 6:e upplagan )]. 4

5 För att kunna jämföra emissionsspektra mellan olika fluorimetrar måste man kompensera för våglängdsberoendet. Detta kan göras på olika sätt, men det vanligaste är att man tar upp ett spektrum med känd form (t.ex. en svartkroppsstrålare vid en bestämd temperatur) och jämför det uppmätta spektrumet med det faktiska. Kvoten mellan dem utgör den s.k. korrektionsfaktorn. I det röda området, där de flesta fotomultiplikatorers känslighet avtar dramatiskt, kan korrektionsfaktorerna bli över 1000, d.v.s. den uppmätta signalen måste multipliceras med >1000 för att få det korrekta mätvärdet. I figuren nedan visas effekten av korrektion på ett emissionsspektrum. Notera att både form och emissionsmaximum ändras efter korrektionen! Figur 5: Emissionsspektra av en fluorofor med och utan korrektion för detektorns våglängdsberoende känslighet. Korrektion av excitationsspektra Emissionsintensiteten är förstås beroende av excitationsljusets styrka. För att kompensera för lampans spektrum och excitationsmonokromatorns våglängdsberoende mäter man (se figuren ovan) intensiteten på ljuset efter excitationsmonokromatorn och dividerar den uppmätta emissionen med denna signalen. Detta bör också göras när man mäter emissionsspektra för att kompensera för fluktuationer i lampljusets intensitet. Tidsupplöst emission Många fotofysiska och fotokemiska processer är mycket snabba. Ofta ligger hastighetskonstanterna för unimolekylära reaktioner mellan 10 6 s 1 or s 1. Detta leder till en del mättekniska problem, speciellt för processer med tidskonstanter kortare än omkring 10 ns. För måttligt snabba reaktioner, t.ex. 5

6 fosforescens (k typiskt s 1 ) och bimolekylära reaktioner mellan en exciterad molekyl och en annan reaktant (k 10 9 s 1 M 1 ) kan man dock använda metoder där man direkt följer reaktionens gång spektroskopiskt. Fig. 6 visar huvuddelarna av ett s.k. blixtfotolyssystem ("flash photolysis"). Tidsupplöst signal mäts med ett digitaloscilloskop Figur 6: Ett schematiskt diagram över ett blixtfotolyssystem. Provet bestrålas med en kort (5 10 ns) intensiv laserblixt. Emissionen tas genom en monokromator till en snabb fotomultiplikator ( photomultiplier tube, PMT ovan), och ett digitaloscilloskop samlar in emissionsavklingningen i realtid. Oftast medelvärderas flera avklingningar. Processer som är snabbare än laserblixten och/eller snabbare än detektorns och oscilloskopets respons kan inte mätas med denna metod. Den är alltså i allmänhet inte lämplig för fluorescens, men väl lämpad för att mäta fosforescenslivslängder. Stern Volmer grafe r och emissionsutsläckning I samband med laborationen i våras härleddes ett uttryck för fluorescensintensiteten som funktion a v halten utsläckare [Q]. F 0 F = 1+ k q [Q](k r + k nr ) 1 där F 0 och F betecknar emissionsintensiteterna i frånvaro respektive närvaro av utsläckare, k q betecknar utsläckningshastighetskonstaten, och k r och k nr 6

7 betecknar hastighetskonstanterna för radiativ respektive icke radiatv deaktivering. Det visar sig att ett analogt uttryck kan härledas på samma sätt för livslängderna. τ 0 τ =1+ k q [Q](k r + k nr ) 1 Om den enda reaktionen som sker är bimolekylär utsläckning bör båda formerna ge samma resultat, eftersom F i så fall är proportionell mot τ. 7

8 Utförande A. Absorptions, emissions och excitationsspektra HCB 10/08 1. Hämta vattenlösningar av zinkporfyrin (ZnP), Ru(bpy) 3 och en blandning av båda från labbhandledaren. 2. Mät lösningarnas absorbansspektrum över nm. Absorbansen i första absorptionsmaximumet bör i proven vara omkring 0.1. Observera att absorbansen i porfyrinens absorptionsband vid kortare våglängder blir relativt hög. 3. Tag upp emissionsspektra för ZnP och Ru(bpy) Testa både med och utan korrigering för monokromatorns/detektorns våglängdsberoende respons. För Ru(bpy) 3 2+, använd den våglängd som ger maximum absorption som λ ex. För ZnP, tag upp två emissionspektra, först med den längsta våglängd som ger en absorptionstopp som λ ex, sedan med den våglängd som ger den högsta absorbance som λ ex. Stämmer Kashas regel för båda föreningarna? Vad märker du om deras Stokesskifter? Diskutera. 4. Tag upp excitationsspektra för ZnP och Ru(bpy) Välj en lämplig emissionsvåglängd λ em och ett lämpligt spann för excitationsvåglängderna λ ex (det bör täcka in flera absorptionsband). Jämför dessa excitationsspektra med sina respektive absorptionsspektra. Hur väl stämmer dem med varandra? 5. Tag up p föjlande spektra för blandningen av ZnP och Ru(bpy) (i) 3 x emissionsspektra, λ ex = 420, 445, 470 nm. (ii) 3 x excitationsspektra, λ em = 560, 660, 700 nm. Med hänsyn till de emissions och excitationsspektra som tagits ovan, diskutera dessa spektras utseende (form, intensitet o.s.v.). B. Tidsupplöst emission 1. Tag en luftmättade lösning av Ru(bpy) 3 2+ i vatten och mät dess luminescenslivslängd. 2. Bubbla lösningen med argon eller kvävgas 5 10 minuter. Mät om livslängden. Blir det någon skillnad? Varför? 3. Metylviologen släcker ut det exciterade tillståndet hos Ru(bpy) 2+ 3 genom elektronöverföring. Tillsätt metylviologenlösning i lämpligt valda portioner (utgå från att den bimolekylära hastighetskonstanten för 8

9 utsläckning är 10 9 s 1 ) och mät för varje punkt livslängden hos ruteniumkomplexet. Gör detta för 4 6 punkter. Instrumentering Handledaren kommer att gå igenom handhavandet av instrumenten. Dataanalys och rapport A. Absorptions, emissions och excitationsspektra Visa de uppmätta steady state spektra och diskutera de iakttagelser som gjorts under laborationen. B. Tidsupplöst emission Passa vidare de uppmätta emissionsavklingningarna till en exponentialfunktion och bestäm livslängden i luftmättad lösning, i syrefri lösning samt vid de olika koncentrationerna metylviologen. Härled uttrycket ovan för τ 0 / τ som funktion av [Q]. Gör en Stern Volmer graf (τ 0 /τ mot [Q]) och bestäm hastighetskonstanten för reaktionen mellan metylviologen och exciterat Ru(bpy) Blir det en rät linje? Om inte, vad skulle förklaringen kunna vara? 9