Masspektrometri. Margareta Ramström Jonsson. Föreläsning m/z

Transkript

1 Masspektrometri m/z Margareta Ramström Jonsson Föreläsning

2 Uppbyggnad, MS Jonkälla Massanalysator Detektor Molekyler joniseras Ex. Elektrospray, MALDI Jonerna separeras med avseende på massa och laddning. Ex. Quadrupole, time-offlight, FTICR Massa-överladdning detekteras

3 Jonisering - Både katjoner och anjoner kan bildas! - Katjoner är vanligast. Exempel [M+H + ] [M+Na + ]

4 Joniseringstekniker Vid analys av biomolekyler är det nödvändigt att använda milda joniseringstekniker! Elektrospray och MALDI!

5 Jonisering med elektrospray Sker vid atmosfärstryck. Positiv elektrospray är vanligast för proteiner och peptider => positivt laddade joner analyseras. Provet löses i t.ex. 50:50 H 2 O: organiskt lösningsmedel + låg andel syra, t.ex. ättiksyra (HAc). Provmolekylerna är positivt laddade redan i lösningen.

6 Electrospray ionization Sample MS inlet (Positive electrospray) En högspänning läggs mellan spraykapillären och MS, vanligen 2-3 kv. En taylorkon bildas och vätskan delas i små droppar. Lösningsmedlet evaporerar, laddningsrepulsionen ökar och dropparna spricker till ännu mindre enheter, och slutligen formas nakna joner.

7 Exempel Elektrosprayspektrum av myoglobin HHM 1:1000 in 5% ACN, 1% HOAc Ronny_050701_ (2.501) Cm (26:34) 100 % TOF MS ES+ 6.64e m/z Myoglobin, Mw= Da OBS! I elektrospray blir större molekyler multipelladdade. Går att kombinera med instrument med begränsat m/z-område. För att beräkna molekylvikten ur spektret måste vi göra en DEKONVOLERING. Finns oftast inbyggd i mjukvaran som styr masspektrometern.

8 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Prov Matris Provet blandas med en matris => Läggs på en MALDI-target. Matrisen en liten organisk molekyl som absorberar starkt i UV-området Prov + matris kristalliserar på target innan denna sätts in i masspektrometern.

9 Vanliga MALDI-matriser Kommer ni att använda på lab.

10 MALDI, forts. laser Intorkning + H + Proton transfer Desorption Provet beskjuts med laser Matrisen absorberar laserljus Energiöverföring sker Provmolekylerna joniseras

11 Voyager Spec #1=>MC=>MC=>SM9[BP = , 2566] MALDI-spektrum av myoglobin Intensitet % Intensity Mass (m/z) Peptider oftast bara enkelladdade joner Proteiner enkel- och ev. dubbelladdade.

12 MALDI eller elektrospray? För biomolekyler är ofta båda ett bra val. MALDI God känslighet High throughput Mer tolerant mot salter Lättolkade spektrum Elektrospray Kan kopplas on-line till LC och CE God känslighet, speciellt om nanospray används Man får generellt sett bättre massnoggrannhet även för stora molekyler.

13 Massanalysatorer Uppgift: Att separera jonerna map m/z, så att de sedan kan räknas av detektorn. Utnyttjar joners egenskaper i elektriska och/eller magnetiska fält. Exempel på vanliga analysatorer: Quadrupole Magnetisk eller elektrisk sektor Time-of-flight (ToF) Jonfälla (ion trap) Fourier-transform-joncyklotronresonans MS (FTICR)

14 Viktiga begrepp Massnoggrannhet- Hur noggrant kan massan bestämmas? Upplösning- Förmåga att separera toppar med närliggande massor. Detektionsgräns- Den minsta mängd analyt som ger signal

15 Quadrupole Scannas Instrumentet scannas Konstant fält För varje steg når joner av exakt ett m/z detektorn

16 Quadrupole MS Relativt långsamt instrument Begränsad massnoggrannhet Lätt att kalibrera Robust, relativt billigt Används ofta i MS/MS-experiment

17 Time-of-flight (ToF) Flygrör kv d Då jonen lämnar det elektriska fältet W = mv 2 /2= qv där v=hastigheten, m=massan, q=laddning, V=potentialskillnad Flygtiden genom röret t =d/v (Använder ni i labkursen)

18 För att förbättra upplösningen i ToF används en reflektor = en jonspegel. I reflektorn byter jonerna riktning pga ett elektriskt fält. Beroende av initial rörelseenergi rör sig jonerna olika långt in i fältet innan de vänder. Kompenserar för små skillnader i kinetisk energi, initial position och tidpunkt då jonerna bildades.

19 Jämförelse Linjär ToF Reflektor ToF Intens. [a.u.] 2000 Intens. [a.u.] m /z m /z Samma peptid. Reflektormode ger betydligt bättre upplösning.

20 ToF MS är ett snabbt instrument. - Både elektrospray och MALDI kan användas som jonkälla - Bra val om man vill koppla snabba separationstekniker on-line till masspektrometern - I princip obegränsat massområde - Ger hög upplösning i reflector mode

21 Fourier-transform-joncyklotron-resonans (FTICR) MS Magnet, 9.4 T B Hexapole Electrospray Ion optics Skimmer Capillary Analyzer cell

22 Cyclotron Motion v F B Lorentz force F = q(v x B) f c =qb/2!m Ultrahög upplösning (resolving power >10 6 ) Hög massnoggrannhet (subppm) Hög känslighet m/z

23 Excitation och detektion Ett par excitationsplattor: Joner i resonans med excitationsfrekvensen absorberar energi och kommer att cirkulera i bana med större radie. Alla joner med samma m/z rör sig koherent. Ett par detektorplattor: Detekterar strömmen som den koherenta rörelsen ger upphov till. OBS! I en FTICR sker masseparation och detektion på samma plats i cellen!

24 Bra val om man vill analysera -Komplexa prover -Behöver hög massnoggrannhet -De flesta grupper jobbar med ESI- FTICR MS, men möjlighet att jonisera med MALDI finns också.

25 Numera även mycket vanligt med hybridinstrument - Idé: Kombinera de bästa egenskaperna hos två instrument. Ett vanlig exempel är Quadrupole-Time-of-Flight (q-tof) - Bra tandem-ms-möjligheter i ett TOF-instrument!

26 Detektorer Bilden: Princip för elektronmultiplikator Generell princip: Jonerna når ytan på detektorn Elektronöverföring sker Elektrisk ström Signal till datorn som omvandlar till masspektrum

27 Tolkning av masspekta Isotopfördelning i ett spektrum med god upplösning Monoisotopisk massa 1:a isotoptoppen ( 12 C " 98,9%, 13 C " 1,1% => Vi får olika teoretiska massor beroende av isotopsammansättningen => Isotoptoppar) 2:a isotoptoppen I spektrum med hög upplösning kan vi lätt avgöra vilken laddning jonen har, och därmed molekylmassan m/z (Från FTICR)

28 M+H + M+2H + M+3H + M+4H +

29 Tandem MS, peptidfragmentering Ger info om sekvensen, peptidens uppbyggnad. H 2 N - a 1 b 1 c 1 O O CH C NH CH C - - R 1 R 2 x n-1 y n-1 z n-1 Fragmenten kallas a, b och c respektive x, y och z beroende på var fragmenteringen sker och vilken ände som joniseras.

30 HUR DÅ? Exempel Fragmentering i quadrupole Q1 Q2 Q3 Val av precursorjon Kollisionscell. Jonerna kolliderar med gasmolekyler Scannas. Ett massspektrum registreras CID - collision induced dissociation (ovan) Här dominerar fragmentering av peptidbindning, dvs vi får b- och y-fragment! CID kan genereras i de flesta masspektrometrar på olika sätt. Andra sätt att fragmentera kan vara genom att beskjuta provmolekylerna med fotoner (laser) eller elektroner.

31 Aminosyrornas massor (i peptidkedjan) Klipp in tabellen från kursboken.

32 Skillnaden mellan två närliggande fragment ger massan på den aminosyra som skiljer. b-fragments V A Q L E L G G G y-fragments G G G L b 7 [M+2H] 2+ y 11 y 12 b 11 b 6 b 8 b 9 b 10 y 13 y 14 y15 b12 b13 b14 b15 y17 y19 b m/z Vi räknar ett exempel!

33 Traditionell Proteomics Separera proteiner på gel Färga in Lokalisera spottar av intresse Skär ut gelbit Digerera proteinet med hjälp av ett enzym (trypsin) Kör MS på resulterande peptider Databassökning 2D PAGE ryggmärgsvätska Figure from Kim et al. Stroke 2003:24,

34 Trypsin klyver specifikt C-terminalt om lysin (K) och arginin (R). Myoglobin GLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKS EDEMKASEDLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIKPLAQSHATKHKIPVKYL EFISECIIQVLQSKHP GDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYKELGFQG (Leta upp klyvningssajterna!) Viktigt att definiera klyvningsförhållandena, t.ex. reducera cysteinbryggor.

35 Tänkbara tryptiska peptider (myoglobin) (K) HLK (S) (R) LFK (G) (K) FDK (F) (K) IPVK (Y) (K) ELGFQG (-) (K) ASEDLK (K) (K) SEDEMK (A) (K) ALELFR (K) Met-ox (K)SEDEMK(A) (K) DMASNYK (E) Met-ox (K)DMASNYK(E) (K) GHPETLEK (F) (K) HGATVLTALGGILK (K) (K) HPGDFGADAQGAMNK (A) Met-ox (K)HPGDFGADAQGAMNK(A) (K) VEADIPGHGQEVLIR (L) (-) GLSDGEWQLVLNVWGK (V) (K) GHHEAEIKPLAQSHATK (H) (K) YLEFISECIIQVLQSK (H)

36 Exempel: Enzymatiskt digerat, serum albumin Elektrospray Intens. [a.u.] 4000 MALDI m/z m /z Man får komplexa spektra. Elektrosprayspektret något mer komplext än MALDIspektret. Då man använder elektrospray är det även vanligt att analysera med HPLC-MS.

37 Databassökningar (Exempel på program) Info från gel Välj tolerans beroende på MS-metod Klistra in massorna här!

38 Man får en lista på tänkbara proteiner rankade i ordning efter vilken som är troligast.

39 Information om vilka peptider som matchade de experimentella massorna, var i proteinsekvensen dessa befinner sig och mätfelet.

40 Alternativa metoder Shot-gun eller bottom-up proteomics Klyv proteinerna mha ett enzym Separera peptiderna (LC, CE eller separation i flera dimensioner) Detektion med MS eller MS/MS Databassökningar Enzymatic digestion Liquid chromatography MS or MS/MS Proteins Peptides

41 Ryggmärgsvätska, klyvt med trypsin. (LC-MS) tid m/z Fördelar: Man slipper gel-steget, problem med pi och hydrofobicitet Flera peptider från samma protein Lätt att automatisera Svårigheter: Komplext mönster Peptiderna från ett protein eluerar vid olika tider Många sökmotorer är konstruerade för analys av gelband

42 Kvantitativ proteomics Jämför koncentrationer i två prover. Flera gelfria metoder bygger på kemisk inmärkning Sample A Label with a light marker Sample B Label with a heavy marker Combine the samples I masspektret ser man signaler i par. Den relativa intensiteten ger relativ koncentration. Mass spectrometry Relative quantification

43 Exempel ICAT Affinity tag Linker Reactive group Länkdelen innehåller 1 H eller deuterium 2 H på X-positionerna. Skillnad i massa mellan tung och lätt markör blir 8 Da. Reaktiva gruppen märker in cysteiner. En biotin-tag för isolering av inmärkta peptider.

44 Att tänka på vid provpreparering Proverna måste vara lösta i för joniseringstekniken lämpliga lösningsmedel. Salter stör joniseringen. Kontaminanter från laboranten bör undvikas. Handskar på! (Vanligt: keratin från hud, polyetylenglykol (PEG) från t.ex. hudkrämer).

45 Vilka mängder är lämpliga att jobba med? MALDI Lämplig mängd peptid på MALDI-target är 1 pmol (10-12 mol). Man laddar ca 1 µl av varje prov. För proteiner behövs något större mängd, beroende på molekylens storlek. Electrospray Vid direktinfusion är en lämplig provkoncentration 1µM. Nanospray har drastiskt ökat känsligheten i elektrosprayinstrument. Låga flöden ca 10nL/min används. Provåtgången är mycket låg. Kopplingar av olika separationstekniker till masspektrometern ökar känsligheten. Provets komplexitet minskar, varje komponent koncentreras. Rekord: 30 zeptomol (10-21 mol) av proteiner i storleksordningen 8 to 20 kda har detekterats i en specialpreparerad FTICR MS.