Biomolekylär NMR-spektroskopi Från tilldelning till struktur: Sekventiell resonanstilldelning NMR data för strukturberäkningar Strukturberäkningar NMR-strukturers egenskaper
Grundstrategi för tilldelning av NMR-resonanser i ett protein: 1. Identifiera NMR-resonanser för varje aminosyra T G L S R S G 2. Lägg dem i ordning: - Sekvens-specifik tilldelning (Sequence-specific assignment) 1 2 3 4 5 6 7 R -G -S- T -L -G -S
Kärnspinnen kan påverka varandra genom Koherens- skalär koppling spinnrelaxation (noe) dipolär koppling spinnväxelverkan medierad av bindningselektronerna kräver kemisk binding olika kärnor påverkar varandra genom rymden då de relaxerar till grundtillståndet avståndsberoende (< 5Å), ~ 1/r 6
Homonukleär ( 1 H) tilldelningsstrategi: Skalär koppling (tocsy, cosy) för att identifiera vilka resonanser som är i samma aminosyra (spinnsystem), dipolär koppling (noe, noesy) för sekventiellt assignment: aminosyrorna knyts ihop i rätt ordning
Kurt Wüthrich Nobel laureate 2002 ETH, Zürich
NOESY för Grx4, 115 aa NHsidokedjor sidokedjor sidokedjor NH-NH Homonukleär tilldelning baseras på backbone NH-NH och NH-sidechain noes (väl åtskild region i 2Dspektrum, god resonansdispersion, minst överlapp)
Användning av olika 2D-spektra
Homonukleär sekventiell tilldelning Sekventiella assignmentet bygger endast på NOEer Sequential noes Long range noes Intraresidue A B C D Z Medium-range (helices)
Sekundärstrukturelement kan identifieras genom unika korta avstånd α-helix β-sheet (CαH) i NH i+3, (i+2, i+4) (CαH) i -(CβH) i+3 NH NH tvärs över flaket CαH CαH tvärs över flaket CαHi NH i+1 längs kedjan
Typiska sekundärstruktur-noe-er α-helix β-strands, β-sheets, β-turns (CαH) i NH i+3, (i+2, i+4) (CαH) i -(CβH) i+3 NH NH tvärs över flaket CαH CαH tvärs över flaket CαHi NH i+1 längs kedjan
Utökad homonukleär 1 H strategi: Likadant som 1 H strategin: baserat på backbone NH Koncept: när backbone 1 H överlappar sprid ut signalerna med backbone 15 N Använd heteronukleära 3D för att öka upplösningen 1 H 1 H 15 N noesy /tocsy hsqc
15 N Dispersed 1 H- 1 H TOCSY 3 overlapped NH resonances Same NH, different 15 N F2 F3 TOCSY HSQC F1 1 H 1 H 15 N t 1 t 2 t 3
15N-dispersed 1H-1H-NOESY HN 35 HN 48 HN 66 HSQC-sidan HN 48-2.00 1H 0.00 44 40 44 44-44 44 41 44 44 42 44 2.00 44 97 44 44 43 44 44 43 44 44 44 44 4.00 44 44 44 44 42 44 44 43 44 44 45 44 6.00 44 43 44 44 45 44 8.00 44 41 44 10.00 11.00 10.00 9.00 8.00 7.00 6.00 5.00 15N 1HN 2D-NOESY 2D-plan ger noe-er för en aminosyra! 1HN 3D-NOESY-HSQC
Strip-analys för sekventiellt assignment och (sekundärstruktur) NOEs H α NH Varje aminosyra har en strip längs 1 H 15 N- shiftet som visar dess grannar i sekvensen och i rymden vi måste lägga dessa strips i rätt ordning. NH
NH-NH Interna NH O H α R 2 NH O H α R 4 H α R 1 NH O H α R 3 NH O
NH-NH Interna, sekventiella - NH O H α R 2 NH O H α R 4 H α R 1 NH O H α R 3 NH O
NH-NH Interna, sekventiella - N i,n i+2 NH O H α R 2 NH O H α R 4 H α R 1 NH O H α R 3 NH O 5 Å
5 Å NH-Hα Ηα NH Ηα,NH i+1 H α Ηα,NH i+2 Ηα,NH i+3 NH O H α R 2 NH O H α R 4 H α R 1 NH O H α R 3 NH O
Här sitter helixen i Grx4- strukturen!
Heteronukleär ( 1 H, 13 C, 15 N) tilldelningsstrategi Tilldelning av resonanser för alla atomer (utom O) Överlapp i backbone 15 N 1 H kan spridas ut genom användning av kolresonanser C C α H α C β H β Heteronukleära 3D/4D ökar upplösningen 1 H 13 C 15 N 1 H Fungerar även på större proteiner eftersom heteronukleära skalära kopplingar är större än homonukleära ( 1 H - 1 H) vilket ger effektivare magnetiseringsöverföring
Heteronukleär sekventiell tilldelning Heteronuclear couplings Long Range NOEs Intraresidue A B C D Z Medium-range (helices)
Heteronukleär tilldelning: Backbone experiment Experimentnamn antyder hur magnetiseringen överförts
Heteronukleär tilldelning Exempel: HNCA
Heteronukleär tilldelning: sidokedje-experiment Dubbel information (multiple redundancies) ger möjlighet till ökad kontroll
Heteronukleär strategi: Sekventiell och aminosyra-specifik information i samma experiment Effektiva, men komplexa experiment Lättare att automatisera tilldelningen Möjliggör studier av större proteiner ( 1000 Da) Kräver 15 N, 13 C, och ibland 2 H inmärkning kräver gott uttryck på minimalmedia (E. coli) extra kostnader (3000 SEK 13 C-glukos, 500 SEK 15 NH 4 Cl, 5000 SEK 2 H per liter odlingsmedium)
Var går gränsen för NMR på proteiner?
Problem vid högre molekylvikter Långsam rörelse i lösning gör att signalen relaxerar snabbare dåligt signal-brus och breda signaler Växelverkan mellan relaxerande kärnor ökar relaxationen Överlappande toppar även i 2D och 3D spektra
men om vi hade färre magnetiskt aktiva kärnor, skulle vi få mindre relaxation och smalare linjer?
Vi kan minska antalet NMR-aktiva kärnor genom att ersätta 1 H med 2 H. Helt protonerad PLCC SH2 domän innehåller 756 väten ( 1 H). Helt deutererat protein i vattenlösning: 87 backbone NH och 62 sidokedje-nh på Arg, Asn, Gln, och Trp. Deutererat protein med protonering på metylgrupperna genom att proteinet framställts med märkt pyruvat i odlingsmediet.
Relaxationen minskar bättre upplösning, smalare linjer! protonerat deutererat
Ännu mer effekt på 13 C 1 H
Strukturbestämning med NMR
Experimentella NMR-observabler som kan ge strukturinformation Avstånds-constraints från NOEer Backbone och sidokedjors dihedervinkelconstraints från skalära kopplingar Vätebindnings-constraints Backbone dihedervinklar från kemiska shift (Chemical Shift Index- CSI) Riktningsconstraints från residual dipolar couplings (RDCs)
1 H- 1 H Distances From NOEs Sequential Long-range (tertiary structure) Intraresidue A B C D Z Medium-range (helices) Att tilldela alla NOE toppar i NOESY-spektra är en stor utmaning..
Här får den dipolära kopplingen möjlighet att agera, vilket ger NOEer (ändringar i toppintensitet) för kärnor närmre varandra än 5 Å. V NOE ~ 1/r 6
NOE buildup Overlap Storleken på NOEn är också beroende av mix-tiden (hur länge den dipolära kopplingen fått verka) samt proteinets storlek (magnetiseringen relaxerar med tiden).
Stort protein Litet protein NOE τ m Indirekt NOE
NOEer: Unika: endast ett atompar möjliga kandidater Ambiguösa: kan vara det ena eller det andra atomparet Överlappande: är troligen två NOEer ovanpå varandra Spinndiffusion: indirekt NOE avståndet ofta längre än 5 Å och inte proportionellt mot 1/r 6, alltså viktigt att välja korrekt mixtid för att undvika dessa
Approaches to Identifying NOEs 1 H- 1 H NOESY 2D 3D 1 H 1 H 1 H 1 H 1 H 15 N- or 13 C-dispersed 1 H- 1 H NOESY 3D 1 H 1 H 1 H 1 H 15 N 13 C 4D 1 H 1 H 1 H 1 H 1 H 1 H 15 N 13 C 13 C 13 C 15 N 15 N
Identifying Unique NOEs in protein complexes Filtered, edited NOE: based on selection of NOEs from two molecules with unique labeling patterns. Unlabeled peptide 1 H 1 H 13 C Labeled protein Only NOEs at the interface Transferred NOE: based on: 1) faster build-up of NOEs in large versus small molecules; 2) signal of free state when in excess and exchanging quickly H k on k off H H H Only NOEs from bound state
Identifiera NOEer: Manuellt för varje topp: arbetskrävande och ofta inte objektivt, svårt att utvärdera alla möjligheter Iterativt under strukturberäkningen: flera algoritmer används fn t ex ARIA, Autostructure, även CYANA har protokoll för detta Back calculation: beräkna NOESY-spektrumet efter strukturberäkningen är klar och jämför med experimentella spektrumet som kvalitetskontroll
Experimentella NMR-observabler som kan ge strukturinformation Avstånds-constraints från NOEer Backbone och sidokedjors dihedervinkelconstraints från skalära kopplingar Vätebindnings-constraints Backbone dihedervinklar från kemiska shift (Chemical Shift Index- CSI) Riktningsconstraints från residual dipolar couplings (RDCs)
Dihedervinklar från skalära kopplingar 6 Hz multipla lösningar för vissa kopplingskonstanter Men få strukturer upptar hög-energi konformationer
Det kemiska shiftet beror av sekundärstrukturen. 1 H α Alfa-helix Beta-sheet Wishart & Sykes, JMB 1991
13 C-shiftet är också användbart! 13 C carbonyl 13 C α
Två ofta använda algoritmer: TALOS Ger en kvantitativ prediktion av backbonedihedervinklarna phi och psi inklusive felmarginal genom att jämföra med en proteindatabas CSI Ger en binär karakterisering av helix resp b-sheet (finns, finns inte)
Experimentella NMR-observabler som kan ge strukturinformation Avstånds-constraints från NOEer Backbone och sidokedjors dihedervinkelconstraints från skalära kopplingar Vätebindnings-constraints Backbone dihedervinklar från kemiska shift (Chemical Shift Index- CSI) Riktningsconstraints från residual dipolar couplings (RDCs)
Vätebindningar C=O H-N Höga NH-shift (kan gömmas under andra struktureffekter) Långsamt utbyte av NH med lösningsmedel (t ex D 2 O) karakteristiskt NOE-mönster (helix, sheet) (skalära kopplingar över vätebindningen) när H-bindningspartners är kända en serie avstånds/vinkel-constraints kan användas som är förknippade med standard H-bindningsgeometrier
NH-utbyte i karboanhydras
Utbytesexperiment följt med HSQC H 2 O D 2 O efter 40 min
NMR Structure Calculations Vi vill bestämma alla strukturer som är konsistenta med våra experimentella data. Molekyldynamiksimuleringar använder information om atomära bindningar, vinklar och avstånd Vi kan bara få information om en del av detta experimentellt, resten måste vi gissa eller härleda från känd kemisk kunskap NMR-data är inte perfekta: Signal/brus Endast avstånd < 5Å med NOEs Inkompletta dataset => conformational ensemble
Kan vi sätta igång nu? Ja! Avstånds-constraints från NOEer Backbone och sidokedjors dihedervinkelconstraints från skalära kopplingar Vätebindnings-constraints Backbone dihedervinklar från kemiska shift (Chemical Shift Index- CSI) Riktningsconstraints från residual dipolar couplings (RDCs) Kemiska shift som sådana (Rosetta)
Strukturbestämning med NMR
IR24 ER14 FGF-2 JR19 OP3 IL13 AutoStructure (Janet Huang, R. Tejero, G. Montelione et al) WR33 WR41 ZR18 ER115 WR64 MMP-1 N-TmZip Z-domain C-TmZip LC8 ZR31 WR90 ER75
Assessing the Quality of NMR Structures Number of experimental constraints Types of experimental constraints RMSD of structural ensemble (subjective!) Violation of constraints- number, magnitude Molecular energies Comparison to known structures: PROCHECK
Malate synthase G (MSG) from E. coli - a monomeric 723-residue protein 1531 NOE, 1101 dihedral angles, 415 residual dipolar coupling, and 300 carbonyl shift restraints. Tugarinov, Choy, Orekov and Kay, PNAS 2005 Är subdomänerna rörliga? Kan vi utvärdera det med NMR?