Institutionen för biokemi och biofysik LAB 11 STUDIER AV TEMPERATUR OCH ph-beroende HOS ENZYMET AMYLAS Basåret 2011 (finns på basårshemsida: www.kemi.su.se, välj basår)
Introduktion Enzymet α-amylas som finns i saliv och bukspott bryter ner stärkelse till maltos, maltotrios och α- dextriner. Dessa produkter är reducerande sockerarter och kan påvisas spektrofotometriskt kvantitativt genom att 3,5-dinitrosalicylat reduceras av aldehydgruppen i sockret och den produkt som bildas absorberar ljus vid 540 nm. 2RCHO + Δ 2RCOOH + Maltos Maltotrios α-dextrin 3,5-dinitrosalicyl syra 3-amino-5-nitrosalicyl syra I laborationen undersöks amylas från saliv med avseende på temperatur- och ph-beroende. Material: Citrat-fosfat-NaCl buffert, ph 7,0 Stärkelselösning (1%) Salicylatreagens Görs av assistenterna Utförande: När man vill göra den här typen av studier är det mycket viktigt att alla rören behandlas lika. I alla rör ska reaktionen pågå i 3 min och därefter stoppas. Tänk på att blanda noga. A Temperaturberoende Amylasaktiviteten undersöks vid ca 4 (is), 21 (rumstemperatur), 30, 40 och 60 C. Det finns vattenbad för de tre sistnämnda temperaturerna. Läs av den faktiska temperaturen i de olika vattenbaden. Använd den stärkelselösning som står i vattenbaden. Låt först röret värmas upp ca 3 min innan reaktionen startas. Obs! Röret ska stå kvar i vattenbadet under reaktionstiden! a. Salivlösning: 0,5 ml saliv + 10 ml citrat-fosfat-nacl buffert, ph 7,0. Blanda noga. Gör i ordning 6 rör med 0,75 ml citrat-fosfat-nacl buffert, ph 7,0, och 0.1 ml salivlösning. Märk rören. b. Värm rören i respektive vattenbad; ca 3 min.
c. Starta reaktionen genom att tillsätta 0,5 ml stärkelse. Blanda noga. Låt reaktionen pågå i 3 min. (exakt). d. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 1 ml salicylatreagens. e. Som blank/nollprov blandas 0,75 ml citrat-fosfat-nacl buffert, ph 7,0, 0.1 ml salivlösning och 1 ml salicylatreagens (OBS! Ingen stärkelselösning ännu!). Blanda. Tillsätt 0,5 ml stärkelselösning. f. Koka alla rören 5 min på vattenbad. Det är viktigt att vattnet kokar så att reaktionen drivs. g. Späd alla rören med 10 ml vatten. Blanda ordentligt. h. Mät absorbansen vid 540 nm. Nollställ först med blanken/nollprovet och läs sedan av provernas absorbans. i. Diska glas etc. B. ph-beroende Lösningar: Använd buffertar med ph 3.0, 5.6, 7.0, 8.6 och 10.6, som gjorts av assistenterna. a. Salivlösning: 0,5 ml saliv + 10 ml citrat-fosfat-nacl buffert, ph 7,0. Blanda noga. Blanda 0,75 ml buffert och 0.1 ml salivlösning för varje ph. Värm rören ca 3 min i 30 C vattenbad b. Starta reaktionen genom att sätta till 0,5 ml stärkelselösning. Blanda noga. Låt reaktionen pågå 3 min. c. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 1 ml salicylatreagens. d. Som blank/nollprov blandas 0,75 ml citrat-fosfat-nacl buffert, ph 7,0, 0.1 ml salivlösning och 1 ml salicylatreagens. Blanda. Tillsätt 0,5 ml stärkelselösning. e. Koka alla rören 5 min på vattenbad. Det är viktigt att vattnet kokar så att reaktionen drivs. f. Späd alla rören med 10 ml vatten. Blanda ordentligt. g. Mät absorbansen vid 540 nm. Nollställ med blanken/nollprovet och läs av provernas absorbans. h. Diska glas etc.
Redovisning: En rapport ska skrivas per grupp. Alla deltagarnas namn ska finnas med på rapporten. Rapporten ska skrivas på dator och ska innehålla: syfte/uppgift, kortfattad teori, resultat och slutsatser. Nedanstående ska också finnas med. Försök A. Försök B. Tabell över temperatur och motsvarande absorbans. -Diagram över samband mellan absorbans (y-axel)och temperatur (x-axel). -Förklaring till reaktionens temperatur-beroende: vad händer vid låga respektive höga temperaturer? - Tabell över ph och motsvarande absorbans. - Diagram över samband mellan absorbans (y-axel) och ph (x-axel). - Förklaring till reaktionens ph-beroende: vad händer vid låga respektive höga ph? Rapporten ska lämnas in till assistenterna senast en vecka efter laborationstillfället. Ni kan även e-maila den.