EN KLINISK STUDIE AV ANALYSEN CSV- SPEKTROFOTOMETRI

EN KLINISK STUDIE AV ANALYSEN CSV- SPEKTROFOTOMETRI EN JÄMFÖRELSE AV GLAS- OCH PLASTKYETTER FÖR SPEKTROFOTOMETRISK MÄTNING AV BILIRUBIN OCH DEOXIHEMOGLOBIN I CEREBROSPINALVÄTSKA JONATAN CARLANDER Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap Malmö högskola 15 hp Hälsa och samhälle Biomedicinska analytikerprogrammet 205 06 Malmö Institutionen för biomedicinsk vetenskap 2016

EN KLINISK STUDIE AV ANALYSEN CSV- SPEKTROFOTOMETRI EN JÄMFÖRELSE AV GLAS- OCH PLASTKYETTER FÖR SPEKTROFOTOMETRISK MÄTNING AV BILIRUBIN OCH DEOXIHEMOGLOBIN I CEREBROSPINALVÄTSKA JONATAN CARLANDER Carlander, J. En klinisk studie av CSV-spektrofotometri. Materialjämförelse mellan olika kyvetter samt en hållbarhetsstudie för cerebrospinalprover. Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng. Malmö högskola: Fakulteten för hälsa och samhälle, institutionen för biomedicinsk vetenskap, 2016. En subaraknoidalblödning (SAB) orsakas av ruptuerade aneurysmer mellan den mjuka hjärnhinnan och spindelvävshinnan (arachnoidea). Symptomen för SAB är allvarlig spontan huvudvärk, stelhet i nacken, kräkningar, förvirring och svimning. Vid erhållna symptom görs en datortomografi (CT) av hjärnan för påvisning av blod i subaraknoidalrummet. I 98 % av fallen påvisar CT blod om undersökning görs inom 12 timmar från uppvisat symtom. Sannolikheten att påvisa blod med CT minskar dock med tiden. Efter en vecka kan blod påvisas i drygt 50 % av fallen. Vid symptom för en SAB men där CT inte påvisar blod görs en lumbalpunktion för analys av cerebrospinalvätska (CSV). Provtagning bör ske minst 12 timmar efter uppvisat symptom för bilirubin ska ha hunnit bildats från oxihemoglobin via enzymatiska reaktioner. Spektrofotometri används vid 415 nm för detektion av oxihemoglobin och vid 476 nm för detektion av bilirubin. Denna studie kommer undersöka huruvida det finns någon skillnad i uppmätt absorbans vid 415 nm respektive 476 nm mellan glas- och plastkyvetter samt undersöka hur ett dygns extra förvaring av CSV-prover påverkar absorbansen vid 476 nm. Resultatet för 20 CSV-prover visade på att det inte fanns någon statistiskt signifikant skillnad mellan glas- och plastkyvetter (p=0,825 för 476 nm, p=0,632 för 415 nm) samt att absorbansen för 9 CSV-prover signifikant förändrades vid 476 nm efter ett dygns extra förvaring (p=0,01). Nyckelord: Bilirubin, Cerebrospinalvätska, Kyvett, Spektrofotometri, Subaraknoidalblödning. 1

A CLINICAL STUDY OF THE ANALYSIS CSF- SPECTROPHOTOMETRY A COMPARISION BETWEEN GLASS AND PLASTIC CUVETTES FOR SPECTROPHOTOMETRIC MESURMENT OF BILIRUBIN AND DEOXYHEMOGLOBIN IN CEREBRALSPINAL FLUID JONATAN CARLANDER Carlander, J. A clinical study of CSF-spectrophotometry. Material comparison between different cuvettes and a durability analysis of cerebrospinal samples. Degree project in biomedical science 15 credits. Malmö University: Faculty of health and society, Department of biomedical science, 2016. A subarachnoid haemorrhage (SAH) is caused by ruptured aneurysms between the soft meninges and arachnoid (arachnoid). Symptoms of an SAH is severe spontaneous headaches, stiff neck, vomiting, confusion and fainting. A computed tomography (CT) of the brain is used, on patients sustaining symptoms, to detect blood in the subarachnoid space. CT detects blood in 98% of the cases if examination is made within 12 hours from the shown symptoms. However, the probability of detecting blood with CT decreases with time. After a week, only 50 % of the CT-scans identifies blood. If patients suffers from typical symptoms but no detection of blood using CT-scan, a lumbar puncture is performed to analyse the cerebrospinal fluid (CSF). Sampling should be made at least 12 hours after presented symptoms because of the time-dependent creation of bilirubin from oxyhemoglobin via enzymatic reactions. Spectrophotometry is used in the wavelengths 415 nm for the detection of oxyhemoglobin and at 476 nm for detection of bilirubin. This study will examine whether there is any difference in the absorbance measured at 415 nm and 476 nm between glass-and plastic cuvettes as well as examine how 24 hours of extra storage of samples affect the absorbance at 476 nm. The result for 20 CSF-samples showed that there was no statistically significant difference between the glass and plastic cuvettes (p = 0,825 of 476 nm, p = 0,632 for 415 nm), and absorbance for 9 CSF-samples significantly changed at 476 nm after 24 hours of extra storage (p = 0.01). Keywords: Bilirubin, Cerebrospinal fluid, Cuvettes, Spectrophotometry Subarachnoid Haemorrhage. 2

INNEHÅLLSFÖRTECKNING INTRODUKTION... 4 Cerebrospinalvätska (CSV)... 4 Subaraknoidalblödning (SAB)... 4 Bilirubin... 5 Cellräkning av Erytrocyter i CSV... 5 Spektrofotometrisk analys av CSV... 5 Syfte... 6 MATERIAL OCH METOD... 6 Urval och provhantering... 6 Etisk bedömning... 7 Spektrofotometrisk analys... 7 Bearbetning av data... 7 RESULTAT... 7 Jämförelse mellan glas- och plastkyvetter... 8 Hållbarhetsstudie... 9 DISKUSSION... 9 Metoddiskussion... 9 Resultatdiskussion... 10 KONKLUSION... 11 REFERENSER... 13 3

INTRODUKTION Cerebrospinalvätska (CSV) I hjärnans ventriklar, kraniala- och subaraknoidala områden finns cerebrospinalvätska, likvor, som omsluter hjärnan och ryggmärgen (Figur 1). Vätskan, som är klar och färglös, bildas huvudsakligen av organet plexus choroideus i hjärnans laterala ventriklar [1]. Figur 1: Anatomisk bild över hjärnan och det subaraknoidala området samt plexus choroideus [2]. En mindre mängd CSV secerneras från ventriklarnas ependymala ytor, interstitialvätskan, kärlnystan och hjärnparenkymet, i vilken det sker en filtration av plasman likt den filtration som sker i glomeruli i njurarna. CSVs huvuduppgifter är att agera som stötdämpare och skydd för hjärnan och ryggmärgen samt eliminera restprodukter från hjärnans metabolism, t. ex koldioxid och laktat. CSV har även en essentiell roll i homeostasen av cerebral interstitialvätska genom att reglera elektrolytbalansen, transportera runt aktiva molekyler och eliminera kataboliter [1, 3-4]. Subaraknoidalblödning (SAB) Vid en subaraknoidalblödning är orsaken ruptuerade artärbråck (aneurysmer) mellan den mjuka hjärnhinnan och spindelvävshinnan (arachnoidea). Enligt definitionen är subaraknoidalblödning en hjärnblödning (hemoragi eller hematom), vilket kan ge strokeliknande symptom [5]. Ett av tjugo strokefall beror på blödning till subaraknoidalrummet. SAB är en skada som har liknande följder som en hjärninfarkt, som orsakas intracerebral blödning eller emboli [6]. Blödningen kan inträffa i olika åldrar, med en dödlig utgång i 30-70 % av fallen. De typiska symtomen brukar vara allvarlig huvudvärk som uppkommer plötsligt, stelhet i nacken, kräkningar, förvirring och förlust av medvetande. Riskfaktorer för SAB är hypertoni, rökning och alkoholkonsumtion. Dessa faktorer kan dubbla risken för en SAB. I två av tre fall föreligger riskfaktorerna som en del av patientens anamnes medan genetiska faktorer enbart förklarar ett av tio fall [7-8]. Patienter som inkommer med symptom genomgår en skiktröntgen av hjärnan datortomografi (CT), för påvisning av blod i subaraknoidalrummet. I 98 % av fallen där patienter haft en subaraknoidalblödning påvisar en CT blod om undersökningen görs inom 12 timmar från det att patienten uppvisat symptom [9]. Dock minskar sannolikheten att påvisa blod med tiden och efter drygt en veckas tid är det enbart 50 % av fallen där påvisning av blod kan ske. För de patienter som erhåller symptom i vad som skulle kunna vara en subaraknoidalblödning men 4

att CT visar negativt resultat tas en lumbalpunktion för analys av CSV. Vid lumbalpunktion förs en nål in mellan spinalutskotten L4/L5 eller L3/L4. Ibland kan en stickblödning förekomma vid provtagning, vilket betyder att det uppstått en kärlskada orsakad av nålen. Spektrofotometrisk analys av CSV ingår som rutinanalys vid utredning av SAB eftersom den kan ge värdefull information för att skilja blod i CSV-provet från stickblödning från provtagningen eller från en SAB. Om CSV-provet centrifugeras inom 30 min från provtagningen och supernatanten avskiljs elimineras förekomsten av hemoglobin från en stickblödning, eftersom erytocyterna då inte har hunnit att hemolyseras [1, 3-8]. Bilirubin Provtagning bör ske tidigast 12 timmar efter att patient uppvisat karaktäristiska symptom. Efter 6-12 timmar bildas bilirubin av oxihemoglobin. Oxihemoglobin bryts ned via enzymatiska reaktioner via makrofager till bilirubin. Vid SAB ses således en ökning av bilirubin i CSV. Vid stickblödning ses dock ingen ökning av bilirubin eftersom nedbrytningen av hemoglobin endast sker in vivo. Därför är det viktigt att provtagningen inte sker tidigare än 12 timmar efter att patienten uppvisat karakteristika symtom för en SAB. CSV kan efter provtagning inspekteras visuellt för en karaktäristisk gul-orange färg (xantochromia = grekiska för gul färg). Visuell analys anses dock vara mindre känslig metod än spektrofotometrisk analys [9-10]. Ökad bilirubinkoncentration i CSV kan även detekteras vid i blodet vid skada på blodhjärnbarriären då det föreligger ökad bilirubinkoncentration i blodet [9-11, 13]. Cellräkning av Erytrocyter i CSV Erytrocyter finns normalt inte närvarande i CSV. Förekomst av erytrocyter kan bero på intrakraniell blödning, vanligen subaraknoidalblödning. Cellräkning av erytrocyter i CSV är en del i utredningen av SAB, men kan inte enbart användas som ett underlag för att bekräfta eller utesluta SAB. I en studie av Perry et al [12] beskrivs det att kärlskador inträffar i 10-30% av lumbalpunktioner. Studien tar även upp en alternativ metod för utredning av SAB genom att via cellräkning av erytrocyter kunna utesluta SAB om antalet erytrocyter är mindre än 2000*10 6 /L och ingen xantochromi är närvarande i CSV [9-10, 12]. Spektrofotometrisk analys av CSV Vid den spektrofotometriska analysen mäts CSVs absorption av ljus vid våglängder mellan 350-600 nm. Oxihemoglobin har en absorptionstopp vid 415 nm och bilirubin har en absorptionstopp vid 455 nm. Enligt reviderade brittiska riktlinjer [11] mäts bilirubin dock vid 476 nm istället för 455 nm för att minska eventuellt bidrag från oxihemoglobin. Enligt riktlinjerna som Region Skåne följer används Chalmers metod [11] där en baslinje ritas mellan två punkter på kurvan i våglängdsområdet 350-600 nm. Den första punkten är lokaliserad mellan 350-400 nm, beroende på vilket område som erhåller lägst absorbans. Punkt två är lokaliserad mellan 430-530 nm på samma premisser som punkt ett. Vid våglängderna 415 nm respektive 476 nm räknas nettoabsorbansen ut genom att baslinjen subtraheras från bruttoabsorbansen för 415 nm respektive 476 nm (se figur 2). Absorbansen beräknad vid 415 nm kallas Net oxyhaemoglobin absorbance, NOA. Absorbansen vid 476 nm kallas Net bilirubin absorbance, NBA, [10-11, 13]. 5

Figur 2: Spektrofotometrisk analys av CSV i området 350-600 nm. Net oxyhaemoglobin absorbance (NOA) och Net bilirubin absorbance (NBA) mäts i absorbans (A) vid 415 nm respektive 476 nm. Hemoglobin (Hb) detekteras vid 415 nm [14]. Det är främst närvaron av bilirubin som är intressant för att skilja en SAB från stickblödning. Stickblödning kan vid absorbansmätning ge en topp vid 415 nm men ingen topp kan detekteras vid 476 nm. CSV-prover som tas vid misstänkt SAB skall alltid ljusskyddas, helst skall folie lindas runt om provröret. Detta på grund av att bilirubin är ljuskänsligt mot UV-strålarna i vanligt dagsljus som kan bryta ned bilirubinet och orsaka falskt negativa resultat [10-11, 13]. Anledningen till att plast jämfördes mot glas var för att glaskyvetten är rekommenderad att använda. Plastkyvetten är däremot lättare att använda, tidsmässigt sparar den tid då det inte sker någon tvätt mellan analyser den och risken för carry over-effekter minskar, vilket är när en volym från ett tidigare CSV-prov är kvar i glaskyvetten på grund av otillräcklig tvätt. Detta kan ge störningar av absorbansnivåer vid mätning av andra CSV-prover. Syfte Syftet med undersökningen är att avgöra huruvida det finns någon signifikant skillnad i uppmätta absorbansenheter (AU), vid våglängderna 415 nm respektive 476 nm, beroende på om användandet av glas- eller plastkyvetter samt att avgöra huruvida ett extra dygns förvaring av CSV påverkar absorbansen vid 476 nm. MATERIAL OCH METOD I denna studie undersöktes huruvida det fanns skillnader i uppmätt absorbans, AU, beroende på kyvettmaterialet samt vilken inverkan ett extra dygns förvaring av CSV-prover har på absorbansen vid 476 nm. Urval och provhantering Provmaterialet bestod av 29 st CSV-prover som samlats, oberoende av patientens anamnes eller kön, kontinuerligt under vecka 5-7 2016 på Klinisk kemi, Skånes universitetssjukhus Lund. CSV-provernas provtagningstid lagrades i ett datorsystem som Klinisk Kemi Lund använder. Genom att utnyttja provrörets unika kombinationskod kunde provtagningstiden erhållas. Enbart provtagningstid och CSV-provets autentiska kombinationskod sparades. Inga personuppgifter behandlades i studien. 6

Urvalet av prover bestämdes efter hur stort utbud det fanns av färska prover samt om de erhöll en volym som översteg 800 μl, då minsta provvolym var 800 μl. CSV-proverna erhölls centrifugerade. Provmaterialet delades in i två grupper. En grupp med 20 CSV-prover som användes i jämförelsen mellan glas- och plastkyvetter och en grupp med 9 prover som utnyttjades i hållbarhetsstudien. I jämförelsen mellan plast- och glaskyvetter inkluderades alla prov som hade en uppmätt absorbans vid 415 nm på som mest 100 mau då detta bedömdes vara kliniskt relevant nivå. Resterande prover inkluderades i hållbarhetsstudien. Etisk bedömning CSV-prover samlats oberoende av patients anamnes, kön eller ålder samt att inga personuppgifter sparades eller utnyttjades i undersökningen. Spektrofotometrisk analys Absorbansmätningarna utfördes i våglängdsområdet 350-600 nm med spektrofotometern Aglient Cary 60 (Aglient Technologies, USA)CSV-Proverna togs ut ur dess ljusskyddade behållare, som stått förvarad i kyl. Alla 20 CSV-proverna analyserades först i glaskyvett (Hellma, Tyskland) och därefter i plastkyvett (Sarstedt, Tyskland). Som blank användes NaCl, med en koncentration 9 mg/ml (Fresenius Kabi, Norge). Vid absorbansmätning i glaskyvett användes samma kyvett för alla mätningar, kyvetten tvättades med ddh2o mellan varje mätning. Efter att alla prover analyserats en gång i glaskyvett genomgick de samma analysprincip fast i plastkyvett där varje prov analyserades i separat plastkyvett. För de 9 prover som skulle genomgå en hållbarhetsanalys sparades de uppmätta absorbansvärdena efter mätning i plastkyvett som tidpunkt t1. Därefter fortsatte hållbarhetsanalysen då de 9 CSV-proverna analyserades i plastkyvett, efter blankning, 24±2 timmar efter analys vid tidpunkten t1. Uppmätt absorbans sparades som tidpunkt t2. Bearbetning av data Rådata från analysmomentet bearbetades i Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA). Boxplot (låddiagram där median, kvartiler och outliers visas)- och Bland-Altman diagram (B & A-diagram, där differens plottas mot medelvärde för att ta reda på mätfelet (bias) och påvisa trender mellan olika variabler) gjordes i SPSS Statistics version 22 (IBM Corporation, New York, USA). De olika gruppernas absorbansspridning redovisades i form av Boxplot-diagram, en plot för plastkyvetter och en för glaskyvetter. En del av jämförelsestudien mellan plast- och glaskyvetter för respektive grupp visas med B & A-diagram diagram för att åskådliggöra eventuella differenser mellan metoderna. Slutligen gjordes ett statistiskt One sample t-test för jämförelse av medelvärden vid respektive våglängd. Även i hållbarhetsstudien presenteras resultatet i B & A-diagram samt efterföljande t-test. RESULTAT Resultatet för undersökningen presenteras nedan i en jämförelse mellan glas- och plastkyvetter vid 476 nm respektive 415 nm samt hållbarhetsstudien vid 476 nm. 7

Jämförelse mellan glas- och plastkyvetter Resultatet grundar sig på 20 CSV-prover som analyserats med spektrofotometrisk analys. Resultatet presenteras i en visualisering av provernas olika absorbansspridning, i form av Boxplot-diagram samt B & A-diagram, vid 415 nm respektive 476 nm. Dessutom presenteras ett statistiskt t-test för medelabsorbansdata vid 415 nm respektive 476 nm. 3A 3B Figur 3: A: Uppmätt absorbans i absorbansenheter (AU) vid 476 nm för glas- respektive plastkyvett (N=20) Cirklarna utanför visar s.k. outliers. B: B & A-diagram diagram där differensen plast-glas plottas mot medelvärdet plast och glas. Den röda linjen representerar y-värdet 0. Medelabsorbansen vid 476 nm (se figur 3A) var vid mätning med plastkyvett något högre än vid mätning med glaskyvett (0,0077 AU respektive 0,0075 AU) men skillnaden var inte statistisk signifikant vid t-test (medeldifferens 0,00023 AU (se figur 3B), p=0,825). 4A 4B Figur 4: A: Uppmätt absorbans i absorbansenheter (AU) vid 415 nm för glas- respektive plastkyvett (N=20). Cirklarna utanför visar s.k. outliers. B: B & A-diagram där differensen mellan plast och glas plottas mot medelvärdet för plast och glas. Den röda linjen representerar y-värdet 0. Medelabsorbansen vid 415 nm (se figur 4A) var vid mätning med plastkyvetten något högre än vid mätning med glaskyvett (0,0150 AU respektive 0,0145 AU) men skillnaden var inte statistiskt signifikant vid t-test (medeldifferensen 0,00051 AU (se figur 4B), p=0,632). 8

Hållbarhetsstudie Hållbarhetsstudien presenteras i ett B & A-diagram och ett statistiskt t-test av medelabsorbansen vid 476 nm beräknas sedan. Figur 5: Hållbarhetsstudien presenterad i form av ett B & A-diagram (N=9), där differensen är uträknad genom absorbansvärden vid tidpunkten t2 absorbansvärden vid tidpunkten t1. Absorbansvärdena uppmättes vid 476 nm. Skillnaden mellan t1 och t2 är att t2 är analyserade 24±2 timmar efter t1. Samtliga prover är analyserade i plastkyvett. Medelabsorbansen vid 476 nm var vid tidpunkten t2 högre än vid tidpunkten t1 (0,336 AU respektive 0,328 AU). Skillnaden var statistiskt signifikant vid t-test (medeldifferensen = 0,0079 AU (se figur 5), p<0,05). DISKUSSION Diskussionen delas in i en separat metoddiskussion där arbetssättet och handhavandet av CSV-prover utvärderas samt en resultatdiskussion bestående av en del för jämförelsen mellan glas- och plastkyvetter samt en del tillhörande hållbarhetsstudien. Metoddiskussion Proverna analyserades i två olika analysflöden, i serie och separat. Analysflödet i serie inleddes med att ett blankprov analyserades i glaskyvett och en påföljande tvättning av kyvetten i ddh2o. Efter tvättningen kördes första provet och därefter tvättades kyvetten igen innan analys av nästa prov. Flödet byggde på tanken att exempelvis 5 prover skulle körts i ordning först i en glaskyvett och sedan analyserats i plastkyvett. Tanken var att det inte skulle vara för stora tidsintervall mellan de olika analyserna. Provrören innehållande CSV stod ljusskyddat i en behållare och togs ut när de skulle köras. Eventuell störning av omgivningens ljus skulle ha varit då CSV-prov befann sig i kyvetten stående på bänken innan analys, vilket inte borde varit mer än någon minut innan det pipetterades ner i dess provrör igen. Endast ett fåtal prover analyserades via ett separat analysflöde. Det separata analysflödet var tillskillnad från analys i serie en metod där varje prov först genomgick analys i glaskyvett, efter blankning och tvätt av kyvett, och sedan blankning samt analys i plastkyvett. Tyvärr fanns det inte tillräckligt med underlag för en jämförelse mellan de två arbetsflödena för att se en eventuell signifikant skillnad. Under praktiska utförandet upptäcktes det att 800 μl var den minsta volym som behövdes i kyvetten för att spektrofotometern skulle kunna analysera provet tillförlitligt. Detta bestämdes genom att köra en känd kontroll vid olika volymer för att se vilken volym som gav utslag. En annan sak som upptäcktes var att 9

instrumentet Agilent Cary 60 inte mäter linjärt vid absorbanser som överstiger ca 2300 mabs, vilket gör att överstigna värden inte är pålitliga då de inte är linjärt mätta. Resultatdiskussion Figur 3A visar distributionen för de 20 olika provernas absorbansvärde vid 476 nm. Medelabsorbansen för glas var 7,5 mau och för plast 7,7 mau (median 7,6 mau resp. 5,7 mau). Skillnaden i medelabsorbans (bias) var inte statistisk signifikant (p=0,825) vilket betyder att slutsatsen inte kan vara att analys med en plastkyvett generellt ger högre absorbansvärden än analys med glaskyvett. Hade statistisk signifikans uppnåtts hade en skillnad på bråkdelar av en milliabsorbansenhet ändå inte tolkats som kliniskt relevant. Spridningen av värden för glas- respektive plastkyvetter är relativt lik. I figur 4A syns det att absorbansvärdena har en liknande distribution. Medelabsorbansen för glas var 14,5 mau och för plast 15,0 mau (median 12,7 mau resp. 11,8 mau). Det kunde inte heller påvisas någon signifikant skillnad i medelabsorbans vid 415 nm. Trots uppmätta minimala skillnader mellan glas- och plastkyvetter blir slutsatsen ändå att absorbansmätning vid 415 nm respektive 476 nm är oberoende av kyvettmaterialet. För jämförelsen mellan glas- och plastkyvetter plottades två olika variabler mot varandra, den ena var differensen mellan glas- och plastkyvetter mot respektive provs medelvärde. Absorbansdifferensen mellan glas- och plastkyvetter för de 20 proverna vid 476 nm respektive 415 nm beräknades genom att subtrahera respektive provs absorbansdata för plast med respektive provs absorbansdata för glas, då glaskyvetten är referensmaterialet. Differensen sattes mot medelvärdet för respektive provs absorbansdata för glas- och plastkyvetten i ett B & A-diagram [15]. Som ett resultat av den uträknade differensen plottad mot medelvärdet är den första tolkningen av B & A-diagrammet hur stort bias, mätfelet, är. Anledningen till att bias bestäms är på grund av att alla variabler indikerar alltid ett visst fel vid mätningar. Bias, som är detsamma som medeldifferensen, för B & A-diagrammet vid 476 nm var 0,2 mau. Vid 415 nm låg bias på 0,5 mau. Bias tolkas i respektive fall som kliniskt accepterat mätfel. Bedömningen av huruvida något är klinisk accepterat eller inte bestäms av någon som är medicinskt ansvarig. Även om medeldifferensen mellan glas-respektive plastkyvetter är låg finns det enskilda prover som uppvisat differenser som ligger runt 10 mau, både vid 415 nm och 476 nm. Anledningen till detta tycks inte vara systematiskt relaterad till kyvettmaterialet, utan är snarare slumpmässiga resultat (imprecision). Vad gäller variationen i respektive diagram tycks det inte vara någon trend, differensen tycks varken öka eller minska vid högre nivå utan sprids oberoende av nivå. Det fanns inga signifikanta skillnader mellan glas- och plastkyvetter vid absorbansmätning av bilirubin (vid 476 nm) och oxihemoglobin (vid 415 nm) i CSV. Detta eftersom p värdet var större än 0,05, vilket gjorde att nollhypotesen inte kunde förkastas. Nollhypotesen formulerades till att ingen skillnad i medelabsorbans mellan glas- och plastkyvetter skulle föreligga. Vad som skall finnas i åtanke är att p-värdet för 476 nm respektive 415 nm (0,825 respektive 0,632) var långt över 0,05, vilket innebär att risken är väldigt stor för fel om vid påstående om att det finns en skillnad mellan glas- och plastkyvetter. Det ideala 10

hade varit ett p-värde som i respektive fall närmat sig 0,05 för att kunna erhålla en stor statistisk säkerhet. Följaktligen hade en eventuell spekulering kunnat göras om hur spridningen av uppmätt absorbans sett ut ifall urvalet av prover varit större. I studien användes som sagt 20 CSV-prover men hade urvalet istället legat på 100 eller 500 CSVprover hade det vid beräknat statistiskt t-test kunnat vara möjligt uppnå statistisk signifikans. De 9 prover som testades i hållbarhetsanalysen vid 476 nm presenterades i B & A- diagram där medeldifferensen, bias, var 7,9 mau. Differensen beräknades mellan tidpunkten t2 och tidpunkten t1 och plottades mot medelvärdet beräknat för respektive prov vid tidpunkt t2 och t1. Differensen tycks öka ju högre medelvärdet (nivån) är. T-test visade på att en signifikant differens (p=0,01) mellan tidpunkterna t2 och t1 fanns. Nollhypotesen formulerades till att det inte skulle vara någon statistisk skillnad för uppmätt absorbans mellan tidpunkt t1 och t2. Det som dock var oväntat i sammanhanget var att 8 av 9 prover ökade i absorbans vid tidpunkten t2, vilket var ca 24 timmar efter tidpunkten t1. Den statistiska skillnaden visade alltså att prover analyserade vid tidpunkt t2 erhöll högre absorbans än vid tidpunkt t1 (p=0,01). Analys av bilirubin i CSV är tidsberoende på grund av att bilirubin bryts ned över tiden, även ljusskyddat. Förklaring till varför istället bilirubinabsorbansen vid 476 nm ökade kunde lättare ha förklarats om fler mätningar gjorts mellan tidpunkterna t1 och t2, även förlängt observationstiden och introducerat en ny tidpunkt för att se den eventuella utvecklingen [16]. Slutligen inför framtida studier kan en idé vara att utföra flera mätningar av ett CSV-prov flera gånger i respektive kyvett. Detta för att se hur pass stor spridningen på absorbansdatan blir. Eventuellt kan ett medelvärde beräknas som sedan jämförs i liknande diagram som presenterats ovan. För att säkerställa att det laborativa utförandet går korrekt till kan man eventuellt använda sig av kontroller med känd koncentration. Eftersom mätningarna utförs vid olika tidpunkter finns möjligheten att ha kontroller för respektive mätning. Jämförelsen mellan plastoch glaskyvetter hade kunnat byggas på genom att jämföra värdena för NOA och NBA för respektive kyvett för att finna möjlig signifikant skillnad där. För hållbarhetsanalysen kan det vara lämpligt att erhålla fler mätningar för att kunna göra ett eventuellt diagram där absorbansen är på y-axeln och tiden på x-axeln. Det hade även varit intressant att utföra en hållbarhetsstudie på fler våglängder, t.ex. 455 nm. KONKLUSION Konklusionen kan initieras med att redogöra att ingen signifikant skillnad, baserat på det resultat som erhölls, finns mellan användandet av glas- och plastkyvetter vid utförandet av analysen CSV-spektrofotometri. Det är dock rekommenderat att göra vidare studier med större urval av prover för att erhålla en större statistisk säkerhet. Glaskyvetten är ett gold-standard alternativ, ekonomisk och mer positiv ur miljösynvinkel, dock är det någorlunda tidskrävande att konstant behöva rengöra kyvetten efter respektive körning. Plastkyvetten har fördelen att den enbart är en 11

engångskyvett, vilket gör att analysprocessen blir mindre kostsamt ur en tidssynpunkt. Valet mellan glas och plast är troligtvis ett subjektivt val. För hållbarhetsstudien behövs det ytterligare undersökningar, med större urval av CSV-prover och fler analystidpunkter. Enligt undersökningen så fanns det en signifikant ökning (p=0,01) av bilirubin efter 24 timmars förvaring av CSV ljusskyddat i kyl. Dock, stämmer inte resultatet med teorin, då bilirubin bör minska över tiden. 12

REFERENSER 1. Blennow K, Zetterberg H (2012) Sjukdomar i centrala nervsystemet. I: Nilsson-Ehle P, Berggren Söderlund M, Theodorsson E (Red) Laurells Klinisk kemi i praktisk medicin (9:e upplagan) Lund: Studentlitteratur, s 555-560 2. Dr. Mohamed Baranek (2012) Brain ventricular system >http://abcradiology.blogspot.se/2012/01/brain-ventricular-system.html< (160316) 3. L Sakka, G Coll, J Chazal. Anatomie et physiologie du liquid cerebrospinal. Annales françaises d Oto-rhino-laryngologie et de Pathologie Cervico-faciale. 2011;128(6):359-66 4. Van Gijn J, Rinkel GJ E, Kerr S R. Subarachnoid haemorrhage. Lancet 2007; 369: 306-18. 5. Veronica Murray (2012) Stroke: en skrift om slaganfall och TIA >https://www.hjart-lungfonden.se/sjukdomar/hjartsjukdomar/stroke/< (160316) 6. Johnston SC, Selvin S, Gress DR. The burden, trends, and demographics of mortality from subarachnoid haemorrhage. Neurology 1998; 50: 1413-18 7. Feigin VL, Rinkel GJE, Lawes CM, Algra A, Bennett D, Van Gijn J, Anderson C S. Risk factors for subarachnoid hemorrhage: an updated systematic review of epidemiological studies. Stroke 2005; 36:2773-80 8. Ruigrok YM, Buskens E, Rinkel GJ E. Attributable risk of common and rare determinants of subarachnoid hemorrhage. Stroke 2001; 32: 1173-75 9. Nagy K, Skagervik I, Tumani H, Brettschnneider J, Otto M, Petzold A, Wick M, Kühn H-J, Uhr M, Regeniter A, Kraus J, Deisenhammer F, Lautner R, Blennow K, Zetterberg H, Mattsson N, Shaw L. Cerebrospinal fluid analyses for the diagnosis of subarachnoid haemorrhage and experience from a Swedish study. What method is preferable when diagnosing a subarachnoid haemorrage? Clin Chem Lab Med 2013; 51(11): 2073-2086. 10. Chalmers AH, Kiley M. Detection of xanthochromia in cerebrospinal fluid. Clin Chem Lab Med 1998;44:1740-2 11. Cruickshank A, Auld P, Beetham R, Burrows G, Egner W, Holbrook I, Keir G, Lewis E, Patel D, Watson I, White P. Revised national guidelines for analysis of cerebrospinal fluid in suspected subarachnoid haemorrhage. Annals of Clinical Biochemistry 2008; 45: 238-244. 12. Perry J J, Alyahya B, Sivilotti LA M, Bullard J M, Émond M, Sutherland J, Worster A, Hohl C, Lee S J, Eisenhauer A M, Paulus M, Lesiuh H, 13

Wells A G, Stiell G I. Differentiation between traumatic tap and aneurysmal subarachnoid hemorrhage: prospective cohort study. BMJ 2015; 350: h568 13. Beetham R. CSF spectrophotometry for bilirubin why and how? The Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation. 2009; 69:1-7 14. Labmedicin Skåne, klinisk kemi (2016). Metodbeskrivning: CSVspektrofotometri >http://www.skane.se/upload/webbplatser/labmedicin/verksamhetsomr %C3%A5den/Klinisk%20kemi/Analyser/Skane/Csv- Spektrofotometri.pdf< (160316) 15. Giavarina D. Understandning Bland Altman analysis. Biochemia Medica 2015;25(2):141-51 16. Foroughi M, Parikh D, Wassell J, Hatfield R. Influence of light and time on bilirubin degradiation in CSF spectrophotometry for subarachnoid haemorrhage. British Journal of Neurosurgery. 2010; 24(4): 401-404 14