Förekomst av psykrotrofa Bacillus cereus i konsumtionsmjölk - en kvalitativ riskvärdering

EN RAPPORT FRÅN SVENSK MJÖLK FORSKNING Rapport nr: 7076-P 2008-10-28 Förekomst av psykrotrofa Bacillus cereus i konsumtionsmjölk - en kvalitativ riskvärdering Anders Christiansson

Förekomst av psykrotrofa Bacillus cereus i konsumtionsmjölk en kvalitativ riskvärdering En bedömning baserad på resultat från EU-projekt QLKT-CT-2001-00854 Anders Christiansson Sammanfattning Bland stammar av B. cereus generellt sett finns en mycket stor spridning i kvantitativ förmåga att producera enterotoxiner och kräkningsframkallande (emetiskt) toxin. Stammar som varit inblandade i matförgiftningar producerar oftast högre halter toxin än stammar från omgivningen eller från livsmedel i generellt. Resultat från projektet visar på att trots att generna för toxinbildning finns hos flertalet stammar så är förekomsten av stammar med hög potential för bildning av diarré-toxin (enterotoxin) låg bland isolat från konsumtionsmjölk jämfört med mesofila stammars förmåga. Inga psykrotrofa mejeriisolat hade genen för det tredje diarrétoxinet (CytK) och ej heller förmåga att bilda kräkningstoxin (emetiskt toxin, cereulid). Psykrotrofa vegetativa bakterier är också känsligare för lågt ph i magsäcken än mesofila, men en viss överlevnad kan ske vid högt ph i samband med konsumtion av mjölk. Laboratoriestudier visar att psykrotrofa B. cereus, jämfört med mesofila stammar, gror ut och tillväxer långsammare, eller inte alls, i simulerad tunntarmsvätska. Vegetativa B. cereus måste fästa på tarmcellerna för att enterotoxinerna ska kunna ge skada. Simulering har gjorts av det komplicerade förloppet i tunntarmen. Resultatet av simuleringarna tyder på att psykrotrofa B. cereus inte hinner tillväxa till kritiska halter efter adhesion till tarmslemhinnan, under den tid som motsvarar inkubationstiden för diarrésjukdom. Sammanfattningsvis tyder resultaten på att förekomst av psykrotrofa B. cereus i konsumtionsmjölk innebär en mycket liten hälsorisk. Med hänsyn till detta föreslås att mejeriernas riktvärden vid bäst före-dagen kan höjas till m= log 4 (10000)/ml (godtagbart med anmärkning) respektive M=log 5 (100000)/ml (otillfredsställande), jämfört med tidigare gällande riktvärden (log 3 respektive log 4/ml). Risken för att bli sjuk av emetiskt toxin i kylförvarad konsumtionsmjölk är mycket liten. Få stammar med förmåga att bilda emetiskt toxin (<1%) har påträffats i mjölkkedjan och inga i kylförvarad k-mjölk. Emetiska stammar tillväxer inte under 10 C och det krävs mycket höga halter för att emetiskt toxin ska bildas. Vid normal kylförvaring finns det ingen risk för tillväxt av emetiska stammar i mjölk och därmed inte heller för förekomst av emetiskt toxin i mjölken. 1

Inledning Bacillus cereus är en matförgiftningsbakterie som varit känd sedan 1950-talet (1). Bakterien kan producera ett flertal olika toxiner som misstänkts ha en roll i sjukdomsfall, men de olika toxinernas inbördes betydelse har inte varit känd. På grund av bristen på kunskap om toxinbildningsförmågan hos olika stammar, samt de olika toxinernas egenskaper och deras roll i livsmedelsburen sjukdom startades EU-projektet QLKT-CT-2001-00854 Preventing Bacillus cereus foodborne poisoning in Europe Detecting hazardous strains, tracing contamination routes and proposing criteria for food. I projektet medverkade Svensk Mjölk Forskning tillsammans med 6 olika universitetsinstitutioner och forskningsinstitut, samt 3 livsmedelsföretag, från Frankrike, Tyskland; Nederländerna, Norge och Finland. Denna rapport sammanfattar resultat från projektet, samt andra forskningsresultat som har relevans för bedömningen av psykrotrofa B. cereus i mjölk. Sammanfattningen har gjorts enligt den modell för mikrobiologisk riskvärdering som Codex Alimentarius förordar (2). Faroidentifiering Bacillus cereus är en välkänd orsak till livsmedelsburen sjukdom, som har förknippats med ett stort antal olika livsmedelstyper (3). Två typer av sjukdomstillstånd orsakas av B. cereus ett med i huvudsak magkramper och vattnig diarré som symptom och ett med kräkningar som viktigaste symptom. Diarrévarianten kännetecknas av en inkubationstid på vanligen 6-12 tim, med symptom som vanligen avklingar inom 12-24 timmar. Kräkningssyndromet inträffar med mycket kort inkubationstid, vanligen 0,5 5 timmar. Även detta tillstånd avklingar inom ett dygn. Den egentliga faran är inte bakterien utan de toxiner som B. cereus producerar och som orsakar sjukdomarna. Diarrén orsakas av ett eller flera enterotoxiner som anses produceras vid tillväxt i tarmen (4). Den långa inkubationstiden och att toxinerna ifråga är proteaskänsliga och anses brytas ned snabbt av pepsin och trypsin i mag-tarmkanalen talar mot att toxin som bildas under tillväxt i livsmedel skulle ha betydelse (4, 5). Kräkningarna orsakas av ett s.k. emetiskt toxin som är värmestabilt och som bildas under tillväxt i livsmedlet. Detta toxin är proteasresistent. Den korta inkubationstiden är förenlig med en sådan livsmedelsförgiftning. På grund av de relativt snabbt övergående symptomen är det sannolikt att frekvensen livsmedelsburen sjukdom orsakad av B. cereus är kraftigt underskattad (3). Vanligtvis leder sjukdomen inte till några komplikationer. Det finns dock ett fåtal antal fall där sjukdomstiden varit längre och fall där dödsfall inträffat. 17 av 24 personer blev sjuka i diarré efter förtäring av rester av en kötträtt som värmts upp dagen efter tillagning. Några patienter blev sjuka först efter mer än ett dygn. För tre varade symptomen i en hel vecka och för ytterligare en person ännu längre tid (6). Dödsfall på grund av emetiskt toxin har inträffat i samband med konsumtion av pasta (7) och pastasallad (8). I båda fallen rörde det sig om livsmedel som förvarats felaktigt. Vid ett utbrott på ett vårdhem fick flera personer blodig diarré och 3 dog, på grund av ett tidigare okänt enterotoxin (cytotoxin K) från B. cereus (9). Bacillus cereus rapporteras mycket sällan i samband med sjukdomsfall orsakade av mjölk och mejeriprodukter (5). De rapporter där mjölk eller grädde för konsumtion misstänkts varit inblandade omfattar opastöriserad mjölk som upphettats och sedan fått svalna till nästa dag (diarré) (10), pastöriserad mjölk i Nederländerna och Danmark (illamående och kräkningar), (11, 12), pastöriserad grädde i England (kräkning) (13), 2

UHT-mjölk i Japan (processfel, diarré och kräkning) (14) och pastöriserad mjölk utspädd med sköljvatten (kräkningar, P-E. Granum pers. meddelande). I så gott som samtliga fall översteg B. cereus-halten 1 miljon/ml i den konsumerade produkten. Under 1990-talet uppmärksammades alltmer att psykrotrofa stammar hade förmåga att bilda toxin (12, 15). Toxinbildning kunde t.o.m. påvisas i mjölk vid låg temperatur (16, 17). Även om toxinbildning i livsmedel, med den kunskap som finns idag, sannolikt inte är relevant för sjukdomsbilden så medförde den potentiella toxinbildningsförmågan hos stammar som kan växa vid låg temperatur att blickarna riktades mot mjölk, som ofta innehåller sporer av B. cereus med mjölkråvaran från gården. Genom tillväxt till höga halter i mjölken skulle vegetativa celler kunna eventuellt kunna överleva vid gynnsamt magsäcks-ph och därefter tillväxa och bilda toxin i tunntarmen. Flera undersökningar tydde på att det fanns skillnader i toxinbildningsförmåga mellan olika stammar (16, 18). Bacillus cereus växer med minimumtemperatur 4-5 C (som lägst för olika stammar) och maxtemperatur 48-50 C (som högst). Psykrotrofa stammar har lägst minimitemperatur och en optimumtemperatur mellan 30-37 C medan mesofila stammar har högre minimitemperatur (ofta mer än 10 C) och har optimum runt 37 C. Minimum-pH ligger mellan 4,3-4,9 och max-ph är cirka 9,3. Om organiska syror finns närvarande är min-ph högre, t.ex. ph 5,6 i 0,1 M mjölksyra (5). Mjölk och grädde är utmärkta näringssubstrat för B. cereus och tillväxten begränsas i huvudsak endast av lagringstemperaturen. Vid 8 C växer många psykrotrofa stammar medan allt fler stammar hämmas vid lägre temperatur. Vid 5-6 C är tillväxthastigheten så låg att den inte är hållbarhetsbegränsande med avseende på framstämplingsdatum för konsumtionsmjölk (5). Pastörisering av mjölk gynnar sporgroning hos B. cereus (19). Farokaraktärisering Toxinerna Åtminstone 4 olika toxiner har visat sig vara cytotoxiska mot tarmepitelceller och/eller har gett positivt resultat i tarmslyngetest (frisläppande av vätska i avsnörda delar av kanintunntarm efter injektion av prov som har aktivitet mot tarmen) eller kaninhudtest (VPR). Det finns tre väldokumenterade enterotoxiner - det hemolytiska enterotoxinet (HBL), det icke hemolytiska enterotoxinet (NHE), samt cytotoxin K. Ytterligare två toxiner har föreslagits vara enterotoxiner, nämligen enterotoxin FM (entfm) (20) och enterotoxin T (entt) (21). EntFM har aldrig påvisats ha enterotoxisk effekt eller varit inblandat i matförgiftning medan entt vid senare undersökningar visat sig vara en kloningsartefakt (22, 23). Det fjärde väl beskrivna toxinet är det emetiska, cereulid. HBL HBL består av tre proteinenheter, B, L1 och L2. Proteinerna har renframställts och de tre generna har sekvenserats (24). Alla tre enheterna krävs för toxicitet. B-subenheten binder in till tarmepitelet varefter ett komplex bildas med L1 och L2, så att en por bildas i cellmembranet på tarmcellen. HBL-toxinet är hemolytiskt och ger en karaktäristisk ringformad dubbel hemolyszon runt kolonin på blodagar (25). Det finns sedan tidigare ett kommersiellt tillgängligt immunologiskt kit, BCET-RPLA (Oxoid), som kan användas för att påvisa förekomst av subenhet L2 i livsmedel eller i odlingsubstratet efter uppodling av en B. cereus-stam. Det förekommer en viss polymorfism i HBL-genomet vilket har inneburit svårigheter att finna primers för PCR som detekterar generna i alla stammar (26). Detta gäller särskilt stammar från omgivningen och livsmedelsisolat, 3

jämfört med stammar som varit involverade i matförgiftning (26). Motsvarande heterogenitet kan också påvisas immunologiskt (27). HBL anses förekomma hos cirka 60% av undersökta stammar (4). Toxinet ger positivt utslag i tarmslyngetest och celltoxicitet (24). Toxinet inaktiveras av proteaser samt vid uppvärmning till 56 C i 5 minuter (28, 29). Specifika EU-projektresultat En analysmetod har tagits fram som medger att B. cereus stammar som producerar HBL och NHE kan identifieras direkt på agarplatta genom immunoblotting på cellulosamembran (30). En samling med 100 isolat av B. cereus, som utvalts för att representera stor variabilitet har testats för produktion av HBL. 42% av stammarna producerade HBL-toxin. Spännvidden i produktionsförmåga vid laboratorieodling var mycket stor (0,02 5,6 µg/ml odlingssubstrat) (30). En kommersiell lateral flow immunosassay (dipstickformat) för detektion av både HBL och NHE baserad på monklonala antikroppar som tagits fram i projektet är under lansering av Merck. NHE NHE består också av tre proteinenheter NheA, NheB och NheC (31), som binder till tarmepitelcellmembranet och bildar en por. NHE är celltoxiskt mot Vero-celler och Caco- 2 celler (31). Generna har sekvenserats (32). I anslutning till NheC-genen finns en stemand loopstruktur i DNA-sekvensen som sannolikt begränsar produktionen av NheC (32). Proteinerna är genetiskt besläktade men skilda från HBL. Även här förekommer genpolymorfism (26). NHE är vanligare än HBL och produceras av flertalet B. cereusstammar (4). Toxinet är värmelabilt och känsligt för proteasinverkan (28). Det finns ett kommersiellt tillgängligt ELISA-kit från Tecra som detekterar NheA. Specifika EU-projektresultat Monoklonala antikroppar har tagits fram mot både NheA, NheB och NheC och mycket känsliga immunologiska tester i olika format har producerats (33). NHE har undersökts molekylärbiologiskt. NheB visade sig vara den bindande komponenten. Maximal celltoxisk effekt uppnåddes när proportionen NheA:NheB:NheC var 10:10:1. Överskott av NheC förhindrade den toxiska effekten (34). En samling med 100 isolat av B. cereus, som utvalts för att representera stor variabilitet har testats för produktion av NHE under laboratoriebetingelser. 99% av stammarna producerade NHE-toxin. Spännvidden i produktionsförmåga vid laboratorieodling var mycket stor (0,03 14,2 µg/ml odlingssubstrat) (30). Försök att neutralisera effekten av toxinerna med hjälp av antikroppar visade att NHE var det mest celltoxiska toxinet och kanske därför har störst betydelse för utvecklingen av diarré (35). En kommersiell lateral flow immunosassay (dipstickformat) för detektion av både HBL och NHE baserad på monklonala antikroppar som tagits fram i projektet är under lansering av Merck. 4

Cytotoxin K Toxinet består av ett protein som bildar en por i cellmembranet (36). Den ursprungliga stammen där CytK upptäcktes saknade andra toxiner och orsakade både blodig diarré och dödsfall (9). Toxinet är hemolytiskt och kraftigt celltoxiskt mot Vero-celler (9). Senare undersökningar har visat att cytk i majoriteten av undersökta stammar förekommer i en mindre toxisk form (CytK-2) än det ursprungliga toxinet (CytK-1) (37, 38). Även här förekommer genetisk polymorfism (38). Specifika EU-projektresultat Genen för cytotoxin K var vanligare i stammar som varit inblandade i matförgiftning (50%) än i stammar från livsmedel eller miljön (20 respektive 37%) (39) Emetiskt toxin (cereulid) Det emetiska toxinet är lågmolekylärt och består en ringsluten peptid som är mycket stabil mot hög temperatur (klarar autoklavering), ph-variationer och är resistent mot proteaser (40, 41). Detta medför att toxin som bildats under tillväxt av B. cereus i livsmedel inte kommer att påverkas vid mag- tarmpassagen och kan därefter snabbt verka i tarmen. Toxinets struktur har identifierats (42). Toxinet fungerar som en jonofor som transporterar kaliumjoner över cellmembranet i mitokondrier hos den angripna cellen och därmed punkterar membranpotentialen (43, 44). Toxinet kan påvisas med celltoxicitetstest efter att provet först har kokats eller autoklaverats för att inaktivera enterotoxinerna (45). Toxinet har i första hand förknippats med matförgiftningar i samband med ris men även andra livsmedel har förekommit (46). Mjölk är ett gynnsamt substrat för toxinbildning vid laboratorieodling men det krävs omrörning och en temperatur på 20-30 C för toxinbildning (47, 48). Specifika EU-projektresultat B. cereus med förmåga att bilda emetiskt toxin skiljer sig från övriga B. cereus med avseende på ett flertal egenskaper: De har ett unikt genetiskt fingeravtryck med RAPD-PCR, M17-PCR och FT- IR-spektroskopi samt en unik extracellulär proteinprofil. Släktskapet ligger närmast B. anthracis i Bacillus cereus-gruppen och de emetiska stammarna verkar vara klonala med mycket liten variation i isolat från hela världen (49). Dessa typningsmetoder kan användas för att identifera emetiska stammar. Emetiska stammar uppvisar ingen eller mycket liten hemolyszon på blodagar (49). Detta är en användbar karaktär för att identifiera kolonier av presumptiva emetiska stammar på blodagar (50). En snabbtest för emetiskt toxin som bygger på att toxinet hämmar rörligheten hos grisspermier har tagits fram (50). Efter odling extraheras toxinet från en koloni i metanol och extraktet sätts till spermier som studeras under mikroskop. Testet är mycket specifikt för denna typ av toxin. Alla emetiska stammar kan växa vid 48 C men inte under 10 C. Sporerna hos emetiska stammar är mycket värmeresistenta vid 90 C och gror ut dåligt vid 7 C (51). (Två psykrotrofa stammar har senare påvisats kunna bilda cereulid i mycket låg halt vid 8-12 C, men i mycket låg halt och efter 5

lång tid) (52). Dessa är klart avvikande från alla stammar som undersöktes i projektet). Generna för toxinet har klonats och primers för identifiering av emetiska stammar med PCR har tagits fram för första gången (53, 54). Produktionen av emetiskt toxin i olika kommersiella modersmjölksersättningar som förvarats vid 28 C över natten varierade med sammansättningen och även med stammens egenskaper. Ökad utspädning med vatten ledde till högre produktion (55). Optimerade primers för påvisande av gener för cereulid, NHE, HBL, och cyt K i samma multiplex PCR-reaktion har tagits fram (56). Biodiversitet inom B. cereus Inom EU-projektet har 100 stammar, utvalda från en kollektion av 370 stammar, undersökts mycket noggrant. De representerar så stor biodiversitet i form av geografi, omgivningsisolat, livsmedelsisolat och stammar som orsakat matförgiftning, förekomst av toxinbildningsgener (samtliga fyra toxiner testade för), toxinbildningspotential, tillväxthastighet och lagfas vid olika temperaturer (4 C till > 58 C), värmeresistens hos sporer vid 90 C samt sporgroning vid olika temperaturer (39). Exponeringsskattning Livsmedel från sjukdomsutbrott orsakade av B. cereus rapporteras ofta innehålla log 5 till log 8 celler/g (3). Undantagsvis har lägre halter log 3-4 rapporterats (3). Epidemiologiska data tyder på att det krävs ett intag från livsmedel om minst 100.000 B. cereus för att riskera bli sjuk, men ofta upp till 100 miljoner (3). Orsakssammanhanget som leder till att en konsument exponeras för toxiner från B. cereus innehåller många led. En första förutsättning är att mjölken kontamineras med sporer. Därefter krävs att B. cereus förökar sig till kritiska halter. Men detta är inte tillräckligt.dessutom måste den aktuella stammen dessutom vara försedd med gener som kodar för toxinerna. På gården: Den första förutsättningen är att mjölken kontamineras med sporer av B. cereus i samband med mjölkning eller att den kontamineras i mjölkningsutrustning på gården. Spridningsvägarna för B. cereus på gården är väl undersökta. Den viktigaste spridningsvägen till mjölken är via spenar som nedsmutsas med jord under betesperioden (57) (58). Under stallperioden kan tillväxt i strömedel som ligger kvar länge i liggbås vara en källa för tillväxt och sporbildning (59, 60). Även mjölkningsanläggningen kan bidra vid otillräcklig disk (57). De sporhalter som uppmätts i tankmjölk är alltid låga, som mest några 1000-tal per l (d.v.s. någon per ml). De halter som påträffas i leverantörmjölk är inte hälsofarliga för konsumenten. Det krävs tillväxt för att uppnå kritiska halter och detta sker inte i leverantörmjölk där temperaturen är högst 4 C. Endast sporer har betydelse eftersom eventuella vegetativa B. cereus dör vid pastörisering av mjölken. På mejeriet pastöriseras mjölken vilket leder till en viss sporaktivering och kan leda till sporgroning samt långsam tillväxt under kylförvaring (5). Återkontamination kan ske 6

(61, 62) och har påvisats både i silotank och i processlinjen efter pastören (63-66). Även denna återkontamination sker på låg nivå, d.v.s. storleksordningen 10-2000/l. För att nå höga halter i mjölk krävs tillväxt under kyllagring. De halter som finns i mjölken när den lämnar mejeriet är inte hälsofarliga. Förvaringstemperaturen hos konsumenterna spelar troligtvis störst roll för tillväxten. Inga data finns för förvaringstemperatur av mjölk i svenska konsumenters kylskåp finns men en holländsk riskvärdering för B. cereus i konsumtionsmjölk beskriver temperaturer från <5 C till 13 C (67). Enligt denna undersökning uppskattas att 7% av de portioner konsumtionsmjölk som förtärs i Nederländerna innehåller mer än 100000 B. cereus medan 4% innehåller mer än 1 miljon bakterier (67). Motsvarande uppskattningar finns inte för svenska förhållanden, men ett liknande scenario är inte otänkbart. EU-Projektresultat Förekomsten av emetiska stammar i mjölkkedjan har undersökts. En låg frekvens stammar från gård till mejeri påvisades (0,05% i mejeriledet och cirka 1% på gårdsnivå) (46). Klonal uppförökning med dominans av emetiska isolat kunde dock påvisas på en gård som hade liggbås med djupa sågspånsbäddar och i en silotank (46). Egenskaperna hos isolat från gården har undersökts med avseende på toxingener och potentiell toxinbildningsförmåga (68) med hjälp av de immunologiska kiten. Nhe- och Hbl-generna förekommer i lika hög grad hos isolat från opastöriserad mjölk på gården som i senare led. Det fanns en högre andel stammar med hög toxinpotential bland gårdsisolat och siloisolat än i isolat från mejerimjölk. Det fanns en högre andel högproducenter av toxin bland mesofila isolat än bland psykrotrofa. CytK påvisades bara i mesofila stammar (68). I silotankar påträffades i huvudsak mesofila stammar som husflora (64), varav vissa var högproducenter av Hbl. Dessa stammar utmärkte sig av att ha extremt hög resistens mot diskning med lut. Psykrotrofa stammar och i synnerhet de som växte till i pastöriserad mjölk vid 7 C hade låg toxinbildningsförmåga, speciellt med avseende på Nhe. Endast 3 procent av alla psykrotrofa isolat var högproducenter av både Hbl och Nhe och inga alls bland de psykrotrofa mejeriisolaten. Endast 3% producerade hög halt av NHE medan 27% var högproducenter av HBL. Inga psykrotrofa mejeriisolat hade cytk eller producerade emetiskt toxin (68). Undersökningar av toxinbildningspotentialen har i projektet undersökts noggrant hos 100 representativa B. cereus-stammar med både genom antikroppsbaserade metoder och celltoxicitetsmätning. Toxinbildningsförmågan var stamberoende och varierar avsevärt från nästan icke-toxiska stammar till sådana med mycket hög toxinpotential (35). Störst variationsbredd uppvisade NHE och därefter HBL. Stammar som varit inblandade i livsmedelsburen sjukdom hade högre medianvärde för toxinbildning än livsmedels- och omgivningsisolat (35). Det fanns en stark korrelation mellan celltoxicitet och NHE, men inte med HBL. Detta tyder på att NHE är det viktigaste toxinet ur sjukdomssynpunkt (35). CytK- 2 bidrog förhållandevis lite till celltoxiciteten. 7

På grund av den låga förvaringstemperaturen för pastöriserad mjölk (max 8 C) kommer tillväxten av B. cereus att vara långsam och leder till att psykrotrofa (lågtoxinbildande) stammar anrikas i mjölken. Det är endast sådana stammar som skulle kunna förökas till höga halter i mjölken. De mesofila isolaten, som oftast är mera toxiska hinner inte tillväxa till sådana nivåer med normal framstämplingstid. De viktigaste styrparametrarna för att kontrollera B. cereus i konsumtionsmjölk är att hålla en låg kylförvaringstemperatur samt att begränsa framstämplingstiden. Vid 8 C ses en tydlig årstidsvariation med högre B. cereus-halt i pastöriserad mjölk under sommar och tidig höst än på vintern. Detta beror på att mjölken oftast innehåller mera sporer från gården under betesperioden än under stallperioden. På grund av detta minskar oftast mejerierna framstämplingstiden för mjölk med något dygn under maj-september. Riskkaraktärisering En förutsättning för att bli sjuk är att tillräckligt höga halter B. cereus finns i det livsmedel som konsumeras. För att kunna ha toxisk verkan i tarmen måste toxinerna komma i kontakt med tarmslemhinnan. För detta krävs att antingen i förväg producerade toxiner (som det emetiska toxinet), eller att sporer/vegetativa B. cereus når tarmen och tillväxer där under toxinbildning. Vid passagen till tarmen passerar födan magsäcken som karaktäriseras av lågt ph och närvaro av det proteolytiska enzymet pepsin. I magsäcken kan ph variera mellan ph 1 i tomt tillstånd och beroende på födan upp till ph 5,0 i fyllt tillstånd. Tunntarmen där toxinverkan sker är en dynamisk miljö där tarminnehållet omsätts inom 3 timmar. Närvaron av gallsalter och lipaser kan hämma bakterietillväxt och proteolytiska enzymer som trypsin kan ha nedbrytande effekt på enterotoxinerna. EU-projektresultat Sporer av B. cereus överlever magsäckspassagen oberoende av ph (69). Vid ph under 3,5 sker en snabb inaktivering av vegetativa B. cereus, medan vid högre ph kunde en viss överlevnad ske i simulerad magsäcksvätska. En studie där transport och överlevnad av vegetativa celler simulerades i en dynamisk och mekanistisk modell för magsäckspassagen tyder på att vid ett initialt ph över 4 i magsäcken kan vegetativa celler överleva (3-26% av ursprungshalten beroende på tillväxtfas och ph) (70). Störst överlevnad erhölls vid simulering av ph motsvarande det i magsäcken hos en åldring. (Liknande resultat har också publicerats i en annan undersökning där simulerad magsäcksvätska blandades med livsmedel inklusive mjölk, som hade en skyddande inverkan) (71). Vegetativa B. cereus i stationärfas var mera syratoleranta vid avdödning i magsäcksvätska än exponentiellt tillväxande celler (70). Wijnands undersökte hur sporer beter sig vid 37 C i simulerad tunntarmsvätska i fyra timmar efter att först ha utsatt dem för simulerad magsäcksvätska under en timme (69). Sporer från psykrotrofa stammar grodde ut långsammare och tillväxt skedde med mindre än en logenhet för endast två av sex stammar, till skillnad från mesofila sporer där 6 av 7 stammar grodde ut snabbt och förökade sig med 2 logenheter. De övriga fyra psykrotrofa stammarna växte inte alls. (I en annan undersökning visades att närvaron av gallsalt i tunntarmsvätska hade en tillväxthämmande effekt som var dosberoende, men påverkades kraftigt av typen livsmedel och var 8

även stamberoende) (72). En psykrotrof stam hämmades mycket mera kraftigt än två mesofila (72). Vid tillväxtförsök i simulerad tunntarmsvätska (SIF) vid 37 C utmärktes de psykrotrofa stammarna av längre generationstid och längre lagperiod än de mesofila stammarna (69). Skillnaderna mellan grupperna var större i SIF än i rikt bakteriologiskt odlingsmedium, d.v.s. SIF är en ogynnsammare miljö för tillväxt av psykrotrofa stammar. Sporer och vegetativa celler av B. cereus har förmåga att binda till ytan av Caco-2 celler (tarmceller) (70). Cirka 1% av tillförda B. cereus binder in vid adhesionsförsök med odlade Caco-2 celler. Cytotoxisk effekt (som innebär att de odlade celler angrips av toxinet och förstörs) (73), uppnås vid cirka log 6 celler/ml i odlingsmedium. Celltoxicitetstester och immunologisk test visade god överensstämmelse för NHE (70). Endast enterotoxinproduktion från bakterier som bundits till tarmslemhinnan ger toxisk effekt. Enterotoxin NHE som finns i lösning bryts ned inom 15 sekunder i simulerad tunntarmsvätska (SIF) (70). Även HBL bryts ned snabbt av proteaser under laboratoriebetingelser och kan därför förväntas bete sig på samma sätt. En dynamisk simuleringsmodell baserad på biologiska data från projektet i kombination med en mekanistisk modell för mag/tarmpassagen har tagits fram (74). Resultatet tyder på att psykrotrofa stammar inte hinner tillväxa i tillräcklig omfattning för att uppnå kritiska halter i tarmen (log 5-7) under den inkubationstid på 6-12 timmar som är vanlig vid diarrésjukdom. Snabbväxande mesofila stammar klarar däremot detta. Riskbedömning av enterotoxinproducerande B. cereus i kylförvarad konsumtionsmjölk Många faktorer måste uppfyllas innan konsumenten riskerar att exponeras för toxin från enterotoxinbildande B. cereus. Det måste finnas en tillräckligt hög halt av B. cereus i mjölken. Dessa stammar måste ha generna för toxinbildning. De vegetativa cellerna måste överleva ph-sänkningen i magsäcken och sedan även överleva inverkan av gallsalter i tunntarmen. De måste dessutom fästa till tarmepitelet för att inte riskera att transporteras ut ur tarmen och för att inte toxinerna ska brytas ned av trypsin. Efter adhesion måste de tillväxa och uppnå halter om log 6-7 för genom toxinbildningen påverka tarmslemhinnan. För att detta ska ske måste tillväxthastigheten på tarmslemhinnan vara tillräckligt hög för att nå de kritiska halterna inom de timmar som utgör inkubationstiden för B. cereus inducerad diarré. Dessutom måste de ha en tillräckligt hög toxinbildningspotential för att ge toxisk effekt. Stammar som varit inblandade i matförgiftning har signifikant högre toxinbildningspotential än genomsnittliga livsmedelsisolat (26). Med tanke på de stora volymer mjölk som konsumeras både i Sverige och i andra länder så är sjukdomsrapporteringen för B. cereus anmärkningsvärt sparsam (se faroidentifiering). Notermans uppskattade i en riskvärdering att 7% av de mjölkportioner som konsumeras i Nederländerna innehåller mer än 100.000 psykrotrofa B. cereus/ml vid konsumtionstillfället (67). Det är inte osannolikt att situationen kan se liknande ut i Sverige. 34 friska vuxna konsumenter deltog i en nederländsk dubbel blindstudie där de fick konsumera pastöriserad mjölk (250-450 ml till lunch) som lagrats vid 7.5 C i 3-14 9

dagar (75). Endast 18 ospecifika gastrointestinala besvär kunde observeras av 259 tester. Flertalet av besvären uppstod vid konsumtion av mjölk som innehöll mer än 10 miljoner B. cereus/ml (75). Toxinbildningspotentialen för Nhe för samtliga isolat från mjölken var låga jämfört med en referensstam från en patient. Toxinproduktion in vitro är endast mätbar när bakteriehalten nått 1-10 miljoner/ml, d.v.s. i sen stationärfas. Det innebär att det krävs snabb tillväxt för att uppnå dessa halter i tarmen, d.v.s. att endast snabbväxande stammar skulle kunna orsaka diarré-sjukdom. Flera resultat från EU-projektet talar mot att psykrotrofa stammar skulle kunna uppnå tillräckligt hög halt i tunntarmen under de timmar som står till buds: Vegatativa celler av psykrotrofa stammar avdödas snabbare än mesofila vid jämförbart ph i simulerad magsäcksvätska vid 37 C. Vid ph 4,5-5,0 kan dock en viss överlevnad ske. Psykrotrofa sporer gror ut mindre effektivt än hos mesofila stammar i simulerad tunntarmsvätska vid 37 C. Psykrotrofa bakterier har längre lagfas och tillväxer långsammare än mesofila i simulerad tunntarmsvätska vid 37 C. Simuleringar tyder på att psykrotrofa B. cereus inte hinner tillväxa till kritiska halter efter adhesion till tarmslemhinnan. Resultaten från den svenska undersökningen inom EU-projektet tyder på att psykrotrofa B. cereus som tillväxer i konsumtionsmjölk har låg potential för produktion av Nhe och även Hbl, de saknar cytotoxin K och bildar inte emetiskt toxin (68). Det toxin som flest stammar hade hög potential för att bilda var Hbl och detta toxin tycks enligt celltoxicitetstest var mindre betydelsefullt än Nhe (35). Detta indikerar att de stammar som selektivt växer fram i kylförvarad mjölk kan vara mindre betydelsefulla än mesofila stammar för uppkomsten av sjukdom. Även andra undersökningar tyder på att flertalet psykrotrofa B. cereus (även kallade B. weihenstephanensis) är lågproducenter av enterotoxin (76, 77). I en undersökning på kokta kylförvarade grönsaker visades att de psykrotrofa B. cereus-stammarna var de minst toxiska (78). Flera undersökningar av psykrotrofa isolat från mjölk tyder på att för de flesta kunde toxinbildning inte påvisas eller påvisades i låg halt (18) och att det ofta krävdes koncentrering av provet 5-20 gånger för påvisande (27, 76, 79). Sammanfattningsvis tyder detta på att förekomst av psykrotrofa B. cereus i konsumtionsmjölk innebär en mycket liten hälsorisk. Med hänsyn till detta bör också mejeriernas interna gränsvärde vid bäst före-dagen kunna höjas till m= log 4 (10000)/ml (tillfredställande med anmärkning) respektive M= log 5 (100000)/ml (otillfredsställande) från tidigare log 3 respektive log 4/ml. Riskbedömning av kylförvarad konsumtionsmjölk avseende emetiskt toxinproducerande B. cereus Förekomsten av emetiska stammar i mjölkkedjan är mycket låg, cirka 1% av isolaten från gård och 0,05% i silomjölk. Bland psykrotrofa mejeriisolat från konsumtionsmjölk hittades inga isolat. Inga emetiska stammar som tillväxer under 10 C påvisades över huvud taget i EU-projektet och det krävs hög halt bakterier för att toxinbildning. Vid korrekt kylförvaring finns det ingen risk för tillväxt av emetiska stammar i mjölk och därmed inte heller för förekomst av emetiskt toxin i mjölken. 10

Referenser 1. Hauge, S. 1955. Food poisoning caused by aerobic spore-forming Bacilli. Journal of Applied Bacteriology 18:594-595. 2. Anonymous. 2001. Principles and guidelines for the conduct of microbiological risk assessment. FAO/WHO. 3. EFSA. 2004. Opinion of the Scientific Panel on Biological Hazards on Bacillus cereus and other Bacillus spp. in foodstuffs. EFSA Journal 175:1-46. 4. Granum, P.E. 2001. Bacillus cereus. In Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. M.P. Doyle, editor. Washington D.C.: ASM Press. 373-381. 5. Christiansson, A. 2002. Bacillus cereus. In Encyclopedia of Dairy Sciences. H. Roginski, J.W. Fuquay, and P.F. Fox, editors: Academic Press. 123-128. 6. Granum, P.E. 1994. Bacillus cereus som næringsmiddelhygienisk problemorganisme. Norsk Veterinærtidskrift 106:911-915. 7. Mahler, H., Pasi, A., Kramer, J.M., Schulte, P., Scoging, A.C., Bar, W., and Krahenbuhl, S. 1997. Fulminant liver failure in association with the emetic toxin of Bacillus cereus. New England Journal of Medicine 336:1142-1148. 8. Dierick, K., Van Coille, E., Swiecicka, I., Meyfroidt, G., Devlieger, H., Meulemans, A., Hoedemaekers, G., Fourie, L., Heyndrickx, M., and Mahillon, J. 2005. Fatal family outbreak of Bacillus cereus - associated food poisoning. Journal of Clinical Microbiology 43:4277-4279. 9. Lund, T., De Buyser, M.L., and Granum, P.E. 2000. A new cytotoxin from Bacillus cereus that may cause necrotic enteritis. Molecular Microbiology 38:254-261. 10. Vlad, A. 1972. Alimentary toxi-inection due to Bacillus cereus. Microbiologia, Parazitologia, Epideminologia XVII:531-536. 11. Krongaard Kristensen, K. 1981. Et tilfaelde af Bacillus cereuslevnedsmiddelforgiftning. Dansk Veterinaertidskrift 64 766-798. 12. Van Netten, P., Van de Moosdijk, A., Hoensel, P., Mossel, D.A.A., and Perales, I. 1990. Psychrotrophic strains of Bacillus cereus producing enterotoxin. Journal of Applied Bacteriology 69:73-79. 13. McSwiggan, D.A., Gilbert, R.J., and Fowler, F.W.T. 1975. Food poisoning associated with pasteurised cream. PHLS Communicable Disease Report 43:75. 14. Shinagawa, K. 1993. Serology and characterizaton of toxigenic Bacillus cereus. Netherlands Milk and Dairy Journal 47:89-103. 15. Griffiths, M.W. 1990. Toxin production by psychrotrophic Bacillus spp. present in milk. Journal of Food Protection 53:790-792. 16. Christiansson, A., Satyanarayan Naidu, A., Nilsson, I., Wadström, T., and Pettersson, H.-E. 1989. Toxin production by Bacillus cereus dairy isolates in milk at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology 55:2595-2600. 17. Odumeru, J.A., Toner, A.K., Muckle, C.A., Griffiths, M.W., and Lynch, J.A. 1997. Detection of Bacillus cereus diarrheal enterotoxin in raw and pasteurized milk. Journal of Food Protection 60:1391-1393. 18. Te Giffel, M.C., Beumer, R.R., Granum, P.E., and Rombouts, F.M. 1997. Isolation and characterisation of Bacillus cereus from pasteurised milk in household refrigerators in The Netherlands. International Journal of Food Microbiology 34:307-318. 11

19. Mikolajcik, E.M., and Koka, M. 1968. Bacilli in milk. 1. Spore germination and growth. Journal of Dairy Science 51:1579-1582. 20. Asano, S., Nukumizu, Y., Bando, H., Iizuka, T., and Yamamoto, T. 1997. Cloning of novel enterotoxin genes from Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. Applied and Environmental Microbiology 63:1054-1057. 21. Agata, N., Ohta, M., Arakawa, Y., and Mori, M. 1995. The bcet gene of Bacillus cereus encodes an enterotoxic protein. Microbiology 141:983-988. 22. Hansen, B.M., Høiby, P.E., Jensen, G.B., and Hendriksen, N.B. 2003. The Bacillus cereus bcet enterotoxin sequence reappraised. FEMS Microbiology Letters 223:21-24. 23. Choma, C., and Granum, P.E. 2002. The enterotoxin T (BcET) from Bacillus cereus can probably not contribute to food poisoning. FEMS Microbiology Letters 217:115-119. 24. Schoeni, J.L., and Wong, A.C. 2005. Bacillus cereus food poisoning and its toxins. Journal of Food Protection 68:636-648. 25. Beecher, D.J., and Wong, A.C.L. 1997. Tripartite hemolysin BL from Bacillus cereus - Hemolytic analysis of component interactions and a model for its characteristic paradoxical zone phenomenon. Journal of Biological Chemistry 272:233-239. 26. Guinebretiere, M.H., Broussolle, V., and Nguyen-The, C. 2002. Enterotoxigenic profiles of food-poisoning and food-borne Bacillus cereus strains. Journal of Clinical Microbiology 40:3053-3056. 27. Schoeni, J.L., and Wong, A.C.L. 1999. Heterogeneity observed in the components of hemolysin BL, an enterotoxin produced by Bacillus cereus. International Journal of Food Microbiology 53:159-167. 28. Spira, W.M., and Goepfert, J.M. 1975. Biological characteristics of an enterotoxin produced by Bacillus cereus. Canadian Journal of Microbiology 21:1236-1246. 29. Shinagawa, K., Ueno, S., Matsusaka, N., and Sugii, S. 1991. In vitro stability in biological activity and antigenicity of the vascular permeabiltiy factor produced by Bacillus cereus. Journal of Veterinary Medical Science 53:317-319. 30. Moravek, M., Wegscheider, M., Schulz, A., Dietrich, R., Burk, C., and Märtlbauer, E. 2004. Colony immunoblot assay for the detection of hemolysin BL enterotoxin producing Bacillus cereus. FEMS Microbiol Lett 238:107-113. 31. Lund, T., and Granum, P.E. 1996. Characterisation of a non-haemolytic enterotoxin complex from Bacillus cereus isolated after a foodborne outbreak. FEMS Microbiology Letters 141:151-156. 32. Granum, P.E., OSullivan, K., and Lund, T. 1999. The sequence of the nonhaemolytic enterotoxin operon from Bacillus cereus. FEMS Microbiology Letters 177:225-229. 33. Dietrich, R., Moravek, M., Burk, C., Granum, P.E., and Märtlbauer, E. 2005. Production and characterization of antibodies against each of the three subunits of the Bacillus cereus nonhemolytic enterotoxin complex. Applied and Environmental Microbiology 71:8214-8220. 34. Lindbäck, T., Fagerlund, A., Rodland, M.S., and Granum, P.E. 2004. Characterization of the Bacillus cereus Nhe enterotoxin. Microbiology 150:3959-3967. 35. Moravek, M., Dietrich, R., Buerk, C., Broussolle, V., Guinebretiere, M.H., Granum, P.E., Nguyen-The, C., and Märtlbauer, E. 2006. Determination of 12

the toxic potential of Bacillus cereus isolates by quantitative enterotoxin analyses. FEMS Microbiology Letters 257:293-298. 36. Hardy, S.P., Lund, T., and Granum, P.E. 2001. CytK toxin of Bacillus cereus forms pores in planar lipid bilayers and is cytotoxic to intestinal epithelia. FEMS Microbioogyl Letters 197:47-51. 37. Fagerlund, A., Ween, O., Lund, T., Hardy, S.P., and Granum, P.E. 2004. Genetic and functional analysis of the cytk family of genes in Bacillus cereus. Microbiology 150:2689-2697. 38. Guinebretiere, M.H., Fagerlund, A., Granum, P.E., and Nguyen-The, C. 2006. Rapid discrimination of cytk-1 and cytk-2 genes in Bacillus cereus strains by a novel duplex PCR system. FEMS Microbiol Lett 259:74-80. 39. Pielaat, A., Fricker, M., Nauta, M.J., and Van Leusden, F.M. 2005. Biodiversity in Bacillus cereus. In Rikjinstituut vor Volksgesondheid an Milieu. Bildhoven, Nederländerna. Report 250912004. 40. Turnbull, P.C.B., Kramer, J.M., Jørgensen, K., Gilbert, R.J., and Melling, J. 1979. Properties and production characteristics of vomiting, diarrheal, and necrotizing toxins of Bacillus cereus. The American Journal of Clinical Nutrition 32:219-228. 41. Rajkovic, A., Uyttendaele, M., Vermeulen, A., Andjelkovic, M., Fitz-James, I., In't Veld, P., Denon, Q., Vérhe, R., and Debevere, J. 2008. Heat resistance of Bacillus cereus emetic toxin, cereulide. Letters in Applied Microbiology 46:536-541. 42. Agata, N., Ohta, M., Mori, M., and Isobe, M. 1995. A novel dodecadepsipeptide, cereulide, is an emetic toxin of Bacillus cereus. FEMS Microbiology Letters 129:17-20. 43. Mikkola, R., Saris, N.E.L., Grigoriev, P.A., Andersson, M.A., and SalkinojaSalonen, M.S. 1999. Ionophoretic properties and mitochondrial effects of cereulide - The emetic toxin of Bacillus cereus. European Journal of Biochemistry 263:112-117. 44. Yokoyama, K., Ito, M., Agata, N., Isobe, M., Shibayama, K., Horii, T., and Ohta, M. 1999. Pathological effect of synthetic cereulide, an emetic toxin of Bacillus cereus, is reversible in mice. FEMS Immunology and Medical Microbiology 24:115-120. 45. Finlay, W.J.J., Logan, N.A., and Sutherland, A.D. 1999. Semiautomated metabolic staining assay for Bacillus cereus emetic toxin. Applied and Environmental Microbiology 65:1811-1812. 46. Svensson, B., Monthan, A., Shaheen, R., Andersson, M.A., Salkinoja- Salonen, M., and Christiansson, A. 2006. Occurrence of emetic toxin producing Bacillus cereus in the dairy production chain. International Dairy Journal 16:740-749. 47. Agata, N., Ohta, M., and Yokoyama, K. 2002. Production of Bacillus cereus emetic toxin (cereulide) in various foods. International Journal of Food Microbiology 73:23-27. 48. Häggblom, M.M., Apetroaie, C., Andersson, M.A., and Salkinoja-Salonen, M.S. 2002. Quantitative analysis of cereulide, the emetic toxin of Bacillus cereus, produced under various conditions. Applied and Environmental Microbiology 68:2479-2483. 49. Ehling-Schulz, M., Svensson, B., Guinebretiere, M.H., Lindback, T., Andersson, M., Schulz, A., Fricker, M., Christiansson, A., Granum, P.E., Martlbauer, E., et al. 2005. Emetic toxin formation of Bacillus cereus is 13

restricted to a single evolutionary lineage of closely related strains. Microbiology 151:183-197. 50. Andersson, M.A., Jaaskelainen, E.L., Shaheen, R., Pirhonen, T., Wijnands, L.M., and Salkinoja-Salonen, M.S. 2004. Sperm bioassay for rapid detection of cereulide-producing Bacillus cereus in food and related environments. Int J Food Microbiol 94:175-183. 51. Carlin, F., Fricker, M., Pielaat, A., Heisterkamp, S., Shaheen, R., Salonen, M.S., Svensson, B., Nguyen-The, C., and Ehling-Schulz, M. 2006. Emetic toxin-producing strains of Bacillus cereus show distinct characteristics within the Bacillus cereus group. Int J Food Microbiol 109:132-138. 52. Thorsen, L., Munk Hansen, B., Fog Nielsen, K., Bohse Hendriksen, N., Kerry Phipps, R., and Bjørn Budde, B. 2006. Characterization of emetic Bacillus weihenstephanensis, a new cereulide-producing bacterium. Applied and Environmental Microbiology 72:5118-5121. 53. Ehling-Schulz, M., Vukov, N., Schultz, A., Shaheen, R., Andersson, M.A., Märtlbauer, E., and Scherer, S. 2005. Identification and partial characterization of the nonribosomal peptide synthetase gene responsible for cereulide production in emetic Bacillus cereus. Applied and Environmental Microbiology 71:105-113. 54. Ehling-Schulz, M., Fricker, M., Grallert, H., Rieck, P., Wagner, M., and Scherer, S. 2006. Cereulide synthetase gene cluster from emetic Bacillus cereus: structure and location on a mega virulence plasmid related to Bacillus anthracis toxin plasmid pxo1. BMC Microbiol 6:20. 55. Shaheen, R., Andersson, M.A., Apetroaie, C., Schulz, A., Ehling-Schulz, M., Ollilainen, V.M., and Salkinoja-Salonen, M.S. 2006. Potential of selected infant food formulas for production of Bacillus cereus emetic toxin, cereulide. International Journal of Food Microbiology 107:287-294. 56. Ehling-Schulz, M., Guinebretiere, M.H., Monthan, A., Berge, O., Fricker, M., and Svensson, B. 2006. Toxin gene profiling of enterotoxic and emetic Bacillus cereus. FEMS Microbiology Letters 260:232-240. 57. Christiansson, A., Nilsson, J., and Bertilsson, J. 1996. Bacillus cereus spores in raw milk. Factors affecting the contamination of milk during the grazing period. Journal of Dairy Science 82:305-314. 58. Slaghuis, B.A., Giffel, M.C.T., Beumer, R.R., and Andre, G. 1997. Effect of pasturing on the incidence of Bacillus cereus spores in raw milk. International Dairy Journal 7:201-205. 59. Magnusson, M., Christiansson, A., and Svensson, B. 2007. Bacillus cereus spores during housing of dairy cows: Factors affecting contamination of raw milk. Journal of Dairy Science 90:2745-2754. 60. Magnusson, M., Svensson, B., Kolstrup, K., and Christiansson, A. 2007. Bacillus cereus in free stall bedding. Journal of Dairy Science 90:5473-5482. 61. Te Giffel, M., Beumer, R.R., Boonestroo, M.H., and Rombouts, F.M. 1996. Incidence and characterization of Bacillus cereus in two dairy producing plants. Netherlands Milk and Dairy Journal 50:479-492. 62. Lin, S., Schraft, H., Oderumu, J.A., and Griffiths, M.W. 1998. Identification of contamination sources of Bacillus cereus in pasterurized milk. International Journal of Food Microbiology 43:159-171. 63. Eneroth, Å., Svensson, B., Molin, G., and Christiansson, A. 2001. Contamination of pasteurized milk by Bacillus cereus in the filling machine. Journal of Dairy Research 68:189-196. 14

64. Svensson, B., Ekelund, K., Ogura, H., and Christiansson, A. 2004. Characterization of Bacillus cereus isolated from milk silo tanks at eight different dairy plants. International Dairy Journal 14:17-27. 65. Svensson, B., Eneroth, Å., Brendehaug, J., and Christiansson, A. 1999. Investigation of Bacillus cereus contamination sites in a dairy plant with RAPD-PCR. International Dairy Journal 9:903-912. 66. Svensson, B., Eneroth, Å., Brendehaug, J., Molin, G., and Christiansson, A. 2000. Involvement of a pasteurizer in the contamination of milk by Bacillus cereus in a commercial dairy plant. Journal of Dairy Research 67:455-460. 67. Notermans, S., Dufrenne, J., Teunis, P., Beumer, R., Giffel, M.T., and Weem, P.P. 1997. A risk assessment study of Bacillus cereus present in pasteurized milk. Food Microbiology 14:143-151. 68. Svensson, B., Monthan, A., Guinebretiere, M.H., Nguyen-Thé, C., and Christiansson, A. 2007. Toxin production potential and detection of toxin genes among strains of the Bacillus cereus group isolated along the dairy production chain. International Dairy Journal 17:1201-1208. 69. Wijnands, L.M., Dufrenne, J.B., Zwietering, M.H., and Van Leusden, F.M. 2006. Spores from mesophilic Bacillus cereus strain germinate better and grow faster in simulated gastro-intestinal conditions than spores from psychrotrhophic strains. International Journal of Food Microbiology 112:120-128. 70. Wijnands, L.M. 2008. Bacillus cereus associated food borne disease. Quantitative aspects of exposure assessment and hazard characterization. Wageningen University, Netherlands. 176 pages. 71. Clavel, T., Carlin.F., Lairon, D., NguyenThe, C., and Schmitt, P. 2004. Survival of Bacillus cereus spores and vegetative cells in acid media simulating human stomach. Journal of Applied Microbiology 97:214-219. 72. Clavel, T., Carlin, F., Dargaignaratz, C., Lairon, D., Nguyen The, C., and Schmitt, P. 2007. Effect of porcine bile on survival of Bacillus cereus vegetative cells and haemolysin BL enterotoxin production in reconstituted human small intestine media. Journal of Applied Bacteriology 103:1568-1575. 73. Minnard, J., Humen, M., and Pérez, P.F. 2001. Effect of Bacillus cereus exocellular factors on human intestinal cells Journal of Food Protection 54:1535-1541. 74. Pielaat, A., Wijnands, L.M., Takumi, K., Nauta, M.J., and Van Leusden, F.M. 2006. The fate of Bacillus cereus in the gastrointestinal tract. Rijkinstituut voor Volksgezondheit en Mileu, Bilthoven, Nederländerna:Report 2500912005. 75. Langeveld, L.P.M., Van Spronsen, W.A., Van Beresteijn, E.C.H., and Notermans, S.H.W. 1996. Consumption by healthy adults of pasteurized milk with a high concentration of Bacillus cereus: A double-blind study. Journal of Food Protection 59:723-726. 76. Stenfors, L.P., and Granum, P.E. 2001. Psychrotolerant species from the Bacillus cereus group are not necessarily Bacillus weihenstephanensis. FEMS Microbiology Letters 197:223-228. 77. Pruss, B.M., Dietrich, R., Nibler, B., Martlbauer, E., and Scherer, S. 1999. The hemolytic enterotoxin HBL is broadly distributed among species of the Bacillus cereus group. Applied and Environmental Microbiology 65:5436-5442. 15

78. Choma, C., Guinebretiere, M.H., Carlin, F., Schmitt, P., Velge, P., Granum, P.E., and NguyenThe, C. 2000. Prevalence, characterization and growth of Bacillus cereus in commercial cooked chilled foods containing vegetables. Journal of Applied Microbiology 88:617-625. 79. Granum, P.E., Andersson, A., Gayther, C., te Giffel, M., Larsen, H., Lund, T., and K, O.S. 1996. Evidence for a further enterotoxin complex produced by Bacillus cereus. FEMS Microbiology Letters 141:145-149. 16