IFM/Kemi Linköpings Universitet September 2004/LGM Projektlaboration i genteknik Tillämpning av olika molekylärbiologiska verktyg för kloning av en gen
Innehållsförteckning Inledning... 3 Amplifiering av gen med PCR... 4 Restriktionsklyvning... 5 Rening av DNA... 6 Agarosgelelektrofores... 7 Ligering av vektor och PCR fragment... 8 Transformering av vektor efter ligering... 9 Analys av transformanter... 10 Appendix... 11 2
Inledning Denna laboration, som omfattar 2 stycken heldagar, syftar till att ge laborativ erfarenhet av några olika moment som används vid kloning såsom t.ex. restriktionsklyvning och ligering. För varje laborationsmoment finns ett standardprotokoll med olika frågeställningar /funderingar som gås igenom innan ni sätter igång labmomentet. Laborationsmässigt kommer ni att arbeta i något större laborationsgrupper (4-5 st i varje grupp) där ni inom gruppen fördelar arbetet som anges för de olika momenten enligt flödesschemat (Figur 1). Varje grupp för noggranna anteckningar för de olika laborationsmomenten. Redovisning sker i form av en muntlig utvärdering av de erhållna resultaten tillsammans med labassistenten. Dag1 Amplifiering av gen med PCR Analys av vektor och PCR produkt på agarosgel Restriktionsklyvning av vektor Rening av PCR produkt Rening av vektor efter restriktionsklyvning Restriktionsklyvning av PCR produkt Rening efter restriktionsklyvning Ligering av vektor och PCR produkt Transformering av ligeringsblandning (görs av lab-assistent) Dag2 Screening av kolonier med PCR Analys av transformanter på agarosgel Figur 1: Flödesschema över de olika momenten i projektlaborationen 3
Amplifiering av gen med PCR Frågeställningar/funderingar: Utgående från primersekvensen, ge förslag på lämplig PCR cykel Vad händer om annealingtemperaturen är för hög? Respektive för låg? Uppskatta det molära förhållandet mellan vektor DNA och primer, hur stort är överskottet? Hur beräknas smältpunkten för primers? Vad bör man tänka på vid designen av primers? DNA: 1 µl Primer_forward: 1 µl Primer_reverse: 1 µl 10X dntp-mix: 2 µl 10X Reaktionsbuffert: 2 µl H 2 O: 12 µl Taq polymeras: 1 µl Totalvolym: 20 µl Tag ut 5 µl för analys på agarosgel efter reaktionen, resten används för restriktionsklyvning. T.A Brown Gene Cloning and DNA analysis, 4 th edition, sid. 179-193 Promegas, Protocols and application guide sid. 193-206 4
Restriktionsklyvning Frågeställningar/funderingar: Vad innebär 1 Unit? Vid vilken temperatur och hur länge ska reaktionen ske? Hur sker inaktivering av enzymerna? Vad händer om man INTE inaktiverar enzymerna? Vad bör man tänka på i val av reaktionsbuffert då man har två olika restriktionsenzymer i blandningen? Vilka kontroller bör ingå för att veta att bägge enzymerna har fungerat? Restriktionsklyvning av vektor/fragment: DNA: (1µg) X µl Restriktionsenzym NcoI: 1 µl Restriktionsenzym HindIII: 1 µl 10X Reaktionsbuffert: 2 µl H 2 O: Y µl Totalvolym: 20 µl Tag ut 5 µl för analys på agarosgel, resterande volym renas med lämpligt reningskit. T.A Brown Gene Cloning and DNA analysis, 4 th edition, sid. 60-74 Promegas, Protocols and application guide sid. 2-24 5
Rening av DNA Vid all manipulering av DNA såsom PCR amplifiering eller restriktionsklyvning behöver DNA:t renas efter reaktionen. Reningen tjänar flera syften, man blir av med överskott av t.ex. primer och restriktionsenzymer, reaktionsbufferten byts ut mot H 2 O och man får även en koncentrering av sitt prov. I denna projektlaboration kommer vi att använda oss av två olika kommersiella kit för att rena DNA. Både kit:en bygger på att DNA:t binds till en fast matris och sedan elueras ut i liten volym sterilt H 2 O.Anledningen till att man använder två kit är deras olika bindningsförmåga. Det kit som används för PCR produkten (QIAgen minelute PCR purification kit) binder DNA fragment i storleken 70-4000 bp medan det kit som används för rening av vektorn (QBiogene Geneclean II ) endast binder DNA fragment i storleken 200-20000 bp Rening av PCR produkt efter amplifiering och efter klyvning (QIAgen minelute PCR purification kit) 1) Tillsätt 5 volymer av PB-buffert till reaktionsblandningen. 2) Centrifugera 1 min i minelute kolonnen för att binda in DNA. 3) Kasta lösningen och tillsätt 750 µl tvättlösning, centrifugera 1 min och kasta lösningen. 4) Centrifugera kolonnen torr för få bort ev. överflödig tvättlösning. 5) Tillsätt 10 µl H 2 O och låt stå 1 min. Överför minelute kolonnen till ett nytt epp.rör och centrifugera 1 min. 6) Provet finns nu i epp.röret och är klart att användas för ligering. Rening av vektor efter klyning (QBiogene Geneclean II ) 1) Tillsätt 3 volymer NaI. 2) Tillsätt 5 µl väl resuspenderad glassmilk. 3) Centrifugera 5 sek. 4) Tillsätt 3 x 700 µl New wash tvätttlösning. Centrifugera 5-10 sek mellan tvättarna och kasta supernatanten. 5) Låt pelleten torka i 5-10 min efter sista tvätten. 6) Tillsätt 10 µl H 2 O och centrifugera 30 sek. 7) Överför supernatanten till ett nytt epp.rör och provet är nu klart att användas för ligering. T.A Brown Gene Cloning and DNA analysis, 4 th edition, sid. 36-43 Promegas, Protocols and application guide sid. 75-77 6
Frågeställningar/funderingar: Agarosgelelektrofores Vilka kontroller bör vara med vid elektroforesen Vad händer om du har för låg respektive för hög spänning vid elektroforesen? Vad bör du tänka på vid preparativt agarosgelarbete? Vilken koncentration på agarosgelen ska du använda? Gjutning av agarosgel 1) I en 250 ml flaska tillsätts 0.5-2.0 g agaros och 10ml 10x TBE buffert och spädes med vatten till totalvolymen 100ml. 2) Värm agarosgelen tills den är helt flytande, i ett vattenbad eller i mikrovågsugn. Låt blandningen svalna en stund (till ca 60 o C) och gjut agarosgelen. Låt gelen svalna i minst 30 minuter. Elektroforetisk separation av DNA 1) Blanda 4 µl laddningsbuffert med 5µl DNA och 11µl H 2 O. 2) Blanda också 1µl molekylviktsstandard med 4 µl laddningsbuffert och 15µl vatten. 3) Lägg agarosgelen i elektroforesapparaten och fyll på med 1x TBE buffert, så att det täcker gelen. 4) Applicera sakta och försiktigt proverna i provbrunnarna med en automatpipett (de ska sjunka ned i botten på brunnen). 5) Separera DNA fragmenten genom att lägga på en spänning ~100 Volt. Kom i håg att DNA är negativt laddat. 6) När den blåa markören har nått ca 2/3 ner på gelen avbryts elektroforesen och DNA fragmenten infärgas med etidiumbromid. Etidiumbromid som interkalerat med DNA kan ses genom att gelen belyses med 300-360 nm ljus på en transluminator. Skydda ögonen genom att använda skyddsglasögon och använd handskar vid arbete med Etidiumbromid. 7) Fotografera av gelen och uppskatta mängden DNA ni har erhållit. T.A Brown Gene Cloning and DNA analysis, 4 th edition, sid. 68-74 7
Frågeställningar/funderingar: Ligering av vektor och PCR fragment Vilket molärt förhållande mellan vektor och fragment ska det vara vid reaktionen? Hur vet man mängden DNA? Hur lång ligeringstid och vid vilken temperatur? Vad bör man tänka på vid ligering av blunt-ends istället för sticky-ends? Vilka kontroller bör vara med ligeringsreaktionen? Vad innebär 1 Unit? 1) Tag ~50ng vektor och 3-faldigt molärt överskott av PCR produkt. Justera volymen till 10 µl med H 2 O. 2) Tillsätt 10 µl 2 X quick Ligation buffer och blanda. 3) Tillsätt 1 µl Quick T4 DNA ligas och blanda noggrant, centrifugera blandningen några sekunder. 4) Inkubera i rumstemperatur 5-15 min. 5) Ställ blandningen på is. 6) Transformera ligeringsblandningen eller frys ned -20 C för transformering senare. T.A Brown Gene Cloning and DNA analysis, 4 th edition, sid. 74-84 Promegas, Protocols and application guide sid. 41-47 8
Transformering av vektor efter ligering Frågeställningar/funderingar: Vilka kontroller bör vara med ligeringsreaktionen? 1) Tina de superkompetenta XL1-blue cellerna portionerade i 50µl:s portioner. 2) Till varje 50µl:s portion av superkompetenta celler tillsätts 1-5µl av prov, kontroll eller transformationskontroll. 3) Blanda försiktigt med pipettspetsen och inkubera på is 30 minuter. 4) Värmechocka cellerna genom att placera rören i värmeblock 45 sekunder vid 42 C, placera sedan rören på is i 2 minuter. 5) Tillsätt 200µl av förvärmt (42 C.) NZY + Broth odlingsmedium och inkubera transformationsreaktionen 1 timme i 37 C. 6) Tag 100-200 µl av den inkuberade blandningen och sprid på agarplatta. 7) Dagen efter transformation (ca 16 timmar) kontrolleras transformationsgraden. Räkna antalet kolonier på de olika agarplattorna. T.A Brown Gene Cloning and DNA analysis, 4 th edition, sid. 85-91 Promegas, Protocols and application guide sid. 45-46, 51, 174 9
Analys av transformanter För att säkert kunna hitta transformanter med klonad gen finns ett antal olika metoder. Den allra bästa är att göra plasmidpreparation på ett antal kolonier och sedan bestämma DNA sekvensen på de olika klonerna. Då denna metod är något omständlig ska vi prova att göra koloni screening med PCR. Denna metod bygger på att ett antal kolonier från agarplattan (1 koloni i varje rör) förs över till ett rör och DNA innehållet amplifieras med PCR. Då vi använder samma primers som vi använde för att isolera genen kommer vi att kunna identifiera de kolonier som har genen insatt i vektorn. 1) Blanda följande lösningar i PCR rör (1 rör för varje koloni, märk rören noggrant) Primer_forward: 1 µl Primer_reverse: 1 µl 10X dntp-mix: 2 µl 10X Reaktionsbuffert: 2 µl H 2 O: 12 µl Totalvolym: ~20 µl 2) Plocka en koloni med tandpetare och ympa ned i PCR röret. 3) Värm PCR röret 95 C i 5 min. 4) Tillsätt 1 µl Taq polymeras, blanda med kort centrifugering. 5) Amplifiera DNA:t med samma PCR cykel som ni använde för att isolera genen. 6) Efter avslutad PCR tillsätts 4 µl laddningsbuffert och proverna analyseras på agarosgel. 10
Appendix Primer_forward: 5 -CGC GCG CGC GCC ATG GGA GTC TTT AGC AAG TGT GAG-3 Primer_reverse: 5 - GCCGGC CGG AAG CTT TCA TCA CAG GTT GCA GCT CGC 3 Figur 2: Primers för PCR amplifiering. Understruket indikerar restriktionssiten och baser i kursiv stil den del av primer som binder till genen. 5 ATGGGAGTCTTTAGCAAGTGTGAGCTGGCCCACAAGCTGAAAGCCCAG GAGATGGATGGATTCGGCGGATACAGCCTGGCCAACTGGGTGTGTATGGC CGAGTACGAGAGTAACTTCAACACCCGAGCTTTCAACGGAAAAAACGCA AACGGGAGCTCAGATTACGGCCTGTTCCAGCTGAACAACAAGTGGTGGTG CAAGGATAACAAGCGAAGCTCCTCGAACGCCTGCAACATCATGTGCTCAA AGCTGCTGGACGAGAACATAGACGATGACATCTCCTGCGCGAAGCGAGTC GTCCGAGATCCAAAGGGCATGAGCGCGTGGAAGGCCTGGGTCAAGCACT GCAAGGACAAGGACCTGAGCGAGTACCTGGCGAGCTGCAACCTGTGATG AAA-3 Figur 3: DNA sekvens av genen som ska amplifieras med PCR. Länkar: 1. New England Biolabs hemsida om restriktionsenzymer: http://www.neb.com/nebecomm/products/category1.asp 2. QIAgen minelute PCR purification kit: http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/pdf/dnacleanupandconcentrati on/minelute/1027886_hb_qq_minelute_0604.pdf 3. Geneclean II Qbiogene: http://www.qbiogene.com/literature/protocols/dna-kits/pdf/gc%20ii.proto-7-03.pdf 4. New England Biolabs hemsida om quick ligation kit: http://www.neb.com/nebecomm/products/productm2200.asp 11