Mordet i salladsdisken - utveckling av en PCR-baserad laboration för Gymnasiet

Transkript

1 Beteckning: Institutionen för matematik, natur- och datavetenskap Mordet i salladsdisken - utveckling av en PCR-baserad laboration för Gymnasiet Niklas Hedqvist Ht p C-nivå Lärarprogrammet 180p Examinator: Christina Hultgren Handledare: Anna Lindvall

2

3 Sammanfattning: Det har nyligen skett ett mord i salladsdisken i närbutiken. Så börjar inledningen till detta arbete. Syftet med studien var att ta fram en PCR-baserad genetiklaboration med RAPD-primer som är lärorik och intressant för gymnasielever i de naturvetenskapliga ämnena. RAPD är en metod där endast en primer används, till skillnad från de flesta andra PCR-metoder som använder två stycken primer. Laborationen har aldrig gjorts förut, vilket lett till att en stor del av arbetets tyngd ligger i att metodutveckla laborationen och sedan testa laborationen på en testgrupp. Testgruppen bestod av 9 gymnasieelever som läser naturkunskap B. Resultatet visade att 8 av de 9 elever som gjorde laborationen ansåg att laborationen bör ingå i naturkunskap B. Enkätundersökningen visar även att genetiklaborationen med RAPD primer höjde intresset för genetik och genteknik hos försökspersonerna. Slutsatsen är att laborationen lämpar sig mycket väl för att öka intresset för genetik och genteknik bland gymnasieelever. Nyckelord: Genetik, genteknik, laboration, PCR, pedagogik, RAPD

4

5 i Innehållsförteckning Innehållsförteckning... i 1 INLEDNING Syfte Bakgrund Litteraturgenomgång DNA uppbyggnad Proteinsyntes PCR Laboration som pedagogiskt hjälpmedel RAPD Frågeställningar METOD Urval Etiska överväganden Datainsamlingsmetoder Metodutveckling Isolering PCR Elektrofores och analys Pilotstudie RESULTAT Metodutveckling Pilotstudie DISKUSSION Metodutveckling Pilotstudie REFERENSER Bilaga Bilaga Bilaga Bilaga

6 ii

7 1 1 INLEDNING Det har nyligen skett ett mord i salladsdisken i närbutiken. Kriminalkommissarien och hans kriminaltekniker har kunnat säkerställa förövarens DNA från offret. Men på grund av varierande omständigheter har de inte tid att fortsätta med brottsgåtan, utan de har hyrt in er för att lösa uppgiften. De finns ett antal misstänkta gärningsmän som har setts på mordplatsen vid den ungefärlig tid då mordet uträttades. Nu är er uppgift att genom en DNA-analys av de olika misstänkta säkerställa vilken som är mördaren. Detta är inledningen till laborationen Mordet i salladsdisken och grundidén till mitt examensarbete är att göra genetik och genteknik intressant i en laborativ miljö. Mitt intresse för genetik väcktes på Högskolan i Gävle när jag läste kurserna Cellen och livsprocessen och Populationsgenetik ur ett molekylärbiologiskt perspektiv. Det som öppnade mina ögon för gentiken var just laborationerna. Kurslitteratur kan vara förvillande med alla nya begrepp, och det hjälpte att få använda kunskaperna praktiskt som i sin tur ledde till en djupare förstålelse. För att öka intresset för genetiken är laborationen kopplad till någonting som de flesta elever känner igen och kan ha en relation till, DNA. Kriminalserier går dagligen på tv så de flesta elever vet vad det är. Det är också viktigt att eleverna får praktiska tillämpningar i ett ämne som genetik eftersom det avsnittet innehåller många nya begrepp (Strömberg 2006). Det är bra om eleverna får läsa, höra, skriva och jobba med ämnet praktiskt. Det ökar på så sätt elevens chans för inlärning (Bjerg 2000). Det är också viktigt att förankra begrepp och jobba med en långsiktig inlärning (Wallin et. al 2005). 1.1 Syfte Mordet i salladsdisken är en laboration framtagen för att öka intresset för genetikstudier. Med inspiration från dagens omåttligt populära kriminalserier så får gymnasieeleverna testa på att vara kriminaltekniker och analysera DNA från de olika misstänkta gärningsmännen eg. salladssorterna. Genetiklaborationen riktar sig framförallt till de naturvetenskapliga ämnena biologi, naturvetenskap och kemi. Arbetet syftar till att gymnasieeleverna ska få en ökad kunskap om genetik, samt ett ökat intresse för de naturvetenskapliga ämnena. Därför kommer arbetet att kunna vara en bra grund för lärare som undervisar gymnasielever som både ska studera vidare inom biologi och för de elever som inte kommer att fortbilda sig i ämnet. 1.2 Bakgrund På skolverkets hemsida ( finns kursplanerna för de naturvetenskapliga ämnen som kan läsas på gymnasienivå: Biologi A (skolverket SKOLFS: 2000:19) Eleven skall: kunna planera och genomföra fältstudier och experimentella undersökningar, tolka dessa samt redovisa arbetet både muntligt och skriftligt, [ ] ha kunskap om arvsmassans strukturer samt förstå sambanden mellan dessa och individens egenskaper,

8 2 ha kunskap om gentekniska metoder och deras tillämpningar samt kunna diskutera genteknikens möjligheter och risker ur ett etiskt perspektiv Naturkunskap B (skolverket SKOLFS: 2000:9) Eleven skall: kunna planera, utföra och tolka enkla experiment och undersökningar samt kunna rapportera muntligt och skriftligt ha kunskaper om användning av naturvetenskap och teknik i samhället ha fördjupade kunskaper om några grundämnen, kemiska föreningar och viktiga kemiska begrepp som används i vardagsliv ha kunskaper i genetik och modern genteknik samt kunna diskutera tillämpningar ur etisk synvinkel Kemi B (skolverket SKOLFS: 2000:65) Eleven skall: ha förvärvat självständighet och vana vid laborativt arbete samt tillägnat sig förmåga att kritiskt granska och analytiskt behandla kemiska förlopp och egna mätresultat kunna förklara och tillämpa några vanliga analysmetoder samt kunna beskriva deras användningsområde och utveckling inom t.ex. sjukvård, miljöarbete, forskning och industri [ ] kunna schematiskt beskriva uppbyggnaden av och egenskaperna hos några biologiskt viktiga molekyler och beskriva de biokemiska huvuddragen i cellens metabolism och reproduktion Sammantaget så passar en genetiklaboration väldigt bra in på samtliga kurser samt att det är bra för eleverna att få en praktisk erfarenhet av de begrepp som uppfattas svåra. Det viktiga med laborationen är att skapa ett intresse och en förståelse som eleven kan ha svårt att få genom kurslitteraturen. 1.3 Litteraturgenomgång Tidigare utvecklade och utvärderade genetiklaborationer av Petterson (2004) och Häägg (2005) genomförda för gymnasieskolan visar att genetiklaboration passar väl för de naturvetenskapliga ämnena på gymnasieskolan. Dessa har visat på ett bra resultat och att eleverna tycker att det är roligt och lärorikt. Det som har upplevts som jobbigt är att det blir mycket väntetid (Pettersson 2004). Det har även framkommit att laborationer passar bra som undervisnings- och inlärningsform men bör ligga i slutet av genetikavsnittet då eleverna har haft en chans att lära sig alla begrepp (Häägg 2005).

9 DNA uppbyggnad Freeman och Herron (2007) skriver att vår arvsmassa brukar förkortas DNA vilket är en förkortning för Deoxyribonukleinsyra. DNA är en lång kedja som består av Deoxyribonukleotider eller kvävebaser. Varje Deoxyribonukleotid består av en 5 kols sockermolekyl kallad deoxyribos och en fosfatgrupp. Hela DNA-kedjan är uppbyggd på fyra består: Adenin, Guanin, Cytosin och Tymine. Alla dessa baser har en 5 ända och en 3 ända. Detta är viktigt eftersom DNA-kedjan är en dubbelspiral och därför måste en av kedjorna ha sin 5 ände uppåt medan den andra kedjan har sin 3 ände uppåt vilket leder till att kedjorna kan kopplas samman genom vätebindningar. Dessa vätebindningar (se figur 1) kan bara ske mellan Guanin-Cytosin (G-C) och Tymine-Adenin (T- A). Alltså består DNA av fyra kvävebaser och varje bas har en fix basparkamrat. (Freeman & Herron 2007) Figur 1 DNA-molekyl visar vätebindingar mellan Adenin-Tymine och Cytosin-Guanin ( ) Proteinsyntes En av uppgifterna som celler har är att producera protein. Detta kallas för proteinsyntes (Brändén 2003). Det protein som ska skapas är kodat i DNAt. Cellen går inte direkt från DNA till protein utan det sker vissa mellansteg. Ett sådant steg är att cellen skapar en enkelsträngad kopia av DNAt. Denna kallas för RNA vilken är uppbyggd på samma sätt med skillnaden att Tymine är utbytt till Urasil. Dessa kvävebaser binder lika bra till adenin. Det första cellen gör vid skapande av ett protein är att det bildas mrna-kedjor vilket kan liknas vid schematisk ritning så att cellen vet vilket protein som ska skapas. När väl det finns mrna-molekyler så kommer trna-molekyler vilka kan liknas vid arbetare, att koppla in de kvävebaser som passar efter den schematiska ritning som mrna visar. trna bygger alltså upp proteinet som mrna kodar för genom att i ena änden binda till sig en aminosyra och i den andra sidan ha tre kvävebaser som bara passar in på den specifika plats som mrnat kodar för och detta sker i cellens ribosomer (Brändén 2003) PCR PCR (Polymerase chain reaction) är en metod som hjälper till att mångfaldiga en liten bit DNA till ett stort antal kopior ( ). Brändén (2003) förklarar att för att kunna använda PCR behövs en oligonukleotid, vilket är en bit DNA som är baspar lång. Dessa kallas primer som flankerar/passar till DNA-sekvenser på sidorna om den DNA-sekvens man vill mångfaldiga. Det krävs också att startänden och slutänden har ett ungefärligt lika antal kvävebaser av GC (Brändén 2003). Dessa ändar brukar kallas för 5 och 3. Vid mångfaldigande vid byggandet av de nya DNA-kedjorna så adderas nukleotiderna på från 3 mot 5 (figur 2). För att mångfaldiga DNA behövs byggstenar kvävebaser samt ett

10 4 polymeras som kan bygga nya kopior av DNA-sekvensen. Sedan körs det i en PCR-maskin som cykliskt pendlar mellan olika temperaturer så att polymeraset kan mångfaldiga DNAsekvensen. Vid hög temperatur blir DNAt enkelsträngat, för att sedan kylas av så att primern kan fästa anneala till DNA-sekvensen. Sedan kan polymeraset bygga nya kedjor av den DNA-sekvens som primerparet flankerat. Polymeraset måste vara värmetåligt eftersom PCRmaskinen pendlar cykliskt mellan varmt och kallt. Detta upprepas cykliskt många gånger och DNA-sekvensen mångfaldiga ( Brändén 2003). 1. Här blandas en mix med kvävebaser, taq-polymeras primer. Sedan höjs temperaturen och DNAt delar sig vid 95 C. 2. Temperaturen sänks till 45 C så att primrarna kan fästa vid DNA- kedjan. 3. Temperaturen höjs till 72 C så att det värmetåliga taqpolymeraset kan bygga ihop det nya DNAkedjorna. Figur 2. Schematisk bild över PCR ( ) 4. PCR jobbar cykliskt och fördubblar DNA-kedjorna varje cykel Laboration som pedagogiskt hjälpmedel. Laborationer är ett pedagogiskt hjälpmedel för att förklara cellbiologi, genetik och genteknik. Det är många steg i en laboration som kan användas för att förklara dessa moment. (Bjerg 2000) Vanligtvis används metoder där växtceller fryses ned till -80 grader och med tillsatt alkohol kan DNA extraheras (Sharma et. al 2003). En annan billigare och enklare metod är Chelexisolering. Denna metod är en metod för att isolera DNA ur celler utan alkohol eller att frysa växtceller. I Chelexisolering används Protinas K och DTT för att bryta ned cellerna. Protinas K bryter ned proteiner och DTT bryter sulfidbryggorna i proteinerna. När detta är gjort kommer chelexkornen, som är som små innebandybollar, att binda de föroreningar som finns i lösningen. Under inkuberingstiden jobbar DTT och Protinas K aktivt. Vid upphettningen kommer cellerna att släppa ut sitt innehåll, och DTT och Protinas K kommer att deaktiveras. Vid centrifugeringen kommer de tyngsta pariklarna att samlas på botten i provrören (chelex och andra tyngre partiklar). Genom denna isoleringsmetod kan flera paralleller dras till cellens uppbyggnad samt hur DNA kan utvinnas ur cellen. När isoleringen är klar vid PCR-replikation delar sig DNAt och blir enkelsträngat vid 96 grader. Därefter fäster primrarna vid de båda enkelsträngade kedjorna vid 37 grader, och vid 72 grader bygger

11 5 taq-polymeraset upp de nya DNA-kedjorna. Detta är en väldig förenkling verkligheten. (Campbell 2005). Rent pedagogiskt kan detta även vara en bra förklaring av vad som naturligt sker i cellen vid replikation. Under cellens naturliga replikation spricker DNAt och bildar en bubbla. I denna bubbla har DNA-kedjan två enkelsträngade kedjor varvid det finns möjlighet för cellen att bygga upp två kedjor av DNAt. Vad finns det då för likheter mellan PCR och naturlig replikation? Jo, PCR är naturlig replikation på konstgjord väg. Syftet med PCR är att mångfladiga just den del av DNAt som behövs, medan naturlig replikation mångfaldigar hela DNA-kedjan. Vid PCR mångfaldigas en viss gen, det kan vara till exempel genen som kodar för om individen ska bli brun- eller blåögd. När PCR är gjord låter man PCR- produkten vandra genom en gel. Desto mindre genen är desto kortare vandrar genen i gelen. En blåögd person har dubbel uppsättning av gener som kodar för blåa ögon (homozygot). En brunögd person kan både ha dubbel uppsättning gener för brunögdhet alltså homozygot eller en gen för blåa ögon och en för bruna ögon. Det kallas för heterozygot. (Campbell & Reece 2005). När gelen studeras med PCRresultatet kommer man se detta som ett eller två bandmönster om generna är olika långa. Om generna skulle vara lika långa användes restriktionsenzymer för att klyva generna på specifika ställen vilket leder till att man kan se variationen som ett eller två bandmönster. Men det finns även stora skillnader som är viktiga att ta upp. En självklar skillnad är temperatur. Det är ju omöjligt för kroppen att ändra temperatur mellan 37 till nästan 100 grader vid mångfaldigandet av DNA RAPD RAPD är en ny, snabb, enkel och förhållandevis billig metod för att studera genetisk variation på molekylär nivå (Clark & Lanigan f 1993). Den första studien som beskriver RAPD metoden är Williams et. al (1990). I Williams et. al studie kan man läsa att molekylärgenetiska kartor vanligtvis är konstruerade med att analysera segregation av restriktionsfragmentens längdskillnader (RFLPs). Här beskriver de en ny DNA-metod för att urskilja skillnader i DNA baserat på ett slumpmässigt DNA-fragment genom en enkel primer. Dessa skillnader i DNA är enkla att upptäcka eftersom de bara amplifierar från ena delen av nukleotidsträngen. de föreslår att den blir kallad RAPD markers, efter Random Amplified Polymorphic DNA (Williams et. al 1990). RAPD är alltså en PCR metod som utgår från en slumpmässig amplifiering genom en enkel primer (Williams et. al 1990). RAPD är en av de vanligaste metoderna för att studera genetisk variation (Friedt et. al 2007). Vanligtvis vid PCR används två primer, en forward och en revers (Brändén 2003). En primer är vanligtvis mellan baspar lång (Campbell & Reece 2005). Men en RAPD primer är bara ungefär 10 baspar lång, vilket leder till att primern kommer att passa in på fler ställen på DNA-isoleringen, vilket leder till att man kan se variation (Williams et. al 1990). Det visar sig också att antalet annealingställen är kopplat till variation av amplifieringar av PCR (Li et al. 2006). RAPD primer har inte som andra primer en 5 ände och en 3 ände. Detta på grund av att de är så korta och att det bara används en primer mot andra metoder där det finns två primer. RAPD är en bra metod som passar till växt- och djur-dna (Williams et. al 1990). Det finns studier som visar att RAPD mycket väl kan användas till att detektera genetiskvariation på växter (Lázaro & Aguinagalde 1998). Med RAPD-primer är det vanligt att få ett bandmönster upp till 8 band (Li et al. 1999). Det man detekterar med RAPD är nukleärt kärn-dna (Crockett et. al 2000), vilket är det DNA som finns i cellkärnan. Det går även att se genetik variation på DNA ur cellernas mitokondrier.

12 6 RAPD metoden har fått kritik på grund av att den inte är säker (Dongre & Parkhi 2005). Det som gör att RAPD primern inte är så tillförlitlig är att primer är så kort så att den kan passa in på flera ställen vilket leder till att det kan skilja sig i resultat mellan provtagningarna. (Plieske & Struss 2001) 1.4 Frågeställningar Det primära syftet med arbetet är att ta fram en genetiklaboration som är lärorik och intressant för gymnasielever. Mina frågeställningar: 1) kan RAPD vara en lämplig metod för en genetiklaboration på gymnasiet? 2) Ökar försökspersonernas intresse för genetik och genteknik med Mordet i salladsdisken?

13 7 2 METOD Metoddelen består av två huvuddelar: metodutveckling och pilotstudie. Det är framförallt metodutvecklingen som är huvudsyftet med arbetet. Eftersom RAPD-metoden inte används i stor utsträckning på gymnasiet trots att metoden är mycket väl lämpad för just gymnasieelever har största delen av arbetet varit att ta fram en genetiklaboration som är snabb, enkel och framförallt intressant. 2.1 Urval Syftet med arbetet är att utveckla en laboration med en så enkel metod som möjligt. Urvalet för laboration är att den ska fungera på växter samt att hitta en metod som fungerar på växter som går att få tag på året om. Detta urval gjordes då efter att växterna ska gå att hitta i salladsdisken på närmaste mataffär. De urval som gjorts är att laborationen ska bli så enkel och kort som möjligt eftersom PCR-baserade DNA-laborationer annars tar lång tid. För att utvärdera laborationen fick en testgrupp på nio gymnasieelever utföra laborationen under en dag. Anledningen till att dessa elever fick göra laborationen var att de går kursen naturkunskap B. Eleverna har ingen stor laborationsvana vilket är ett plus för denna studie. Eftersom laborationen ska vända sig till naturkunskap B, biologi A och kemi B så är det viktigt att laborationen fungerar trots att eleverna inte har någon gedigen laborationsvana. 2.2 Etiska överväganden Det finns fyra etiska huvudkrav som bör tänkas på när arbetet berör andra människor. Dessa fyra huvudkrav är informationskravet, samtyckeskravet, konfidentialitetskravet och nyttjandekravet ( 1. Informationskravet innebär att alla deltagare i undersökningen informeras om vad syftet med deras medverkan är, att det är frivilligt att deltaga samt att de kan avbryta studien när som helst ( Detta informerades eleverna om vid början av laborationen. 2. Samtyckeskravet betyder att deltagare över 15 år själva ska godkänna sin medverkan. Alla elever fyllde i ett kontrakt om att vara med i studien (bilaga 1). 3. Konfidentialitetskravet innebär att alla deltagare ska ges största möjliga konfidentiellitet och att deras personuppgifter ska förvaras så att ingen obehörig kan få tag på dem ( Detta krav har uppfyllts genom att enkätundersökningen eleverna deltog i var anonym. 4. Nyttjandekravet innebär att uppgifterna samlats in från deltagarna endast får användas för forskningsändamål ( Detta har eleverna blivit informerade om och eleverna har skrivet på ett kontrakt (bilaga 1). 2.3 Datainsamlingsmetoder Litteratursökning gjordes på Högskolan i Gävles biblioteks databaser. Vetenskapliga artiklar där forskare har använt RAPD-primer för att analysera genetisk varians hos växter lästes översiktligt. Information från ett flertal artiklar sammanställdes för att utforma en lämplig laborationsmetod. För att kunna besvara frågeställningarna gjordes en pilotstudie på en grupp

14 8 gymnasieelever. Gymnasieeleverna fick också besvara en anonym enkät. Resultatet bearbetades och redovisas. 2.4 Metodutveckling Isolering av växt-dna gjordes först med 10 % chelex (10g chelexharts till 95 ml ddh 2 0 dubbeldestillerat vatten). Dessa isoleringar utfördes enligt standardprotokoll. Isoleringarna späddes med 50µl ddh 2 0. De växter jag valde att testa denna laboration på var isbergssallad, rucolasallad, romansallad, krispsallad, babyspenat, tall, en och gran. Tall-, gran- och enbarr var med som referenser eftersom att primer som valdes ut till studien fungerade just på barrträd (Allnutt et. al 2001). Ur T. R. Allnutt et. al s (2001) RAPD studie på växter valdes 7 stycken primer ut. Tabell 1. RAPD primrar använda i studien. OPK 16 GAG CGT CGA A OPK17 CCC AGC TGT G OPK19 CAC AGG CGG A OPK 9 CCC TAC CGA C OPAL 6 AAG CGT CCT C OPAL 12 CCC AGG CTA C OPAL 17 CCG CAA GTG T PCR-programmet var på 41 cyklar 92 C i 1 minut, 37 C i 1 minut och 72 C i 2 minuter, därefter 72 C i 5 minuter (Black-Samulesson 1997). PCR-produkten kördes på en 1 % agarosgel i 40 minuter med en spänning på 140V. Gelen färgades in med etidiumbromid och fotograferades och analyserades på UVljus- bord Isolering 0,5g växtmaterial inkuberades med en mix av 200µl 10 % chelex (10g chelexharts till 95 ml ddh 2 0), och 17 µl av en mix med 210µl Protinas K (Protinas K 20mg/1 ml ddh 2 O) samt DTT 148 µl (1M DTT i 0,1M NaAc ph5,2 sterilfiltrerat). Detta prov inkuberades i en temperatur på 56 C i två timmar. Det beställdes ett färdigt isoleringskit för växter från Dnesey. I väntan på det nya isoleringskitet gjordes det nya isoleringsförsök med både Dnesey isoleringskit för djurceller och nya Chelex 10% isoleringar. I de nya isoleringarna användes bara 0.25g växtmateriell som mosats i mortel, samt nya spädningar av Protinas K- och DTT blandningar eftersom dessa är känsliga och lätt kan tappa effekt PCR De första isoleringarna (rent total DNA efter chelex isolering) kördes med två primrar OPAL 6: AAG CGT CCT C som forward och primer OP17: CCC AGC TGT G som reverse. Det program som kördes i PCR-maskinen var på 41 cyklar 92 C i 1 minut, 37 C i 1 minut och 72 C i 2 minuter, därefter 72 C i 5 minuter. Med RAPD primer ska bara en primer användas till skillnad från andra PCR-metoder. Vid nästa försök kördes PCR med dessa primer var för sig. Nya försök gjordes där alla sju primrar testades med OPAL 6: AAG CGT CCT C, OPK17: CCC AGC TGT G, OPK19: CAC AGG CGG A, OPK 16 GAG CGT CGA A, OPK9: CCC TAC CGA C, OPAL 17 CCG CAA GTG T, OPAL 12 CCC AGG CTA C och

15 9 dessa analyserades för att ta fram den primern som bäst visade variation mellan de olika salladsarterna. Det program som kördes i PCR-maskinen var på 41 cyklar 92 C i 1 minut, 37 C i 1minut och 72 C i 2 minuter, därefter 72 C i 5 minuter (Black-Samulesson 1997). Detta program tog över 4 timmar att köra i PCR-maskinen. Försök gjordes att korta ner programmet till 92 C i 1 minut, därefter 41 cyklar 92 C i 15 sekunder, 37 C i 40 sekunder och 72 C i 45 sekunder, därefter 72 C i 5 minuter. Detta program tog 2 timmar. Nya försök gjordes med att ta fram ett nytt program 92 C i 1 minut, därefter 41 cyklar 92 C i 40 sekunder, 37 C i 40 sekunder och 72 C i 1 minut och 40 sekunder, därefter 72 C i 5 minuter. Figur 3: Första körningen från min metodutveckling av laborationen. Efter PCR maskinen kördes resultaten i elektrofores och bilden visar att primer opal 6 fungerar. Här kan man se att fyra av proverna fungera genom att det har blivit band på gelen. Två av proverna har två band och två har ett band Elektrofores och analys Flera provkörningar kördes med olika koncentrationer av agarosegeler. Både 1 %, 1,5 % och 2 % testades och analyserades med olika spänning i elektroforesapparaten. Agarosegelen placeras i elektroforesapparaten. I agarosegelens brunnar pipetteras DNAt som sedan tvingas fram genom att applicera spänning. De tyngre DNA-partiklarna, alltså de längsta DNAkedjorna kommer att vandra långsammare i gelen medan de korta DNA-kedjorna kommer att vandra fortare. Dessa kommer senare att blida bandmönster beroende på hur primrarna har fäst på DNAt. Det som analyserades och det som var grunden för urvalet var att få en tydligt och skarp bildkvalitet som möjligt. Eftersom det bara fanns som mest 7 misstänkta mördare valdes en kort agrosegel. Gelen färgades in med Etidiumbromid och analyserades och fotograferades på ett UV-bord. 2.5 Pilotstudie I pilotstudien deltog en grupp på nio gymnasieelever från samhällsprogrammet. Eleverna läste naturkunskap B, vilket var passande eftersom att om laborationen fungerar för elever som läser naturkunskap B så kommer laborationen även att fungera för biologi A och kemi B. Dessa elever delades in i två grupper och fick på egen hand göra laborationen. Jag fanns med som ett stöd till eleverna. Eleverna hade väldigt liten labbvana sedan tidigare och det mesta i laborationssalen var nytt för dem. För att få eleverna att känna utrustningen och få dem att hantera utrustningen på rätt

16 10 sätt fick alla elever testa att pipettera små mängder vanligt vatten. Innan laborationen gjordes även en genomgång om laborationsuppförande samt en genomgång av alla kemikalier som används i laborationen. Under väntetiden som fanns i laborationen fanns gott om tid till att ha föreläsningar om vad som händer med DNAt i varje steg av laborationen, samt att koppla förläsningen till lämpliga moment i vad som händer i kroppen till exempel proteinsyntes. En enkät delades ut till eleverna precis innan de fick reda på deras resultat. Detta för att säkerställa att resultatet på laborationen inte skulle påverka om laborationen varit lyckad eller inte.

17 11 3 RESULTAT Resultatet i denna rapport har delats in i två delar dels resultat från metodutvecklingen och dels resultat från pilotstudien. Anledningen för att resultatet har delats in i två delar är att båda delarna är viktiga för studien. 3.1 Metodutveckling Isolering av växt-dna gjordes först med 0,25g växt- DNA i 10 % chelex (10g chelexharts till 95 ml ddh 2 0). Dessa isoleringar utfördes enligt standardprotokoll. Likaså 0,25g växt DNA i Dnesys färdiga isoleringskit för djurceller enligt instruktioner. Ingen av dessa isoleringsmetoder fungerade. Isolering av växt-dna gjordes därefter med 0,25g mosat växt- DNA i nya spädningar av 10 % chelex enligt standardprotokoll. Detta gav resultat. Dnesys färdiga isoleringskit för växter och Chelex 10 % fungerar som isoleringsmetoder, dock är Dnesys färdiga isoleringskit för växter inte testat i pilotstudien. Under metodutvecklingen av laborationen gjordes försök att korta ned inkuberingstiden (den tid som DTT och Protinas K bryter ned cellerna.) Dessa försök fick varierande resultat. Det bästa resultatet erhölls då inkuberingstiden vara densamma som anvisningarna för metoderna. Den första PCR-produkten med både primer OPAL 6: AAG CGT CCT C som forward och primer OP17: CCC AGC TGT G som revelse blev otydlig. Därefter testades alla primrar. Tabell 2: Primrar resultat Namn Primer Resultat OPK 16 GAG CGT CGA A Inget OPK17 CCC AGC TGT G Otydligt, Få OPK19 CAC AGG CGG A Otydligt, många OPK 9 CCC TAC CGA C Otydligt, Få OPAL 6 AAG CGT CCT C Tydligt, Många OPAL 12 CCC AGG CTA C Tydligt, Få OPAL 17 CCG CAA GTG T Otydligt, Få Den primer som gav bäst resultat var OPAL 6: AAG CGT CCT C. Alla primer testades i PCR-programmet 1: 41 cyklar 92 C i 1 minut, 37 C i 1 minut och 72 C i 2 minuter, därefter 72 C i 5 minuter (Black-Samulesson 1997). Tre program testades för PCR och dessa var: program 1: på 41 cyklar 92 C i 1 minut, 37 C i 1minut och 72 C i 2 minuter, därefter 72 C i 5 minuter (Black-Samulesson 1997) program 2: 92 C i 1 minut, därefter 41 cyklar 92 C i 15 sekunder, 37 C i 40 sekunder och 72 C i 45 sekunder, därefter 72 C i 5 minuter och program 3: 92 C i 1 minut, därefter 41 cyklar 92 C i 40 sekunder, 37 C i 40 sekunder och 72 C i 1 minut och 40 sekunder, därefter 72 C i 5 minuter.

18 12 Program 1 fungerade bäst med avseende på resultat, program 2 fungerade bäst med avseende på tid och program 3 fungerade bra med avseende på både tid och resultat. Därför valdes program 3 till att användas i laborationen. Både 1 %, 1,5 % och 2 % av agarose till agarosgel testades. Den koncentration som gav bäst resultat var 1,5 %. 3.2 Pilotstudie Under pilotstudien gjordes observationer på hur eleverna arbetade praktiskt under laborationen. Observationerna visade att eleverna jobbade aktivt och självgående. Det som också framkom under observationerna var att eleverna inte hade någon stor laborationserfarenhet. Detta syntes framförallt på osäkerhet vid allmänkunskap om vanlig laborationsmateriell samt vid pipetteteringsmomenten. I pilotstudien fick båda grupperna fram bra resultat. Jag har namngett grupperna till grupp 1 och grupp 2. Grupp 1 fick fram ett tydligt resultat där tre av fem salladsarter fick ett lyckat resultat. I grupp 1:s resultat går det att urskilja vilken sallad det är som är mördaren (figur 4). Grupp 2 har lite otydligare resultat. Men alla deras sallader har lyckade isoleringar och bra PCR- produkt. Det går att urskilja vilken det är som är mördaren. Däremot så blev deras stege (ett känt lambda-dna som storleksmarkör) inte lyckad samt att även deras negativa kontroll blev positiv. Båda grupperna har fått lyckade resultat. Figur 4. Resultat från grupp 1 i pilotstudien Figur 5. Resultat från grupp 2 i pilotstudien.

19 13 Nedan kommer jag redovisa enkätunderesökning i form av en tabell. Tabell 3. Resultat av enkätundersökning. Fråga 1. Har du gjort liknande laborationer? Svarsalternativ Elevsvar Fråga 2. har du haft intresse för genetik och genteknik tidigare Svarsalternativ Elevsvar Fråga 3. Har det varit roligt att göra laborationen mordet i salladsdisken? Svarsalternativ Elevsvar Fråga 4. Har intresset för genetik och genteknik ökat med denna laboration? Svarsalternativ Elevsvar Fråga 5. Har denna laboration gjort det lättare att förstå avsnittet om genetik och genteknik? Svarsalternativ Elevsvar Fråga 6. Är detta en laboration som du tycker att borde ingå i naturkunskap B? svarsalternativ Elevsvar

20 14 4 DISKUSSION Jag har valt att börja med att diskutera min metodutveckling och därefter kommer jag att diskutera pilotstudien. Detta för att så bra som möjligt besvara mina frågeställningar 4.1 Metodutveckling Under metodutvecklingen uppkom ett antal problem men inte bara problem utan med hjälp av lite tur och mycket hårt arbete kom även nästan lika många lösningar. Själva syftet med studien var att skapa en PCR-baserad laboration som är lämplig för gymnasiet. Laborationen ska också ha potential att öka gymnasieelevers intresse för genetik och genteknik. En av huvuduppgifterna var att laborationen inte får ta för lång tid. RAPD-metoden valdes ut på grund av just detta kriterium. För att få laborationen att bli så lämpad som möjligt för en gymnasieklass var tidsaspekten det väsentliga, och därför har mina val för att förbättra studien ofta varit för att korta ned tiden. Studiens första steg var att hitta en isoleringsmetod som fungerade bra. Första försöket med Chelexmetoden fungerade inte önskvärt och väntetiden för Dneasys isoleringskit för växter var lång. Detta gjorde att jag experimenterade med Chelexmetoden. Under dessa försök visade det sig att Chelexmetoden fungerade med nya reagenser, mindre del växtceller samt att dessa mosades. Troligtvis har Protinas K och DTT lättare att bryta ned växtcellerna när de är mosade. Laborationen går att göra med både Dneasy isoleringskit för växter och Chelexmetoden. Men anledningen att studien fortsatte med Chelexmetoden är att denna metod är både billigare och mer pedagogisk. Eleverna kan följa vad som händer på ett mycket bättre sätt under hela DNA-isoleringen. Under den första körningen med PCR använde jag två primer trots att det bara ska var en. Eftersom de flesta PCR-metoder används vanligtvis två primrar (Plieske & Struss 2001), en primer som forward och en som reverse (Plieske & Struss 2001). Detta gjorde att jag tog för givet att även denna metod utgår från detta men det visade sig att i RAPD-metoden använder man bara en primer (Williams et. al 1990). Detta ledde till att mina första resultat blev väldigt otydliga och värdefull tid försummades. Det positiva som uppkom i och med detta var att jag var tvungen att göra en felsökning då resultatet blev så pass dåligt. Tack vare detta upptäckte jag att endast en primer åt gången ska användas (Williams et. al 1990). Det som är speciellt för RAPD-primer är att annealingtemperaturen bara är 37 C (Black- Samuelsson 1997), vilket är lågt i jämförande med andra PCR-program där annealingtemperaturen normalt ligger på runt 45 C (Plieske & Struss 2001). Därför testades alla prover i PCR-programmet 1 (Black-Samuelsson 1997). Detta PCR-program tog över 4 timmar, vilket är för lång tid. Det viktiga för en gymnasieklass är att det inte blir tristess, och därför är det viktigt att försöka korta ned tiden. För att minska tiden gjordes försök att korta ned körningstiden i PCR-maskinen och detta utgör program 2. Program 2 tog bara två timmar att köra, men resultatet blev alldeles för suddigt och otydligt samt att det var fler salladsarter som inte gav något resultat. Därför testade jag ut ett nytt program som jag kallar för program 3. Detta är ett program som jag själv har utformat genom att studera PCR-program som är utformade för andra PCR-metoder. Genom detta kunde jag dra slutsatser om hur lång tid varje steg skulle vara i cyklerna samt vilken temperatur det skulle vara. Programmet tog lite under 3 timmar att köra och resultaten blev dugliga. Eftersom vi inte tidsmässigt kunde vänta på att få det bästa resultatet och inte tidsoptimera för mycket så att resultatet blir lidande så använde jag mig av mitt nyskapade program.

21 15 Denna laboration är mycket väl lämpad för gymnasielärare att använda för elever som läser naturkunskap B, kemi B eller biologi A. Laborationen verkar ha potential att öka intresset för genetik och genteknik, och det blir en naturlig diskussion med elever om begrepp som gener, primer, arvsmassa mm. Det som läraren ska tänka på är att ha denna laboration i slutet av genetikkapitlet då eleverna är bekant med begreppen eftersom det är väldigt många begrepp att hålla reda på. Det kan också vara bra att låta eleverna göra enkla experiment där man använder samma laborationsutrustning som i mordet i salladsdisken. Då tänker jag framförallt på till exempel pipettering. Är RAPD en lämplig metod för en genetiklaboration på gymnasiet? I enkätundersökningen svarade åtta av nio elever att mordet i salladsdisken borde vara med i naturkunskap B. Detta är en bra värdemätare för denna frågeställning. Jag tycker att RAPD är en utmärkt metod för gymnasieelever att komma i kontakt med ämnet genetik och genteknik. Med RAPD är det lätt att få bra resultat från DNA, samt att den är tidseffektiv i jämförandet med andra metoder för att studera genetisk variation på molekylär nivå (Williams et. al 1990). Med många andra metoder är man tvungen att använda restriktionsenzymer efter körningen med PCR-maskin. Restriktionsenzymet kapar då DNA-kedjan vid specifik nukleotidsekvens, och efter det finns det möjlighet att se om det finns variation mellan proverna. Detta steg behöver inte användas,i och därmed tjänar eleverna laborationstid. Nackdelen med RAPD är att resultatet inte blir exakt samma vid varje laborationstillfälle. Men är metodutvecklingen välgjord ska det vara tillförlitligt. Oavsett är det inte något problem eftersom det viktiga är att få variation mellan salladsarterna vid laborationen så att eleverna kan finna vilken mördaren är. Det är inte viktigt att DNAt mångfaldigas och resultatet visar bandmönster som är precis lika för nästa grupp av elever som gör laborationen mordet i salladsdisken, utan att de också får variation och kan finna vilken som är mördaren. Jag anser att laborationen är mycket väl lämpad att använda för gymnasielever som läser naturkunskap B, biologi A och kemi B. Detta då den påvisar stora pedagogiska fördelar genom naturliga diskussioner om många viktiga steg som sker i människokroppen på cellnivå. RAPD är en riktigt bra och enkel metod för gymnasieelever att komma i kontakt med genetik och genteknik. RAPD används inte i stor utsträckning eftersom metoden har fått mycket kritik för tillförlitligheten (Dongre & Parkhi 2005). Men i det syfte de används i denna laboration spelar tillförlitligheten inte någon roll. Det som är speciellt med RAPD primer är att dessa sätter sig slumpvis eftersom primern är relativt kort (Williams et. al 1990). Fördelen med detta är att RAPD primer ofta ger resultat och att det är lätt att se variation mellan individer. Läraren ska ha klart för sig innan laborationen startar att resultatet som tidigare fåtts på denna laboration kanske inte är samma resultat som man får om man kör laborationen igen. Detta då RAPD metoden inte är helt idiotsäker. Eftersom primern bara är 10 baspar (Williams et. al 1990) och en normal primer är ungefär 20 baspar (Plieske & Struss 2001) kommer RAPD primern att kunna passa på fler ställen i växtens DNA. Rent teoretiskt skulle primern kunna välja att sätta sig på andra ställen än den gjorde första gången. Jag har upplevt att resultaten har varierat mellan gångerna. Detta kan bero på en rad olika felkällor. Det är viktigt att använda samma reagenser varje gång samt att vara otroligt noggrann vid pipetteringarna så att det är samma mängder varje körning. Det finns även fler faktorer så som att använda samma sallader vid varje körning eftersom att det kan finnas inomarts variation mellan salladerna. Detta betyder att det kan finnas variation mellan olika individer av till exempel isbergssallad. På samma sätt som att två människor inte har exakt samma arvsmassa behöver inte häller två isbergssallader ha samma arvsmassa. Det som är viktigt vid alla laborationer är att likrikta så att alla laborationer blir precis lika.

22 Pilotstudie Under pilotstudien observerade jag elevernas uppträdande, samt om eleverna hade roligt och om de verkade intresserade. Det jag kom fram till i mina observationer var att eleverna var delaktiga och intresserade. Samtliga elever ville göra alla moment vilket ledde till att det tog längre tid än planerat. Tanken från början var att eleverna skulle dela upp arbetet i gruppen vilket hade lett till att laborationen utförts på kortare tid. Fördelen med att alla i gruppen utför alla steg i isoleringsmetoden är den pedagogiska aspekten. Isoleringsmetoden är ett bra sätt att förklara cellbiologi, alltså hur cellen är uppbyggd och hur Protinas K och DTT bryter ned cellerna för att komma åt DNAt som finns i cellerna. Det är en viktig del i själva laborationen att eleverna förstår vad som händer. Risken om det inte gör det är att de bara ser maskiner som spottar ut färdiga prover. Observationerna visade även att eleverna inte hade någon stor laborationsvana. Större delen av eleverna var osäkra under alla pipetteringsmoment. Detta ledde till att båda grupperna hade kunnat få fram bättre resultat. Men det är väldigt bra att pilotstudien visade att även elever med mindre laborationsvana klarar av att genomföra laborationen på ett bra sätt. I pilotstudien fick båda grupperna fram bra resultat (bild 4 och 5). Om bilderna 4 och 5 studeras syns det att i båda gruppernas resultat kan mördaren urskiljas från de misstänkta. Det som var viktigt med resultaten var att två grupper som inte har någon särskild laborationsvana klarar av att göra laborationen med bra resultat. Även om det finns detaljer i resultatet som kan diskuteras i grupp 1:s resultat är det svårt att avgöra om det är individ 2 eller 3 som är mördaren, samt att i grupp 2:s resultat är den negativa kontrollen positiv. Detta behöver inte betyda så mycket eftersom nästan alla deras individer har olika DNA. Men i grupp 2 kan man urskilja mördaren. Tillförlitligheten i dessa resultat är inte särskilt bra, men de räcker för att fylla laborationens syfte. Det som är viktigt med laborationen är att eleverna ökar intresset kring genetik och genteknik, och inte att de blir fullfjädrade mikrobiologer. I syfte som utlärningsmetod fungerar laborationen utmärkt, men det skulle aldrig gå att avslöja en mördare på riktigt med denna metod. Elevgruppen som gjorde pilotstudien fick svara på en enkät om laborationen, genetik och genteknik. Ur denna enkätundersökning framkom det många intressanta svar. På fråga ett om de hade gjort liknande laboration var det majoriteten av eleverna som inte hade gjort en liknande laboration (tabell 3). Det märktes även under själva laborationen då många av eleverna såg vilsna ut och de saknade erfarenhet av bland annat pipettering. På fråga två om de haft intresse för genetik och genteknik tidigare var svaren blandade, ingen instämde helt men ingen instämde inte alls (tabell 3). Om fråga två ställs mot fråga fyra så syns en markant ökning av intresset (tabell 3). Detta ser jag som lyckat för att besvara frågeställningen om intresset för genetik och genteknik ökar med Mordet i salladsdisken och enligt enkätundersökningen så steg intresset väsentligt. Enkätundersökning anser jag ha en hög validitet då frågorna i enkätundersökningen är relevanta och besvarar min frågeställning på ett bra sätt. Däremot har enkätundersökningen inte en hög reliabilitet eftersom att det bara var nio elever som deltog i pilotstudien. För att öka reliabilitet hade fler testgrupper behövt göra laborationen och svarat på enkäten. En felkälla kan även vara mitt eget intresse för genetik och genteknik vilket kan leda till att jag inspirerar eleverna i ämnet snarare än att laborationen i sig är intressant. Trots detta tycker jag att enkätundersökningen besvarar min frågeställning och jag anser att intresset för genetik och genteknik ökar med laborationen Mordet i salladsdisken.

23 17 Laborationen Mordet i salladsdisken kan optimeras ytterligare framförallt vad gäller tid. För detta skulle fortsatta studier behövas. Det är möjligt att ha olika varmvattenbad som eleverna doppar proverna i istället för PCR-maskin. Detta skulle medföra kortare tid eftersom maskinen tar tid på sig att höja och sänka temperaturen. För att få laborationen mer intressant skulle även historien runt själva laborationen kunna utvecklas. Jag anser att den även skulle vara väl lämpad till ämnesövergripande studier med tillexempel svenska, rättskunskap och till viss del även samhällskunskap. Detta genom att labborationsrapporter kan skrivas i svenska samt att brott och straff kan diskuteras i rättskunskap och samhällskunskap.

24 18 REFERENSER Allnutt T. R., Courtis J. R., Gardner M., Newton A. C. (2001) GENETIC VARIATION IN WILD CHILEAN AND CULTIVATED BRITISH POPULATIONS OF PODOCARPUS SALIGNUS D. DON (PODOCARPACEAE) EDINB. J. BOT. 58 (3): Bjerg J. (2000) Pedagogik en grundbok. Liber AB: Stockholm Black-Samuelsson S. (1997). Genetic Variation and Phenotypic Plasticity in the Rare plant Species Vicia pisiformis L. and V. dumetorum L. (Fabaceae). Uppsala. Doctoravhandling Brändén H. (2003). Molekylärbiologi 3:e uppl. Studentlitteratur. Lund. Campbell N. E, Reece J. B. (2005) Biology seventh edition. Pearson education Inc. San Franscisco. Clark A G, Lanigan f M. S., (1993) Prospects for Estimating Nucleotide Divergence with RAPDs. Molecular Biology and Evolution, Vol 10, Crockett P. A, Bhalla P. L, Lee C.K., Singh M. B.. (2000). RAPD analysis of seed purity in a commercialhybrid cabbage. Genome 43: (2000) Dongre A, Parkhi V. (2005). Identification of Cotton Hybrid through the Combination of PCR Based RAPD, ISSR and Microsatellite Markers. J. Plant Biochemistry & Biotechnology Vol. 14, 53-55, January 2005 Freeman S., Herron J. C. (2007) Evolutionary analysis Fourth edition. Perarson prentice hill. Upper saddle River. Friedt W, Snowdon R, Ordon F, Ahlemeyer J. (2007). Plant Breeding: Assessment of Genetic Diversity in Crop Plants and its Exploitation in Breeding. Springer Berlin Heidelberg. Progress in Botany. Häägg K. (2005) Metodutveckling av två genetiklaborationer för gymnasieskolan Manuell PCR på genen CCR-5 hos människa PCR-laboration på genen CHD hos fåglar. Gävle C- uppsats Lázaro A, Aguinagalde I. (1998). Genetic Diversity in Brassica oleracea L. (Cruciferae) and Wild Relatives (2n = 18) using RAPD Markers. Annals of Botany 82: 829±833 Li J.J., Pei G.L., Pang H.X, Bilderbeck A, Chen S.S., Tao S.H. (2006). A new method for RAPD primers selection based on primer bias in nucleotide sequence data. Journal of Biotechnology 126, Li Y. G., Dewald C. L., Sims P. L.. (1999) Genetic Relationships within Tripsacum as Detected by RAPD Variation. Annals of Botany 84: 695±702, 1999

25 19 Pettersson P. (2004) Metodutveckling av gymnasialt laborativt läromedel inom genteknik- PCR av genen CCR5. Gävle C- uppsats Plieske J, Struss D.. (2001). Microsatellite markers for genome analysis in Brassica. I. development in Brassica napus and abundance in Brassicaceae species. Theor Appl Genet 102: Sharma R, Mahla H.R, Mohapatra T, Bhargava S.C, Sharma M.M. (2003) Isolating Plant Genomic DNA Without Liquid Nitrogen. Plant Molecular Biology Reporter 21: 43 50, Strömberg S. (2006). Naturvetenskap, lärarutbildning och hållbar utveckling. Göteborg. D- uppsats Wallin A, Orlander C. Andersson B (2005) A content-oriented theory for teaching and learning biological evolution. Proceedings of the Fifth International ESERA on the Contributions of Research to Enhancing Students' Interest in Learning Science. (pp ). Barcelona, Spain. Williams J G.K., Kubelik A R., Livak K J, Rafalski J.A, Tingey S V.. (1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, Vol. 18, No [www dokument]. URL genteknik.nu (Hämtad ) [www dokument]: URL wikipedia.se bild 1: (Hämtad ) bild 2: (Hämtad ) [www dokument]. URL skolverket.se kursplaner för Naturkunskap B, Biologi A kemi B (Hämtad ) www dokument]. URL vr.se (Hämtad )

26 20 Bilaga 1 Onsdagen den 12 november kommer eleverna att göra en pilotstudie i en genetiklaboration som syftar till att öka elevernas inblick och intresse för genetik och genteknik. Eleverna kommer att extrahera DNA från olika typer av sallad. Härmed intygar eleven att resultatet får publiceras i C-uppsatsen. Elevens underskrift: Namnfötydligande: Tack på förhand Niklas Hedqvist lärarstuderande vid högskolan i Gävle

27 21 Bilaga 2 Enkät på laborationen mordet i salladsdisken 1. Har du tidigare gjort likande laborationer? Instämmer helt instämmer inte alls Har du haft intresse för genetik och genteknik tidigare? Instämmer helt instämmer inte alls Har det varit roligt att göra laborationen mordet i salladsdisken? Instämmer helt instämmer inte alls Har intresset för genetik och genteknik ökat med denna laboration? Instämmer helt instämmer inte alls Har denna laboration gjort det lättare att förstå avsnittet om genetik och genteknik? Instämmer helt instämmer inte alls Är detta en laboration som du tycker att borde ingå i naturkunskap B? Instämmer helt instämmer inte alls Tack för din medverkan Niklas Hedqvist lärarstuderande högskolan i Gävle

28 22 Bilaga 3 Mordet i grönsakslandet Det har nyligen skett i mord i salladsdisken i närbutiken. Kriminalkommissarien och hans kriminaltekniker har kunnat säkerställa DNA från förövaren från offret. Men på grund av varierande omställningar så har de inte tid att fortsätta med brottsgåtan utan de har hyrt in er till hjälp att lösa uppgiften. De finns ett antal misstänkta gärningsmän som har setts på mordplatsen vid den ungefärlig tid då mordet uträttades. Nu är er uppgift att genom en DNA analys av de olika gärningsmännen säkerställa vilken som är mördaren. Isolering av DNA Material: 5% chelex Protinas K 10mg/ml 1MDTT(dithiotreitol), i 0,1M NaAc ph5,2, sterilfiltrerat ddh 2 0 (sterilt destillerat vatten) Ependorfrör 1,5ml sterila med säkerhetslock Magnetomrörare och stavmagnet Värmeplatta och kastrull med vatten Vettenbad Centrifug Vortex Mortel och mortelskål Utförande: 1. Märk upp ett Ependorfrör ett för varje misstänkt gärningsman (salladstyp) 2. Sätt 10%chelex på magnetomröraren. 3. Blanda 210µl protinas K och 148µl DTT i ett sterilt Ependorfrör. Denna blandning räcker till 20 prover. Tillsätt 17 µl till varje uppmärkta Ependorfrör. 4. När 10%chelex är löst i burken tillsätts 200 µl till varje märkt eppendorfrör. Använd blå pipett och blå pipettspets ( µl) OBS TÄNK PÅ KONTIMINATIONSRISKEN 5. Använd mortel och mortelskål för att mosa de olika salladsarterna tillsätt mindre än 1mm 3 till varje märkt Ependorf-rör 6. Inkubera i 2 timmar i vattenbad som är 56 C 7. Se till att det finns kokande vatten när proverna är klar.

29 23 8. Skaka häftigt i vortex 10 sekunder. 9. Koka proverna i 7 minuter (för att deaktivera protinas K och DTT, OBS PASSA SÅ ATT INTE LOCKEN FLYGER AV. ) 10. Skaka häftigt i vortex 11. Centrifugera 3 minuter vid 12000x/min efter centrifugeringen är isoleringen färdig. Märk upp nya Ependorf-rör och pipettera 50µl av DNA-isolering (Sug upp DNA-isoleringen så nära pelletsen som möjligt.) Späd ut Isolering med 50 µl ddh 2 O. Isoleringen är nu helt klar och kan sparas i kyl eller frys. PCR Material: 10x buffert för dynazyme dntp 10mM Primer 10 µm Spermidin 10 µm DNA-Polymeras (Dynaxyme) Streilt Destilerat vatten (ddh 2 O) PCR-rör, sterila Pipettspetsar Is Låda Utförande: 1. Märk upp PCR-rör (ett för varje prov) 2. Ta fram reagenserna ur frysen och ställ dessa i ett isbad. Det är viktigt att alla reagenser hålls kylda hela tiden. Så fort de är använda ställs de tillbaka i frysen. 3. Pipettera 4 µl DNA-templat (DNA isolering) till varje märkt PCR-rör byt pipettspets mellan varje prov (OBS KONTIMINATIONSRISK!) 4. Blanda ordning en PCR-mix, (detta kan enventuellt förberades av läraren) så att det räcker till alla prover. Tillsätt enzymet sist (Dynazyme tas direkt ur frysen och så fort det är tillsatt så sätts det tillbaka i frysen.) när mixen är klar skakas den kort i Vortex. PCR-mix för 10 prover: 10x buffert 27,5 µl dntp 22 µl Primer 22 µl Speridin 5,5 µl ddh 2 O 160 µl Dynazyme 5,5 µl

30 24 5. Portionera ut 21 µl PCR-mix till varje märkt PCR-rör utan att doppa pipettspetsen byt pipettspets mellan varje prov. Håll proverna på is och gör detta moment så snabbt så möjligt. 6. Blanda med vortex och centrifugera snabbt så att det inte är något kvar på kanterna. 7. Placera rören i PCR maskinen och stäng locket. Skruva ner locket så att det ligger digtan mot PCR-rören. 8. Kör PCR maskinen med programmet RAPD Elekrofores Material: Agaros 1xTAE buffert E-kolv (250ml) Aluminiumfolie Mikrovågsugn Värmehandske PCR-produkt med färg Laddningsfärg DNA-Stege Gelform 10x20cm med gummiblock och kam Elektroforesapparat + nätaggregat och kontakter UV-bord Etidiumbromid i vattenbad i dragskåp OBS ETIDIUMBROMID ÄR GIFTIGT OCH MUTAGENT. VAR FÖRSIKTIG! ANVÄND HANSKAR, SKYDDSROCK OCH SKYDDSGLASÖGON. BYT HANDSKAR OM DU TAGIT I ETIDIUMBROMID ELLER FÄRGAD GEL. Utförande: 1. väg upp 0,75 gram agaros i en 250ml e-kolv. Tillsätt 75 ml 1xTAE buffert och skaka om så att agarosen suspenderas. Täck öppning med aluminiumfolie. Värm i mikrovågsugn i 1 minut. Skaka om agaros lösningen minst 3 gånger under uppvärmningen så att det inte bildar klumpar av agarosen. Se till så att den inte kokar över. När blandningen kokat upp så värm den ytterligare i 3 minuter på lägsta effekt. OBS ANVÄND VÄRMEHANDKSE UNDER HELA TIDEN. 2. Låt agarosen svalna i 5 minuter. 3. Gör i ordning gelformen: sätt på gummiblocken på korta gelformen och ställ in kammen på önskad plats. 4. När du kan hålla agorasen i handen utan att bränna dig häller du i den i gelformen. Ta bort eventuella luftbubblor med pastör pipett.