Laborationsrapport Receptorfarmakologi - glattmuskulatur Kurs: Hälsa och sjukdom, grundnivå 90 hp Basgrupp 12 Laboranter: Elina Arnemo eliar852@student.liu.se Victoria Arthursson vicar893@student.liu.se Ream Hassan riyha745@student.liu.se Laborationen utförd 30/1 2014 Inlämnad 10/2 2014 Reviderad version inlämnad 17/2 2014 Teoretisk bakgrund Kurskod: 8LAG20 Noradrenalin, en cathecolamin, är en av de två huvudsakliga neurotransmittorsubstansen i det autonoma nervsystemet. De receptorer som noradrenalin verkar på tillhör de adrenerga receptorerna. Det finns olika adrenerga receptorer; α1-, α2-, β1-, β2- och β3-receptorer och de har alla olika effekter vid agonistinbindning och återfinns i olika celler och vävnader. De receptorer som de antagonister vi använder oss av i denna laboration är selektiva för är α1 och α2. De är, liksom övriga adrenerga receptorer, G-proteinkopplade (1). Noradrenalin är en direkt adrenerg agonist, det vill säga interagerar direkt med och aktiverar adrenerga receptorer (2). Noradrenalin är agonist, med förmåga att mediera sina effekter via både α1-, α2-, β1- och β2-receptorer (1). Noradrenalin stimulerar primärt α1-receptorerna (3). Yohimbin är en α2-antagonist. Prazosin är främst en α1-antagoinst men även α2boch α2c-antagonist (2). Noradrenalinets effekter som medieras via α1-receptorn är bland annat vasokonstriktion och relaxation av glattmuskelceller i gastrointestinalkanalen (1). α1 är den receptor som huvudsakligen finns i vaskulära glattmuskelceller. Det finns även α2-receptorer men inte i samma utsträckning (4). Receptorerna i de vaskulära glattmuskelcellerna används där för att reglera blodtryck. Andra effekter som noradrenalin medierar via α2-receptorn är inhibition av transmittorfrisättning i CNS, inhibition av insulinfrisättning i de Langerhanska öarna och trombocytaggregation (1). Antagonister delas in i reversibla kompetitiva, irreversibla kompetitiva och non kompetitiva. Kompetitiva antagonister binder in till samma site som agonister och har låg efficacy, vilket betyder att de genom att binda in till receptorn ger lägre effekt vid samma dos agonist som utan antagonist närvarande. Reversibla kompetitiva antagonister binder som namnet antyder reversibelt till samma site som agonister. De förskjuter koncentration-responskurvor till höger utan att påverka maximal effekt eller lutning på kurvan. Ökade koncentrationer agonist kan överkomma reversibla kompetitiva antagonisters verkan (1, 2).
Irreversibla kompetitiva antagonister binder antingen kovalent eller på annat sätt starkt till samma bindningssite som agonisten och denna bindning släpper antingen inte alls eller mycket långsamt, varför irreversibla kompetitiva antagonister både förskjuter koncentration-responskurvor till höger samt har förmåga att sänka maximal respons. Eftersom antagonistens bindning till receptorn tar lång tid att dissociera eller inte gör det alls kan inte antagonisten överkommas av ökade koncentrationer agonist (2). Nonkompetitiva antagonister binder in allosterisk, det vill säga på annat site än agonisten. Där kan den modulera receptorns aktivitet utan att blockera agonistens inbindning. Detta leder till en minskad maximal effekt av agonist i närvaro av nonkompetitiv antagonist, men en nonkompetitiv antagonist måste inte också höja EC50 (2). EC50-värden anger vilken koncentration av agonist som ger upphov till 50 % av maximal effekt. Syftet med denna laboration var att utreda potens hos antagonisterna yohimbin och prazosin samt klassificera dem utefter receptortyp genom att utläsa EC50 på en dosresponskurva baserad på observationer på sex artärpeparat från djur. Materiel 6 organbad med varsitt artärpreparat Tensionsgivare kopplad till förstärkare och skrivare Krebs bikarbonatbuffert (innehållande bl.a. glukos, 95 % syre, 5 % koldioxid) 50 mg Noradrenalin, en α1- och α2-receptoragonist Prazosin, 1 mm, α1-receptorantagonist Yohimbin, 1 mm, α2-receptorantagonist Destillerat vatten Metodologi Tre spädningsserier bereddes, en med noradrenalin, en med prazosin och en med yohimbin. 50 mg Noradrenalin tillsattes till 15,659 ml destillerat vatten, vilket gav en koncentration av 10 mm (10-2 M). Denna lösning kallades därefter N1. Från N1 togs 100 μl som späddes med 900 μl Krebsbuffert, vilket gav upphov till en koncentration av 10-3 M, N3. Från N3 togs 100 μl som späddes med 900 μl buffert, och så vidare. Slutligen fanns 5 lösningar med följande koncentrationer noradrenalin: 10-2 (N1), 10-3 (N3), 10-4 (N5), 10-5 (N7) och 10-6 (N9). Från N1 togs därefter 0,3 ml som späddes med 0,7 ml buffert, vilket gav upphov till en koncentration på 3*10-3 M. Av denna lösning, N2, späddes 100 μl med 900 mikroliter buffert, vilket gav upphov till en koncentration på 3*10-4 M. Av denna lösning, N4, togs sedan 100 μl som späddes med 900 μl buffert för att ge upphov till en koncentration på 3*10-5 M, N6. Av N6 togs 100 μl som späddes med 900 μl buffert, vil-
ket gav en koncentration på 3*10-6 M, N8. För att få slutkoncentration 10-4 M i organbadet tillsattes i ett senare skede 300 μl av N1 till organbadet, denna tillsats kallades N:). För en slutkoncentration av 3*10-5 M i organbadet tillsattes i ett senare skede 90 μl av N1 till organbadet, denna tillsats kallades N0. Tabell 1: spädningsserie Noradrenalin. För spädning av prazosin togs 10 μl respektive 30 μl från en stamlösning med koncentrationen 1 mm. Dessa volymer späddes sedan med 990 μl respektive 970 μl Krebsbuffert för att ge upphov till koncentrationerna 10-5 M (P2) och 3*10-5 M (P1). Av P2 späddes sedan 100 μl med 900 μl buffert, vilket gav upphov till en koncentration på 10-6 M. Tabell 2: spädningsserie Prazosin. För spädning av yohimbin användes en stamlösning med koncentrationen 1 mm. Av denna späddes 10 μl respektive 30 μl med 990 μl respektive 970 μl Krebsbuffert för att ge upphov till koncentrationerna 10-5 och 3*10-5.
Tabell 3: spädningsserie Yohimbin. Organbaden (A1, A3, B0, B1, B2, B3), vari artärpreparaten spänts upp, tömdes på buffert med en vattensug, varefter ny buffert om ca 30 ml tillsattes. Till organbaden, som var kopplade till en tensionsgivare med tillhörande förstärkare och skrivare, tillsattes sedan 30 μl med varsin koncentration av antingen yohimbin eller prazosin. Ett av preparaten skulle komma att fungera som kontroll, varför vi inte tillsatte någon antagonist till det organbadet. Till A1 tillsattes 30 μl 3*10-5 M yohimbin (Y1), till A3 30 μl 10-5 M yohimbin (Y2), till B0, som användes som kontroll, tillsattes ingen antagonist. Till B1 tillsattes 30 μl 3*10-5 M prazosin (P1), till B2 30 μl 10-5 M prazosin (P2) och till B3 tillsattes 30 μl 10-6 M prazosin (P3). Vi väntade ca två minuter efter tillsats av antagonister innan vi tillsatte 30 μl av den lägsta dosen av noradrenalin, det vill säga N9, till alla organbad. Efter ytterligare ett par minuter tillsattes 30 μl N8 i alla organbad, varefter vi väntade ytterligare ett par minuter innan 30 μl av N7 tillsattes i alla organbad. Efter ytterligare ett par minuter tillsattes 30 μl N6, varefter förstärkningen för A1 och B0 ändrades till den halva. Förfarandet med tillsats av stigande koncentrationer noradrenalin och ett par minuters väntan mellan varje tillsats fortgick fram till efter den högsta koncentrationen, dvs N:), tillsattes. Eftersom preparaten inte är identiska och kan ha påverkats vid preparering och förvaring tillsattes slutligen en kaliumlösning för att ge maximal koncentration, som vi sedan kunde utgå ifrån för att beräkna procent av maximal kontraktion vid olika tillsatser av noradrenalin. Förstärkningen ändrades under laborationen ytterligare några gånger för alla preparat tills den slutligen var en femtedel av det ursprungliga för samtliga preparat. Tillsats av noradrenalin noterades kontinuerligt på graferna i skrivaren.
90 % Resultat Dos-respons-kurva Effekt (% av max-koncentration) 68 % 45 % 23 % B0 (kontroll) B1 (Prazosin: 10^-9) B2 (Prazosin: 10^-8) B3 (Prazosin: 3*10^-8) Y1 (Yohimbin: 10^-8) Y2 (Yohimbin: 3*10^-8) 0 % -9-8.5-8 -7.5-7 -6.5-6 -5.5-5 -4.5-4 Koncentration Koncentration (logm) EC50 Y2-3*10^-8 10 Diskussion EC50 beskriver vilken koncentration som man behöver av sin agonist, i detta fall noradrenalin, för att man ska få 50 % av maxeffekten, i vårt fall maxkontraktion. För att kunna göra detta måste man göra en dos-respons-kurva för att sina tester. För att det ska vara korrekt att ta ut ett EC50-värde måste kurvan i frågan vara sigmoid för att man ska få ett rätt värde. Alltså ska kurvan plana ut vid toppen så att man vet att agonisten når sin maxeffekt. I vårt fall är ingen av våra kurvor sigmoid vilket betyder att vi inte kan få ut ett korrekt EC50-värde. Den kurvan som mest sigmoid är Y2 (orange i diagrammet). Därför skulle man kunna ta ut ett ungefärligt EC50-värde på den kurvan. Dock ska man ha i åtanke att eftersom kurvan inte är fullkomligt sigmoid så är EC50-värdet troligtvis inte korrekt. EC50-värdet för Y2 är alltså ett ungefärligt värde. Enligt teorin så finns framförallt α1- men även α2-receptorer i glattmuskelcellerna i blodkärlen. Noradrenalin kommer att binda till både α1 och α2 och orsaka en vasokonstriktion. När vi sedan tillsätter prazosin som är en antagonist till noradrenalin och binder till huvudsakligen α1-receptorer (men även α2-receptorer) kommer noradrenalin och prazosin att tävla om inbindningssiten. Detta kommer leda till en högerförskjutning av kurvan. Högerförskjutningen beror på att en högre koncentration av
agonist i närvaro av antagonist behövs för att uppnå samma effekt som agonist utan antagonist. Ju högre koncentration av antagonisten vi kommer tillsätta i badet desto större högerförskjutning borde kurvan teoretiskt sett få. Enligt vår teori kommer en tillsättning av yohimbin (selektiv antagonist till α2-receptorer) inte ha samma effekt som prazosin, då α2-receptorerna inte är lika talrika i vaskulära glattmuskelceller som α1-receptorn samt att noradrenalin främst stimulerar α1-receptorer. Våra resultat var svåra att tyda i och med att EC50-värden ej kunde beräknas utifrån alla kurvor, att de lägre koncentrationerna av prazosin gav en högerförskjutning av kurvan medan den högsta koncentrationen försköt kurvan till vänster samt att båda koncentrationer yohimbin försköt kurvorna till vänster och vi har därför svårt att dra några slutsatser utifrån dem. Eftersom kurvan Y2 (den högsta koncentrationen yohimbin) planar av innan kontroll skulle det kunna tänkas att Y2 är en kompetitiv irreversibel eller nonkompetitiv antagonist eftersom det ser ut som att maxeffekten för Y2 borde vara lägre än för kontrollkurvan. Kompetitiva reversibla antagonister förskjuter endast kurvan åt höger men påverkar inte maximal effekt. Det är dock svårt att vara helt säker då alla kurvor inte planat av så att man kan jämföra maximala värden. På grund av att våra kurvor ej planade av kan inte maximala värden utläsas och därför kan heller inte EC50-värden beräknas. Vi kan inte jämföra EC50-värden och maximala värden och därför inte säga så mycket om antagonisterna. Dock kan förskjutningar i kurvan ses och utifrån dem kan vi se att de två lägre doserna prazosin motverkar noradrenalinets effekt, det vill säga förskjuter kurvorna till höger. Några tänkbara felkällor i vår laboration är möjligtvis vävnadspreparaten blivit olika stora vid dissektion. De kan också ha blivit skadade när de preparerades. En annan felkälla kan också vara att vävnadspreparaten blivit felmonterade. Alla dessa tre ovanstående felkällor kan ha resulterat i att uppmätt kontraktion i vävnadspreparaten inte blivit representativ. En annan felkälla är att vi räknat fel eller blandat fel i spädningsserien. Vi kan också ha tillsatt fel mängd eller fel koncentration vid fel tillfälle vilket resulterar i att dosrespons-kurvan blir fel vilket kan ge oss ett fel EC50-värde. Möjligt är också att det är detta som gett oss våra underliga kurvor. Vi upptäckte också att skrivaren eller förstärkaren till A3 (alltså Y2) hade någon typ av störning som gjorde att det hela tiden blev utslag fram och tillbaka. Detta kan möjligvis vara en indikator att förstärkaren eller skrivaren inte fungerade som de skulle vilken kan ha resulterat i fel värde. Det gjordes också flera omställningar av förstärkaren under laborationens gång. Ibland hoppade pennorna lite väl långt ner när förstärkaren ställdes om vilket vi tror möjligtvis kan ha resulterat i att kurvan inte är representativ. En annan självklar felkälla är också att vi kan ha läst av våra svar fel
vilket skulle ge oss en inkorrekt dos-respons-kurva. Källor 1. Rang, H.P., Dale, M.M. et al. (2011) Rang and Dale s Pharmacology. Elsevier 2. Katzung, Bertram G. et al. (2012) Basic and clinical pharmacology. McGraw-Hill 3. Constanzo, L (2014). Physiology. Elsevier 4. Walter F. Boron, Emile L. Boulpaep (2012) Medical Physiology, Elsevier/Saunders, s. 360.