Tetracyklin Figur 1: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=5497101&loc=ec_rcs Biologiska aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling 7,5 hp Apotekarprogrammet, HT-2010 Handledare: Christina Wedén Avdelning för farmakognosi, Institutionen för läkemedelskemi Uppsala universitet 1
Innehållsföreteckning Samamngfattning...3 Historisk bakgrund... 4 Hur och varför projektet startade...4-5 Metodbeskrivning för extraktion och isolering av substansen...5 Beskrivning av biologisk aktivitet...5-6 Läkemedelsutveckling...6-7 Klinisk effekt och användning...7-8 Disskusion...9 Referenslista...10 2
Sammanfattning Upptäcketen av antibiotika tillförde till medicinvärlden flera möjligheter och underlättade behandlingen av olika infektionssjukdomar, minskning av morbiditet och mortaliteten orsakad av dessa. Det revolutionära utvecklingen av förståelsen av olika biologiska processer och verkningsmekanismen av flera kemiska substanser, gav möjligheten att förstå hur dessa antibiotika fungerar och vilka resistensmekanismen som andra mikroorganisemer utvecklar mot dessa. Historiskt utgör upptäckten av pencillin 1928 en viktigt händelse inom behandlingen av infektionssjukdomar. Men antibiotika marknaden var dyr och begränsades till vissa grupper i befolkningen och användningen blev mer aktuell av militären i andra världskriget. Tetracykliner utgör en stor familj av antibiotika, upptäcktes år 1948 av forskaren Benjamin Duggar från en jordbakterien Streptomyces aureofaciens. De första medlemmarna i tetracyklinfamiljen var klortetracyklin och oxytetracyklin, dessa är bredspektrum antibiotika, de agerar mot ett stort antal mikrober med olika genetiska, fysiologiska och ekologiska bakgrund. Tetracykliner är bredspektrum antibiotika som attackerar gram positiva och gram negativa bakterier, också mot patogener som chlamydia, mycoplasma, rickettsier, och eukaryota protozoiska parasiter. Det speciella uppbyggnaden av tetracyklin molekyeln gör att den har hög modifierings möjligheter. Srukturen på tetracyklin molekylen har fördelen att kunna interagera med många kemiska, biologiska molekyler. Dessutom ger keto-enol funktionsgruppen, som finns på den ena sidan av molekyl grundstrukturen, en kelerande funktion av tvåvärdiga katjoner. Tetracykliner inhiberar bakteriell proteinsyntesen genom att hindra bindningen av aminoacyl-trna med bakterie ribosomen. Tetracyklinen bildar en komplex med tvåvärdig jon för att kunna gå igenom membrander i cellen och till slut interagerar med 30S ribosomala enheten. Nyligen har intresset ökat för de kemiskt modifierade tetracyklin derivater där dessa saknar den antimicrobiella effekten och särskiljer sig med att de saknar dimetylamino substitiuentgruppen i C4 positionen. Det unika strukturen på tetracyklin grundskelett gjorde den till lätt reagerbar med andra biologiska målorgan och möjligheten till modifiering öppnade möjligheten att hitta nya analoger och derivat av tetracyklinmolekylen med nya applicationsområden. Flera studier pågår för att se effekten av kemiskt modifierad tetracykliner speciellt dess effekt på MMP inhibition, av dessa substanser är COL-3. Tetracykliner verkar på flera sortersbakterier, och används bland annat vid behandling av akne, underlivsinfektioner, lunginflammationer, bihålsinflammationer när man har svikt i pencillin behandlingen eller allergi mot penicillin. Den kliniska användningen av tetracykliner ivolverar dess cheletande förmågan, inhibition av inflammation, proteolys, angiogenesis och som anti apoptotisk faktor. Dessutom har man undersökt tetracyklin molekylstrukturens effekt på cancer och metastaser. Det höga användningen av tetracykliner har lett till antibiotikaresistens utvecklingen och därmed begränsad användingen inom human medicin. Därför en fortsatt utveckling av tetracyklin analoger och kemiskt modifierade tetracyklin morlekyler har stor vikt på att hitta nya lösningar till resistensutvecklingsproblemet och för att hitta nya applicationsområden för tetracykliner i framtiden. 3
Historisk bakgrund Sedan upptäckten av antibiotika har stora förbättringar skett vad gäller behandling av infektions sjukdomar och därmed minskning i morbiditet och mortaliteten orsakad av dessa sjukdomar. Denna utvecklingen i medicin världen har grunden i att man hade skaffat bättre förståelse för de molekylär biologiska mekanismerna för olika process i kroppen, bättre förståelse för sjukdomars patofysiologi och hur läkemedel utövar sin mekanism på målorganen. Det revolutionära upptäckten av sulfonamid och pencilline antibiotikan, var inte direkt tillgänglig för allmänheten då kostnaderna var höga för dessa mediciner. Antibiotika reserverades bara för millitären i andra världs kriget.(alanis, 2005) Klortetracyklin och oxytetracyklin var de första tetracykliner som upptäcktes i slutet av 40-talet. Dessa är naturprodukter av bakterierna Streptomyces aureofaciens och S. rimosus. Senare upptäcktes andra naturligt förekommande tetracykliner från S. Aureofaciens, S. Rimosus och S. Viridofaciens. Det har också producerats semisyntetiska tetracykliner nämligen doxycyklin, metacyclin och minocyklin. Semisyntetiska analoger till tetracykliner har fått stor framgång då dessa är mer vattenlösliga, och har hör absorption, detta ger dem möjligheten att adminstreras parenteralt.( Chopra and Roberts, 2001) Under samma period då man isolerade tetracykliner som fermentation produkter från jord bakterier kunde man observera att fermentations produkter av Streptomyces aureofaciens ledde till höns tillväxt och därmed användes inom jordbruks industrin. År 1953 isolerades den först bakterie stammen av Shigella dysenteriae som skapade tetracyklin antibiotikaresistens. Senare under 1955 isolerades multiresistenta shigella arter som hade tetracyklin resistens. Under 80-talet identifierades resistensmekanismen som Escherichia coli skapade mot tetracykliner, därefter framkom flourokinoloner som annan antimikrobiell klass som gjorde att tetracykliner misnkades i klinisk användning.(zakari and Wright, 2008) Hur och varför projektet startade Tetracykliner är en stor familj av antibiotika som upptäcktes år 1948 av forskaren Benjamin Duggar från en jord bakterie, Streptomyces aureofaciens, denna bakterie arten producerar flera naturprodukter inkluderad tetracykliner. Man isolerade substansen som en jäsningsprodukt och år 1954 renades den första kemiska tetracyklinen molekylen så kallad klortetracyklin. Det effektiva isoleringen av tetracykliner gjort att antibiotikan användes i hög utsträckning i human och djur medicin, också inom vattenbruk och som djurtillväxt befrämjande medel.(spadin and Fleischmajer, 2006) De första medlemmarna i tetracyklinfamiljen var klortetracyklin och oxytetracyklin, dessa är bredspektrum antibiotika, de agerar mot ett stort antal mikrober med olika genetiska, fysiologiska och ekologiska bakgrund. Upptäckten av dessa genom naturprodukt screeningprogram har gjort att dessa substanser fick stort intresse inom farmaceutisk bruk och industri. Utöver det biologiska effekten har det billiga, enkla produktionen dessutom de få 4
biverkningar och det höga biotillgängligheten va orsaken att dessa användes som första hands medel mot olika bekteriella infektioner. (Zakari and Wright, 2008) Metodbeskrivning av extraktion och isolering av substansen Det ständiga utvecklingen av antibiotika resistensen gör behovet av nya antibiotika stort. Då behadlingen av många sjukdomar är baserad på användningen av dessa naturliga läkemedel. Bland de patogener som skapat resistens är meticillinresistenta Staphylococcus aureus, vankomycinresistenta Staphylococcus aureus, E.coli, Klebsiella sp., pseudomonas aeruginosa och multiresistenta Mycoplasma tuberculosis. En actinomycete stam, Streptomyces hygroscopicu subsp.ossamyceticus (stam D10) isolerades från jord i Rajasthan år 2006. Det har visat att denna stam producerade en gul färgämne med en antibiotika verkna. Råmaterialet producerades av D10 stammen genom solid state fermentation. Stammen odlades på en jäst extrakt och malt extrakt av agar i 7 dagar under 28 ºC för att användas i vidare studier.den biologiska aktiviteten studerades av detta pigment ämne och visade att den hade antimicrobiella effekter på multiresistenta patogener men inte på pseudomonas aeruginosa. Produktionen av färgämnet skedde genom torr fermentation, det har visar att den är bättre för produktionen av antibiotikan än vattenbaserad jäsning i en andra studier gjorda innan på stam D10. Här beredde inokulatet av actinomycete stammen D10 på jäst extrakt malt agar extrakt plattor, mediumet kallades för ISP2 medium, inkubationen skedde i fem dagar under 28 ºC varmt. Efter bildningen av sporer togs dessa och inkuberade i 50 ml jästextrak maltextrak medium. Medium buljoongen inkuberades under rotationen för 48 timmar under rotation hastigheten 120 rpm under 28 grader miljö. Sedan tillsattes 10g vetekli till 250ml E-kolv med 5 ml destillerat och steriliserat vatten. 10 % av inokulatet lades till E-kolv bereddningen och inkudberades i 28 ºC under 10 dagar. För att extrahera den aktiva substansen blandas jäsningsblandingen med 50ml etylacetat. Man har standariserat etylacetaten som en lämplig lösningsmedel för extraheringen av pigmentämnet som samalades och koncentrerades genom avdunstning. Vikten av det råa färgämnet (antibiotikan) mättes och förvarades i sterila injektionsflaskor. För reningen användes tunnskiktskromatografi med kiselgel täckt platta, man provade olika lösningsmedel i olika proportioner för att se det bästa separationen. Det visade att pigmentet löste upp sig i 200 µl etylacetat. Det visade att en godseparation nåddes också med kloroform:metanol(30:70). Med hjälp av bioautoradiografi kunde man detektera den aktiva substansen i TLC plattan. Beskrivning av biologisk aktivitet Det speciella uppbyggnaden av tetracyklin molekyeln gör att den har hög modifierings möjligheter. Srukturen på tetracyklin molekylen har fördelen att kunna interagera med många kemiska, biologiska molekyler. Dessutom ger keto-enol funktionsgruppen, som finns på den ena sidan av molekyl grundstrukturen, en kelerande funktion av tvåvärdiga katjoner. Det kemiskabiologiska funktionen av tetracyklin antibiotika har studerats i stor skala dock finn flera aspekter om deras struktur-aktivitet samband som fortfarande inte är förklarade. Tetracykliner är bredspektrum antibiotika som attackerar gram positiva och gram negativa bakterier, också mot patogener som chlamydia, mycoplasma, rickettsier, och eukaryota protozoiska parasiter. (Zakari and Wright, 2008) 5
Tetracykliner inhiberar bakteriell proteinsyntesen genom att hindra bindningen av aminoacyltrna med bakterie ribosomen. För att dessa substanser skall kunna binda till sina målmolekyler måste de genomträngas igenom en viss antal membraner beroende på om bakterien är gram negativ eller gram positiv. Tetracyklinmolekylen går igenom membranporer OmpF och OmpC som en positivladdad katjon. Tetracyklin molekylen bildar en komplex med magnesiumjonen. Denna komplex behövs för att substansen skall kunna gå igenom det yttre membranet där komplexet samlas i periplasman sedan sker en jondissociation. En svag lipofil ickeladdad tetracyklin molekylen diffunderar igenom lipid lagret av det inre membranet i cytoplasman. Sedan kelaterar molekylen en magnesiumjon för att den nybildade komplexet binder till ribosomen. Accociationen av tetracyklin och ribosomen är reversibel, detta förklarar den bakteriostatiska effekten.(chopra and Roberts, 2001) Tetracykliner interagerar med en ribosomala enhet nämligen 30S. Sedan 60-talet flera studier har gjorts för att förklara denna interaktionen, in vitro biokemiska analyser, interaktions och verkningsmekanism studier, UV inducerad cross-link studier. Man kunde besvara flera frågor angående bindningen av tetracyklin till ribosom enheten i cellen. År 2000 publicerades den första modellen av Brodersen et al. av en kristal struktur av tetracyklin molekylen som bildade komplex med små ribosomala subenheter. I en anna studie av Pioletti et al. 2001 visade modellen att tetracyklin band till sex bindningställen på 30S ribosom enheten. I bägge studierna visades att bindningställen ligger nära A sätet i ribosomen och därmed förklaras verkningsmekanismen av att tetracyklin hindrar bindningen av trna bindningen till A sätet i ribosomen. (Zakari and Wright, 2008) Läkemedelsutveckling Tetracyklin molekylen består av ett tetracyklisk naftacinkarboxamid ringsystem i sin kemiska struktur. Antibiotika effekten kommer från dimetylamin gruppen på kol 4 i ring A. Det har visat att borttagningen av denna grupp leder till minskad antibiotika effekt i molekylen. Härifrån kommer ideen att göra modifierade molekyler med andra egenskaper. Genom att ändra på de substituenter som sitter i ringsystemet kan man minska eller förstärka de antibacteriella egenskaperna hos tetracyklin molekylen. (Spadin and Fleischmajer, 2006) Tetracykliner indelas i tre klasser där den första inkluderar de äldre tetracyklinerna klortetracyklin, oxytetracyklin, den andra klassen är de semisyntetiska tetracykliner tex demecleocyklin, metacyklin. Den tredje gruppen innehåller nyare tetracykliner som tex doxycyklin och minocyklin, dessa tillhör de andra generationen av tetracykliner där man har förbättrat den antibakteriella effekten och farmakokinetiken av dessa substanser. Nyligen har intresset ökat för de kemiskt modifierade tetracyklin derivater där dessa saknar den antimicrobiella effekten och särskiljer sig med att de saknar dimetylamino substitiuentgruppen i C4 positionen.(tsankov et al, 2003) För att behandla antibiotikaresistenas problemet vände man sig till att uttnyttja strukturen på tetracyklin molekylen. På grund av modifieringsförmågan hos molekylstrukturen kunde man utveckla analoger, semisyntetiska tetracykliner tex doxycyklin som är lipofila och har bättre absorption i kroppen. Det har utvecklats tredje gerneration tetracykliner där semisyntetisk 6
glycyclin och aminometylcyklin är under klinisk forskning. Det har visat att en modifieras glycykliner kallad tigecyklin förbättrade interaktionen med ribosomen dessutom minskade effflux resistensmekanismerna mot tetracykliner. ( Pickens and Tang, 2009) Det finns ökad intresse i utvecklingen av efflux pump inhibitorer för att rädda de äldre tetracykliner från resistesmekanismerna som utvecklades mot dem. Glycyklin analoger är ett exempel på sådana molekyler som är under klinisk prövning och som utgör en av framtida hoppet mot resistens problemet. Det unika strukturen på tetracyklin grundskelett gjorde den till lätt reagerbar med andra biologiska målorgan och möjligheten till modifiering öppnade möjligheten att hitta nya analoger och derivat av tetracyklinmolekylen med nya applicationsområden. Flera studier pågår för att se effekten av kemiskt modifierad tetracykliner speciellt dess effekt på MMP inhibition, av dessa substanser är COL-3. Denna substans saknar substituenter i sin C4-C9 positioner i sin tetracyklin grundstruktur skelett. I fas I kliniska studier visade COL-3 stabilisering i en sort av malign cancer, substansen visade inhibitorisk effekt på MMP. ( Chopra and Roberts, 2001) och (Spadin and Fleischmajer, 2006) Klinisk effekt och användning Användningen av tetracyklin antibiotika begränsades inte bara på den antimicrobiella effekten utan användes sedan den tidiga 50-talet mot icke infektiösa sjukdomar. Den kliniska användningen av tetracykliner inkluderar dess cheletande förmågan, inhibition av inflammation, proteolys, angiogenesis och som anti apoptotisk faktor. Dessutom har man undersökt tetracyklin molekylstrukturens effekt på cancer och metastaser. Det har visat att analoger till tetracyklin är potenta inhibitorer till metalloproteinas. Det höga användningen av tetracykliner har lett till antibiotikaresistens utvecklingen och därmed begränsad användingen inom human medicin. (Zakari and Wright, 2008) Tetracykliner verkar på flera sortersbakterier, och används bland annat vid behandling av akne, underlivsinfektioner, lunginflammationer, bihålsinflammationer när man har svikt i pencillin behandlingen eller allergi mot penicillin.(www.1177.se ) Tetracykliner används också i behandingen av infektionssjukdomar hos djur, och inom vetenärmedicinen adminstreras medicinen genom mat, vatten eller luft. Dessutom kan den användas i djur foder då man vill förbättra djurens tillväxt hastigheten matnings effektivitet, alltså förbättra tillväxten med mindre behov till mat. Mekanismen bakom denna effekt är inte förklarad än men det har visat att en ökning av vitamin produktionen av vissa microorganismer i magtarmkanalen och ökning av absorptionen av olika näringsämnen i tarmen. (Chopra and Roberts, 2001) Tetracyklin har visat icke antibakteriella effekter tex effekten på inflammatoriska celler där den visade en effekt på inhibitionen av COX-2 medierad prostaglandin E2 produktion detta förklarar den antiinflammatoriska effekten. Nya resultat visade tetracyklin effekt på nedreglering av tripsinogen 2 uttrycket som är förknippad med minskad cancer cell migrering. Vid 7
behandling av bakteriell infektion utgör tetracykliner en bra behandling mot gram negativa och grampositiva bakterier tex Borrelia burgdorferi som orsakar borrelia, Mycoplasma och Chlamydia som leder till könssjukdomar, protozoer som orsakar malaria. (Tzankov et al, 2003) Tetracyklin används i behandlingen av flera hudsjukdomar, och utgör första hands behandling vid acne. Det har visar att doxycyklin, tetracyklin och minocyklin är effektiva vid behandlingen av acne speciellt vid den inflammatoriska stadiet av sjukdomen. Verkningsmekanismen relateras till att antibiotikan hindrar bakterien som orsakar acne genom att minska fri talg och fria fettsyror och extracellulä fett. Dessutom kan den reducera neutrofila som lagrar MMP- 9(metalloproteinase) en endopeptidas viktig för membrancollagen nedbrytningen. Här har tetracyklinen uppgiften att hindra nedbrytningen av peptidbindning mellan collagenen. (Spadin and Fleischmajer, 2006) och (Tzankov et al, 2003) I behandlingen av autoimmuna och anti inflammatoriska sjukdomar kan tetracykliner ha en viss effekt vad gäller behandlingen av dessa. Rheumatoid artirit är en kronisk inflammatorisk sjukdom, orsken till denna sjukdom är inte helt förklarad än men en märkbar nedbrytning av collagenen lederna kan förklara en bit av teorin bakom sjukdomen. I en studie där man adminstrerade minocyklin till artirit inducerade möss visade att minocyklin hade reducerande förmåga på collagenesen. (Tzankov et al, 2003) Nyligen har man också börjat studera effekten av tetracykliner i cancer behandlingen. MMP matrix metalloproteinases som är en zink beroende endopeptidase som degraderar extracellulär matrix. Under cancer forloppet ökar MMP i den omkringliggande vävnaden där den ökar nedbrytningen av den basala membranet av blodkärlen som i sin tur ökar migrationen av tumörcellerna och därmed når blodströmmen. Troligen kelaterar tetracyklin molekylen Zn 2+ som är en viktig cofaktor för MMP för att den skall fungera, men också har tetracykliner effekt på MMP uttryck i cellen. ( Chopra and Roberts, 2001) och (Spadin and Fleischmajer, 2006) 8
Disskusion Det revolutionära upptäckten av antibiotikan medförde stor hjälp i att behandla infekttiln sjukdomar och rädda många liv. Intresset har ökat för dessa läkemedel då dessa var billiga att producera och lätt att isolera. Utöver det biologiska effekten har det billiga, enkla produktionen dessutom de få biverkningar och det höga biotillgängligheten var orsaken att dessa användes som första hands medel mot olika bakteriella infektioner Tetracykliner är bredspektrum antibiotika, upptäcktes år 1948 av forskaren Benjamin Duggar från en jord bakterie, Streptomyces aureofaciens. Man isolerade substansen som en jäsningsprodukt och år 1954 renades den första kemiska tetracyklinen molekylen så kallad klortetracyklin. Det effektiva isoleringen av tetracykliner gjort att antibiotikan användes i hög utsträckning i human och djur medicin, också inom vatten och jordbruket bland annat som djurtillväxt befrämjande medel. Tetracykliner verkar på flera sortersbakterier, och används bland annat vid behandling av akne, underlivsinfektioner, lunginflammationer, bihålsinflammationer när man har svikt i pencillin behandlingen eller allergi mot penicillin Resistentutvecklingen bildades av olika patogener mot tetracykliner pga det höga användningen av dessa i human och djur medicin. Man har kunnat också använda tetracykliner i behandlingen av dermatologiska sjukdomar och visade ha effekter som antiinflammatoriska. För att fastställa dessa effekter och dess verkningsmekanismer borde flera labboratoriska och kliniska studier utföras. Det speciella uppbyggnaden av tetracyklin molekyeln gör att det finns flera möjligheter till modifiering av molekylen och därmed kunna studera nya applicationsområden och nya biologiska bindningställen. Framtiden för tetracykliner är lovande då flera studier och klinisk forskning pågår för att hitta nya användningsområden än behandlingen av infektiösa sjukdomar. Det är viktigt att behandla resistensutvecklingen mot tetracykliner genom att tex studera resistensmekanismerna, utveckla nya tetracyklin analoger, tillverka semisyntetiska, eller syntetiska derivater av tetracykliner. Också hitta på molekyler som kan fungera som inhibitorer mot olika resistensutvecklings mekanismer. Nyligen har man satsat på att förstå effekten av olika tetracykliner på MMP (matrix metalloproteinases) som har en koppling till cancer utvecklingen. Kliniska studier på kemiskt modiferade tetracyklingen pågår och nya resultat visar effekten av dessa på inhibitionen av MMP faktorn. Därför är det viktigt med fortsatt forskning för att förstå verkningsmekanismen bakom dessa modifierade molekylerna och ens användning i behadlingen av farliga sjukdomar som cancer. Naturen erbjder stor mångfald av substanser och microorganismer som i ständig evolution och utveckling av sina försvarmekanismer, resistensutveckling och natur produkters tillverkning. Därför är det viktigt att satsa olika resurser och arbete på att forska i farmakognosins värld och försöka utnyttja de naturliga produkterna i tex behandlingen av sjukdomar och vidare i behandlingen av svårt behandlade sjukdomar som cancer och andra infektionssjukdomar. Man ska inte heller glömma vikten av fortsatt naturläkemedelsutvecklingen och forskningen i att hitta nya substanser, derivater av naturprodukter eller modifierade kemiska molekyler för att hitta nya indikationsoch användningsområden för behandling av sjukdomar. 9
Referenser Alanis, A. J., Resistance to Antibiotics:Are we in the post-antibiotic era?. Archives of medical research 36(2005) 697-705. Chopra, I. and Roberts, M. Tetracycline Antibiotics:Mode of action, Applications, Molecular Biologi, and Epidemioloy of Bacterial Resistance. Microbiologi and molecular biologi reviews, june 2001, p. 232-260, vol.65, No.2 Pickens, L. B. and Tang, Y. Decoding and engineering tetracycline biosynthesis. Metabolic engineering 11(2009) 69-75. Sapadin, A., N., MD, and Fleischmajer, R., MD (2006) Tetracyclines:Nonantibiotic properties and their clinical implications. J Am Acad Dermatol; 54:258-65. Selvameenal, L., Radhakrishnan, M. and Balagurunathan, R. Antibiotic Pigment from Desert soil Actinomycetes; Biological Activity, Purifcation and Chemical Screening. Indian J Pharm Sci, 2009; 71(5): 499-504 Tsankov, N., Broshtilova, V. and Kazandjieva, J. Tetracyclines in Dermatology. Clinics in dermatology 2003; 21:33-39. Zakeri, B. And Wright, G., D. (2008) Chemical biology of tetracycline antibiotics. Biochem. Cell Biol. 86:124-136. Figur 1: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=5497101&loc=ec_rcs http://www.1177.se/artikel.asp?categoryid=30229 besökt måndag 20100920, kl 20.36 10