2003-06-03 24-hour Metabolism Ett arbete i Biokemi kursen vt. 2003 Sofia Bertolino Annlouise Mickelsen Handledare: Tom Taylor Supervisor: Stefan Knight Inlämnat: Den 3 juni 2003
24-hour metabolism, Vad händer? Inledning Vi ska nu presentera ett arbete om fettsyror och dess metabolism. Vi kommer att ta upp hur fett bryts ner i kroppen och hur det syntetiseras. Nedbrytningen kan ta olika vägar beroende på hur de övriga näringsämnena i kroppen är balanserade. Vi kommer sedan att gå igenom de större övergripande stegen i metabolismen under ett dygn. Detta representeras av tre stadium the fed state, the early fasting state och the refed state. I den sistnämnda förklarar vi vad som händer i kroppen när magen får mat igen efter en natts fasta. Men vad händer om vi inte får mat igen? Svar på detta ges vidare utifrån ett metaboliskt perspektiv. Arbetet avslutas med en beskrivning av ett huvudenzym i fettsyra metabolismen, vid namn Carnitin acetyltransferas, som hjälper till i nedbrytningen av fettsyror med långa kolkedjor. Bakgrund När vi till vardags pratar om fett är det oftast triacylglycerol vi menar. I detta arbetet kommer vi att benämna triacylglyceroler för ett lite enklare namn nämligen triglycerider. Byggstenarna i fett består av en glycerol molekyl och tre fettsyra molekyler. En vatten molekyl försvinner för varje fettsyra som binds till glycerolet. Fett används av kroppen som bla lagring av energi. För att komma åt fettet i fettcellerna och omvandla detta till energi, krävs vissa åtgärder. För det första måste fettet mobiliseras, i den här processen omvandlas triacylglycerol till glycerol och fria fettsyror, som sen frigörs från fettcellerna och transporteras till de energi krävande vävnaderna. Fettsyrorna måste också aktiveras och transporteras till mitokondrierna för vidare nedbrytning. Fettsyrorna bryts ner till acetyl CoA, som sen går in i citron syra cykeln. Bild 1. Schematisk bild på de olika reaktionsvägarna för fettsyror i muskler. Triglyceridens väg genom kroppen Fettet vi får i oss genom maten består ofta av triglycerider. Dessa hydrolyseras ner till glycerol och fria fettsyror, innan de kan absorberas av mag och tarmkanalen. När de väl
har blivit absorberade av tarmmembranen, syntetiseras dem igen och sedan böjar transporten av triglycerider till övriga celler i kroppen. Innan de tas upp av tex fett eller muskelvävnad måste de sönderdelas igen och sen sker transporten av dessa in till cellen. Även här sker en syntetisering av fettsyror och glycerol till triclycerider. Oxidation av fettsyror Det kan komma tider då kroppen behöver extra energi i form av fett. Musklerna oxiderar då dessa fettsyror. Denna process beskrivs vidare i oxidation av fettsyror. Fettsyrenedbrytningen sker i mitokondrierna och startar med en oxidation. Vid denna oxidation bildas en dubbelbindning mellan _- och _-kolatomerna. Coenzym i det enzym som katalyserar denna reaktion är FAD. Med hjälp av ett annat enzym adderas vatten till dubbelbindningen (hydratisering). Vattnets hydroxidgrupp binds till _-kolatomen och vätet till _-kolatomen. Nästa steg i nedbrytningen innebär ytterligare en oxidation med NAD + som coenzym, varvid syreatomen binds med en dubbelbindning till _-kolatomen. Slutprodukt vid _-oxidationen är en _-ketoförening av den aktiverade fettsyran, R-CH 2 - CO~S-CoA. Denna reagerar med ytterligare en molekyl coenzym A, varvid acetyl-coa och en aktiverad fettsyra, två kolatomer kortare än den ursprungliga bildas. Denna avkortade fettsyra-coa oxideras på nytt, reagerar med ännu en CoA-SH så att acetyl- CoA samt en ny avkortad fettsyra-coa bildas osv tills hela fettsyran har överförts till acetyl-coa. Den fortsatta nedbrytningen av acetyl-coa sker i citronsyracykeln. Glycerol överförs genom en serie reaktioner till glyceraldehyd-3-fosfat. Nedbrytning av glyceraldehyd-3-fosfat fortsätter sedan i glykolysen. Biosyntes av fettsyror Biosyntesen av fettsyror sker i cytoplasman. Den är i princip omvändningen av _- oxidationen men katalyseras av helt andra enzymer. Fettsyresyntesen är en cyklisk process bestående av fyra reaktioner. Två av dessa är reduktioner och i båda fungerar coenzymet NADPH som reduktionsmedel. I fettsyresyntesen adderas två kol per varv, vilket förklarar varför de flesta biologiskt förekommande fettsyrorna innehåller ett jämnt antal kolatomer. Slutprodukten i fettsyresyntesen är palmitinsyra, som sedan kan förlängas i andra reaktionssekvenser. Även bildning av dubbelbindningar sker i andra processer, men vi människor kan inte bilda fleromättade fettsyror (essentiella). De syntetiserade fettsyrorna kan sedan komma att ingå antingen i neutrallipider eller i fosfolipider. I båda fallen sker en förestring av glycerol med fettsyrorna, och dessa reaktioner sker i endoplasmatiska nätverket.
24-hour metabolism cykeln. Under en dag ändras de biokemiska processerna flera gånger. Från nedbrytning till uppbyggning. De metaboliska vägarna inhiberas och aktiveras till följd av fysiologiska förhållanden. Vi ska nu gå igenom tre stora händelser som utspelas under ett dygn. Det börjar med the fed state. Detta representerar leverns respons på en intagen måltid. Vidare undernatten tar glukoslagren slut och levern byter mode. Detta representeras i the early fasting state. Åter på morgonen får magen i sig mat igen och detta representeras i The refed state. 1.Well fed state. - Maten är klar ropar pappa från köket. Redan i hallen känner jag lukten av nybakad pizza. Ohh, calzone! Jag sätter mig vid bordet och framför mig ligger denna stora flottiga pizza som bara väntar på att få bli uppäten. Lukten, synen och smaken skickar signaler till parasympatiska nervsystemet om att det är dags att äta. Jag ska ta det lugnt, njuta. Den första tuggan är underbar. Proteinerna och glukosen transporteras sedan från magen till blodet. När glukosen närmar sig bukspottkörteln stimuleras speciella B- celler. Dessa celler börjar utsöndra hormonet insulin. Insulin signalerar till kroppen att den ska lagra glukos och bygga upp olika proteiner. Levern hjälper till att sänka halten glukos i blodet när glukoshalten är hög, genom att absorbera glukos. Glukosen lagras sedan i levern i form utav glykogen, för användning när kroppen är i behov av glukos. Insulin har också en generellt stimulerande effekt på proteinsyntesen. Detta i sin tur skapar gynnsammare förutsättningar för uppbyggnaden av muskelprotein. Alltså, Efter en måltid är kroppens huvudsakliga mål att lagra glukos i form av glykogen och upptaget av aminosyror för uppbyggnad av protein. 2. The early fasting state. Några timmar efter en måltid sänks nivån glukos i blodet. Detta leder i sin tur till att utsöndringen av insulin avtar. Den låga nivån av glukos i blodet aktiverar a-celler i bukspottkörteln och utsöndrar istället ett annat hormon vid namn glukagon. Glukagon stimulerar glykogen nedbrytning och inhiberar glykogensyntesen. Glukagon inhiberar också fettsyrasyntesen genom att minska produktionen av pyruvat och genom att sänka aktiviteten av Acetyl CoA carboxylase. Glukagon stimulerar glukoneogenes i levern och blockerar glykolysen. Den stora mängden glukos som är formad genom hydrolys av glukos-6-fosfat från glykogen tas upp av blodet. Upptaget av glukos till muskel- och fett vävnad sänks som ett svar till den sjunkande insulinnivån. Huvud målet för glukagon är att öka utsöndringen av glukos från levern. När blodglukosnivån sänks använder muskler och levern fettsyror för att få energi. Pga detta borde nivån glukos i blodet hållas över 80 mg/dl. Detta görs av tre huvudfaktorer :
1. mobiliseringen av glykogen och utsöndringen av glukos i levern, 2, utsöndring av fettsyror från fettvävnad, 3, muskler och levern utvinner energi från fettsyror istället för glukos. När glukosen tar slut i levern, aktiveras glukoneogenesen. Denna är i behov av en kolkälla som kan förse syntesen av glukos med kol. En av dessa kol källor är glycerol som är produkt vid lipolysen. Resten av kolet kommer från hydrolysen av muskel protein. Alltså, När blodsocker nivån sänks, utsöndrar bukspottkörteln glukagon. Detta hormon har som uppgift att öka utsöndringen av glukos i levern. Fettsyror utsöndras från fettvävnad och en ändring i energi utvinning i muskler och lever sker, från glukos till fettsyror. 3. The refed state. Denna fas representerar frukosten efter en natts fasta. Fett lagras som det gör i the fed state, men detta gäller inte för glukos. Levern börjar inte att uppta glukos från blodet, utan lämnar glukosen för periferal vävnad. Levern fortsätter att syntetisera glukos. Denna används för att fylla på det minskade glykogen lagren. Under tiden blodglukosnivån börjar öka slutför levern påfyllningen av sitt glykogen lager och börjar bearbeta det glukos som finns kvar för fettsyra syntes. Alltså, Levern tar inte upp glukos direkt, utan fortsätter med glukoneogenesen för att återfylla glykogen lagren. När blodsocker nivån igen är hög sätts nedbrytningen igång. 3. Vad händer om det inte kommer mer mat? The refed state visar vad som händer när glukos återigen blir tillgängligt för nedbrytning. Men vad händer om man inte äter igen? Jo, Du kan dö såklart. Men innan dess. En 70 kg man har en energi reserv på ungefär 161 000 kcal. På en dag behöver denna man ca 1600 till 6000 kcal, beroende på grad fysisk aktivitet. Den lagrade energi som han redan har kan därför räcka upp till 1 till 3 månader. Kolhydrat lagren däremot är slut på bara en dag. Blodglukosnivån måste vara på minst 1,2 mm. Första prioriteten för metabolismen är att ge tillräckligt med glukos till hjärnan och andra vävnader som är beroende av denna energiform. Fettsyror kan inte omvandlas till glukos pga att acetyl CoA inte kan omvandlas till pyruvat. Glycerol kan omvandlas till glukos, men bara en viss bestämd mängd finns tillgänglig. Den andra hälften av glukos kommer från aminosyror från nedbrytningen av protein. Den andra prioriteten i svält metabolismen är att bevara proteinerna genom att ändra energiutvinningen från glukos till fettsyror och ketokroppar. De metaboliska förändringarna är som en övernatts fasta. Den låga blodsockernivån leder till en sänkning av insulin utsöndringen, men en ökning av glukagon utsöndringen. De större metaboliska processerna är mobilisering av triglycerol i fettvävnaden och glukoneogenesen i levern. Levern får energi genom att oxidera fettsyror från fettvävnad. Upptaget av glukos av muskler avtar pga den låga insulin nivån medan fettsyror upptas fritt. Detta betyder att muskeln ändrar energi utvinningen från glukos till fettsyror. B- oxidation av fettsyror sätter stopp för omvandlingen av pyruvat till acetyl CoA. Pyruvat, laktat och alanine används av levern för att producera glukos. Vid klyvning av triglyceroler bildas glycerol som sedan kan användas till syntes av glukos. Ett djurs
överlevnad kan vara beroende av att kunna röra sig. Detta betyder att djuret måste bevara sin muskel massa och minimera nedbrytningen av denna. Efter tre dagars svält har levern producerat stora mängder acetoacetat och D-3- hydroxybutyrat (även kallat ketokroppar).så här går det till: Kolhydraternas uppgift är att se till att citronsyracykeln kan ta hand om alla acetylgrupper som bildas vid fettets nedbrytning. Acetylgrupperna kommer in i citronsyracykeln genom att reagera med oxalättiksyra till citrat. Cellerna behöver påfyllning av oxalättiksyra, det bildas av pyruvatjoner som i sin tur kommer från glykolysen. Om oxaloättiksyra saknas kommer acetygrupperna att reagera med varandra och bilda acetoacetat och 3-hydroxybutyrat ketoföreningar. Ketoföreningarna bildas i levermitokondrierna, och släpps ut i blodet där de transporteras till kroppens vävnader. Vid denna tidpunkt börjar hjärnan att erhålla energi från acetoacetat istället för glukos. Efter tre dagars svält utvinner hjärnan en tredjedel av energin från ketokroppar. Hjärtat använder också ketokroppar som energi. Efter några veckors svält blir ketokropparna huvudkällan för energi utvinning. Nu används bara 40 gram glukos per dag av hjärnan istället för 120 gram den första dagen. Att använda ketokroppar istället för glukos sänker behovet av glukos för hjärnan. Detta leder till att mindre muskelmassa bryts ner nu än efter bara någon dag i svältperioden. 20 gram muskelmassa bryts ner per dag i svält jämfört med 75 gram per dag i början av en svältperiod. Hur länge en människa kan överleva beror helt och hållet på hur mycket triglycerider som är lagrade.
Huvudenzymet Carnitin Acetyltransferas I svältstadiet omvandlar levern fettsyror till ketokroppar i mitokondriens matrix. Detta är beroende av om fettsyrorna kommer in i matrix eller ej. Fettsyror med långa kolkedjor kan endast komma in i matrix om de är esterfierade till carnitin. Det är enzymet carnitin acyltransferas 1 (också kallat carnitin palmitoyl transferase 1, CPT1) som katalyserar denna omvandling. Den här reaktionen kan inhiberas av malonyl CoA, (ett intermediat i fettsyrasyntesen). När malonyl CoA finns närvarnde kan inte fettsyrorna med de långa kolkedjorna komma in i matrix, där ß-oxidation och ketokroppsbildningen sker. Istället transporteras fettsyrorna till fett vävnaderna för att omvandlas till triglycerider. När bränsletillgången är låg är också malonyl CoA nivån låg och då frisätts fettsyrorna från fettvävnaderna och går vidare in till matrix. Bild 2. Humant peroxisomalt carnitine acetyltransferase (hpcat). Vi fick i uppgift att beskriva ett enzym som relaterar till fettsyra metabolismen. Vi valde därför ett liknande enzym som tillhör samma familj som CPT1. Det enzym som vi nu ska presentera katalyserar samma reaktion, men detta enzymet är aktivt i peroxisomerna. Enzymet kallas humant peroxisomalt carnitine acetyltransferase (hpcat). HpCAT är det namn som vidare kommer användas i denna presentation.
Bild 3. Humant peroxisomalt carnitine acetyltransferase (hpcat), katalyserar Acetyl carnitine bildningen från Acetyl CoA och Carnitin. Detta är ett monomert protein som består av två lika stora _ / _ domän. Mellan dessa domän bildas en tunnel som korsar proteinet. Denna tunnel är åtkomlig för lösning och i mitten hittar man den aktiva ytan. I den katalytiska tunnel finns en His 322, som föreslås delta i katalysen. En funktionellt konserverad Glu 326 påverkar His 322 och verkar vara nödvändig för katalys. Utifrån detta ges förslaget om en katalytisk diad. I nästan alla de andra medlemmarna från denna familj (Carnitin acyltransferaser) hittar man en aspartat i denna position, som funktionellt skulle kunna substitueras för glutamat. På enzym i dessa familjer har man bytt ut aspartatet mot alanin, vilket har inaktiverat enzymet totalt. Detta visar betydelsen av en negativ laddning i katalysen. I bindningsfickorna tillåts varje substrat att närma sig den aktiva ytan från var sin sida. Förslaget är att några sidokedjor bla Tyr 431 och Thr 444 vätebinder till syret på carnitin. Lys 398 ligger nära fosfat gruppen på CoA och Leu 142 binder CoA genom hydrofoba interaktioner med metylgrupper på ena sidan av substratet. Ser 407 och Asp 487 vätebinder till CoA. His 322 fungerar som en bas och deprotonerar primär alkoholen av carnitin. Detta resulterar i en positivt laddad histidin. Glu 326 polariserar histidinet för att öka den katalytiska aktiviteten, genom att stabilisera den positiva laddningen som utvecklas efter deprotoneringen av carnitin. Carnitinanjonen som bildas attackerar tioesterbindningen i acetyl CoA. Produkten blir sedan Acetylcarnitin och fritt Coenzyme A.
Bild 3. Sidokedjor som associeras med carnitin bindning och Co A bindning indikeras med mörka klot på banden. De ljusare kloten (gröna) visar sidokedjor som är essentiella för aktiviteten för acyltransferaser. Referenser Fettsyrametabolism : Biochemistry 5:th ed., Berg J, Tymoczko J, Stryer L, 2002 W.H Freeman & Co Acetyltransferaser: http://www.jbc.org/cgi/content/full/278/15/13159#f5