Epidemiologisk studiedesign: seminarieuppgift om effekterna av bromerade flamskyddsmedel Hälsouniversitetet, Linköping Läkarprogrammet, Basgrupp 3 VT-09 Bromerade flamskyddsmedel Bromerade flamskyddsmedel (brominated flame retardants; BFRs i engelskspråkig litteratur) används för att fördröja branduppkomst och -spridning i industriellt tillverkade material och produkter. Det finns en uppsjö olika BFRs det de har gemensamt är att de alla består av förening mellan en organisk molekyl och en eller flera bromatomer. De verkar genom att vid upphettning ge upphov till hydrobromsyra, ett ämne som hämmar oxidationsreaktionen vid förbränning [1]. Alla BFRs är syntetiska molekyler. De vanligaste förekommande är polybromerade difenyletrar (PBDE), tetrabrombisfenol A (TBBPA) och hexabromcyklodekan (HBCDD) [2]. PBDE är inte en enskild kemisk substans, utan en ämnesgrupp med ett stort antal olika kongener. Kongenerna skiljer sig åt beträffande antalet bromatomer, bromatomernas placering samt adderandet av eventuellt ytterligare kemiska grupper till grundstrukturen [3]. PBDE (allmän struktur) TBBPA HBCDD Förekomst Den huvudsakliga källan till BFRs i miljön anses vara läckage från redan producerade produkter och material. Tillverkningsprocesser bidrar med mycket små mängder även om det går att hitta hot-spots med förhöjda halter i avloppsvatten från vissa textilindustrier [4].
Det är stor variation i halterna av BFRs i såväl miljö som människa beroende på var någonstans man mäter och vilken BFR som mäts. Geografiska skillnader beror troligtvis på olika lagstiftning, produktion och användning i olika delar av världen. Jämförelser mellan populationer och platser försvåras av att man inom vetenskapssamfundet inte kommit överens om vilka av de drygt 70 olika flamskyddsmedlen som är viktigast att mäta de studier som görs skiftar mellan olika ämnen och kongener [4]. Trots att det inte finns någon god helhetsbild går det att urskilja övergripande mönster: I Sverige och Europa är man mer restriktiv än i Nordamerika i användingen av PBDE, vilket har lett till stora skillnader mellan kontinenterna. Mätningar 2002 2005 visade till exempel ett medelvärde på 3,7 ng PBDE/g fett i bröstmjölk från kvinnor i en rad europeiska länder; motsvarande värde i USA var 73,9 ng/g. Också inlagringen i fettvävnad var starkt förhöjd i USA och Kanada jämfört med Europa [5]. Livsmedel anses vara den främsta källan till PBDE-exponering för människor, men hudkontakt och inandning är alternativa exponeringsvägar. En svensk får i genomsnitt i sig 50 ng PBDE/dag genom kosten [2]. Kosthållning isolerat förklarar dock inte de geografiska skillnaderna fullt ut, då halterna av PBDE i livsmedel är likartade i Europa och USA [5]. PBDE-koncentrationerna i den europeiska miljön är dock på intet vis låga. Mätningar i Östersjön visar på en PBDE-koncentration som är 40 gånger högre än PCB-koncentrationen [4]. Detta är anmärkningsvärt eftersom PBDE antas ha många egenskaper gemensamma med det etablerade organiska miljögiftet PCB. De senaste decennierna har lågbromerat PBDE (få bromatomer) minskat i bröstmjölk i Sverige (flera kongener har förbjudits), men högbromerat PBDE och HBCDD stiger [2]. Stigande HBCDDhalter i strömming och livsmedel tyder på bioackumulation [6]. Trots att HBCDD ej produceras eller används industriellt i Sverige kan ämnet detekteras i luften, troligtvis på grund av läckage från till exempel byggmaterial och bilinteriörer i stadsmiljöer [6]. Ämnet har också kunnat mätas i fisk, sjöfågel och säl på Grönland och Svalbard, vilket tyder på att det bundet till större partiklar kan transporteras långa sträckor i atmosfären [7]. TBBPA produceras inte inom EU, men omkring 40 000 ton importeras varje år bundet i olika produkter framför allt elektronik [8]. Det sprids inte till miljön i samma omfattning som övriga BFRs då det ligger hårt bundet i plaster [4]. Den största exponeringsvägen för människa är närhet till TBBPA-innehållande produkter: till exempel visade sig norrmän som arbetade med att demontera elektronik ha ungefär dubbelt så höga halter TBBPA i serum än en kontrollgrupp som speglade den norska befolkningen [8]. En grupp som speglade befolkningen i det urbaniserade Japan visade lika höga halter TBBPA i serum som den norska elektronikarbetargruppen [8]. För att sammanfatta så är i princip alla människor på planeten exponerade för BFRs i varierande grad. Förekomsten är extremt heterogen: halterna visar stor spridning inom och mellan populationer. De varierar också kraftigt geografiskt på både det stora och lilla planet: mellan kontinenter, mellan länder, mellan städer och mellan byggnader till och med mellan enskilda rum. Halterna av vissa BFRs har minskat i takt med att de fasats ut, medan andra i Sverige främst HBCDD ökar kontinuerligt. Mätning Halterna av BFRs kan liksom andra organiska miljögifter mätas med hjälp av gaskromatografi/masspektrometri. Förenklat uttryckt så separerar gaskromatografen ämnen i ett prov; därefter skickas de genom masspekrometern där de joniseras och särskiljs efter sin massa.
Mängden joner med en viss massa kan sedan detekteras. Detta gör att det går att skilja mellan till och med olika kongener. Analysen föregås av en anrikning av insamlade prov i laboratorium. Metoderna för anrikning skiljer sig åt beroende på vilken substans det rör sig om luft, vatten, blod eller vävnad. Insamling av luftprov kan ske på två sätt: antingen passivt eller aktivt. Den aktiva metoden är den mest använda och innebär att luft pumpas genom ett filter som fångar partiklarna i luften. Fria ämnen i luftens gasfas fastnar därefter i en absorbent. En svaghet med metoden är att den enbart ger en ögonblicksbild av halterna i luften. Passiv mätning sker utan hjälp av pump och filter, nackdelen med denna metod är att den är vindkänslig. [9] Toxicitet Spridningen av persistent organic pollutions (POP) har varit kända problem i vårt moderna industrisamhälle i snart 40 års tid. Mest känsliga för exponering är foster och små barn. Under 1960-talet började rapporter komma om deras eventuella skadeverkningar på natur och miljö. Då var PCB, DDT och dioxiner i fokus och de två förstnämnda förbjöds i Sverige under 1970-talet. Halterna av dessa föreningar har minskat linjärt sedan förbuden inträdde men i takt med ökad konsumtion och produktion av flamskyddsbehandlade elektroniska varor och textilier så har halterna av BRF stigit i djur och människa sedan sent 1970-tal. Ett problem är att lagstiftning och forskning inte håller jämna steg med marknaden och konsumtionsvanorna och att vi befinner oss i en globaliserad värld som är svår att reglera i miljöhänseende. Ett annat problem är att långsam förgiftning av populationer är en tyst pandemi, som först visar sig tydlig efter ett par decennier. T ex reproduktionsstörningar, cancerutveckling och kognitionssvårigheter uppträder kliniskt efter en relativt lång tid efter exponering [10]. Dagens situation ställer oss inför komplicerade frågor som man inte kan besvara enkelt. Spridningen av ämnena är diffusa och flertalet människor i industrialiserade länder har BRF inlagrat i kroppen i varierande grad. Problemet är förutom begränsad lagstiftning att vi inte vet exakt vilka nivåer som är skadliga och vilka av oss som riskerar skador genom arbete, leverne konsumtionsvanor etc. Hur ska vi skydda våra kommande barn för att exponeras? Hur ska vi ställa högre krav på politiker, arbetsgivare, producenter, EU? Är det upp till enskilda konsumenter att välja rätt sorts varor? Bromerade flamskyddsmedel har negativa effekter på framförallt reproduktion, neurologisk utveckling och immunförsvaret och samband finns också mellan exponering av BRF och cancer [11]. Reproduktion och hormonell störning Studier på amerikanska män från fertilitetskliniker som har haft problem med att skaffa barn har visat ett positivt samband mellan hormonella störningar och höga halter av BRF-innehållande damm från deras bostäder. Det fanns ett statistiskt signifikant samband mellan halten av BRF som de exponerats för och lägre halter av obundna androgener, lägre halt av både FSH och LH [12]. Även i svenska studier slår fast att hushållsdamm är en betydande källa för exponering utöver kosten [13]. Exponering av BRF på mushanar har visat sig ge en sämre spermiekvalitet i en Taiwanesisk studie. Mössens spermier var oftare missbildade än normalt och hade generellt en sämre motilitet [14]. En annan Taiwanesisk studie på honråttor visade att inuteroexponering av BRF gav färre antal fungerande äggfolliklar [15].
Neurologisk utveckling Under fostertiden sker komplicerade utvecklingsstadier där många olika organ och vävnader bildas under olika tidsintervall och kemiska störningar har olika effekt beroende på vilken vävnad det handlar om och när i tidsförloppet utvecklingen är som mest känslig. Det som skiljer den neurologiska utvecklingen från andra vävnader är att den upptar ett betydligt längre totalt tidsintervall där den är känslig för externa störningar [16]. I djurförsök har BRF påvisats ge neurologiska skador. I en studie visade sig BRF minskade mängden glutation och SOD och ökade mängden ROS, DNA-skador och apoptos i råttors Hippocampusneuron. Den exakta mekanismen lyckades dock inte helt tydliggöras [17]. Studien fick även stöd av en artikel publicerad i år där man exponerat råttfoster för BRF där man uppmätte likande förändringar i hippocampus och även påvisade reflexmässiga och kognitiva störningar på avkomman [18]. Immunförsvaret För att immunförsvaret ska ge oss ett adekvat svar på infektioner krävs det ett strikt organiserat system med kommunikation mellan dess olika komponenter. Studier på möss från 2009 har visat att BRF stör cytokinkommunikation mellan olika immunceller. Framförallt IL-13 och MIP-1beta minskade hos de exponerade mössen [19]. I en svensk studie från 1997 på BRF-exponerade humana immunceller in vitro lyckades inte se någon signifikant skillnad i cytokinproduktion [20] vilket väcker frågan om tidigare forskning missat viktiga toxiska effekter som vi idag kan mäta bättre. Cancer Flera studier tydliggör sambandet mellan BRF och cancerincidens [21]. I en svensk studie framkom att incidensen av Non-Hodgkins lymfom ökar i Sverige och att ett visst samband gick att se mellan nyinsjuknade och deras halter av BRF i kroppen [22] sambandet mellan BRF-exponering och lymfomutveckling sågs även i en amerikansk studie på råttor [23]. En annan svensk studie gjord på Örebros universitetssjukhus fann ett samband mellan ökad incidens av testikelcancer och exponering av BRF under fostertiden. Testikelcancer är i Sverige den vanligaste cancerformen hos unga män och studien visade att den högsta incidensen var korrelerad med den tid då gravida kvinnor hade högst nivåer av POPs (tidigt 1980-tal) och att incidensen sjönk då PCB och DDTnivåerna sjönk, men att nivåerna av BRF ökar och att de kan komma att ha samma effekter som den gamla sortens gifter [24]. Referenser [1] J Green. (1996) Mechanisms for Flame Retardancy and Smoke suppression A Review. Journal of Fire Sciences, Vol. 14, No. 6, 426 442 [2] Miljöhälsorapport 2009. Socialstyrelsen. ISBN 978-91-978065-7-2 [3] U Lidman. (2008) Toxikologi läran om gifter. Studentlitteratur. ISBN 978-91-44-01965-9 [4] R Law et al. (2006) Levels and trends of brominated flame retardants in the European environment. Chemosphere 64 187 208 [5] L Costa, G Gioradano, S Tagliaferri, A Caglieri, A Mutti. (2008) Polybrominated diphenyl ether (PBDE) flame retardants: environmental contamination, human body burden and potential adverse health effects. Acta Biomed; 79:172 183
[6] M Remberger, J Sternbeck, A Palm, L Kaj, K Strömberg, E Brorström-Lundén. (2004) The environmental occurrence of hexabromocyclododecane in Sweden. Chemosphere 54 9 21 [7] A Covaci et al. (2006) Hexabromocyclododecanes (HBCDs) in the Environment and Humans: A Review. Environmental Science & Technology vol. 40, no.12 [8] A Covaci et al. (2009) Analytical and environmental aspects of the flame retardant tetrabromobisphenol-a and its derivatives. J. Chromatogr. A 1216 346 363 [9] P Bohlin, K Jones, B Strandberg. (2007) Occupational and indoor air exposure to persistent organic pollutants: A review of passive sampling techniques and needs. J. Envi ron. Monit., 2007, 9, 501 509 [10] Grandjean P. (2008) In utero and early-life conditions and adult health and disease N Engl J Med. 2008 Oct 2;359(14):1523; author reply 1524. [11] Kemikalieinspektionen http://www.kemi.se/templates/priopage.aspx?id=4090 6/4 2009 19:08 [12] Meeker JD et al. (2009) Polybrominated diphenyl ether (PBDE) Concentrations in house dust are related to hormone levels in men. Sci Total Environ. 2009 May 1;407(10):3425-9. Epub 2009 Feb 10 [13] Emma Ankarberg et al. (2007) Riskvärdering av persistenta klorerade och bromerade miljöföroreningar i livsmedel. Livsmedelsverket [14] Tseng LH et al. (2006) Postnatal exposure of the male mouse of PBDE Toxicology. 2006 Jul 5;224(1-2):33-43. Epub 2006 Apr 19 [15] Chao HR et al. (2007) Levels of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) in breast milk from central Taiwan and their relation to infant birth outcome and maternal menstruation effects. Environ Int. 2007 Feb;33(2):239-45. Epub 2006 Oct 31 [16] Adam H et al. (2005) Adams and Victor's Neurology Chapter 28. Normal Development and Deviations in Development of the Nervous System. McGra-Hill. USA [17] He P et al. (2008) PBDE-47-induced oxidative stress, DNA damage and apoptosis in primary cultured rat hippocampal neurons. Neurotoxicology. 2008 Jan;29(1):124-9. Epub 2007 Oct 12 [18] Cheng J et al. (2009) Neurobehavioural effects, redox responses and tissue distribution in rat offspring development exposure to BDE-99. Sci Total Environ. 2009 May 1;407(10):3425-9. Epub 2009 Feb 10 [19] Lundgren M. et al. (2009) Polybrominated diphenyl ether exposure suppresses cytokines important in the defence to coxsackievirus B3 infection in mice. Toxicol Lett. 2009 Jan 30;184(2):107-13. Epub 2008 Nov 5 [20] Fernlöf G et al. (1997) Lack of effects of some individual polybrominated diphenyl ether (PBDE) and polychlorinated biphenyl (PCB) congeners on human lymphocyte functions in vitro. Toxicol Lett. 1997 Feb 7;90(2-3):189-97 [21] Prevent http://www.prevent.se/press/pressmeddelande.asp?id=129 6/4 2009 19:17 [22] BENGT GLIMELIUS LÄKARTIDNINGEN VOLYM 95 NR 50 51 1998 [23] Nelson NJ. J Natl (2005) Studies examine whether persistent organic agents may be responsible for rise in lymphoma rates Cancer Inst. 2005 Oct 19;97(20):1490-1. [24] Hardell et al (2006) In utero exposure to persistent organic pollutants in relation to testicular cancer risk Department of Oncology, University Hospital, S-701 85 Orebro, Sweden.
Epidemiologisk studiedesign Hypotes och studietyp Vi har valt att designa en fall-kontroll-studie som skall besvara frågeställningen: Ger bromerade flamskyddsmedel neurologiska kognitionsskador på barn? Målet med studien är att påvisa om det finns en ökad risk att barn utvecklar kognitionsstörningar vid exponering för bromerade flamskyddsmedel under graviditeten och amningsperioden. I detta fall är miljöagenset bromerat flamskyddsmedel i gruppen polybromerade difenyletrar (PBDE). En fall-kontroll-studie lämpar sig väl vid observationer av orsakssamband där exponeringen är vanlig men där sjukdomen är mindre vanlig. I detta fall undersöks ett utfall kopplat till framförallt en typ av exponering. Härtill är fall-kontrollstudien bättre lämpad än upplägget vid en kohortstudie. Datainsamlingen är som i alla fall med fallkontroll-studier retrospektivt. Eventuellt skulle ett alternativ till den valda studiedesignen vara en retrospektiv kohortstudie. Nackdelen är dock att det är ett ovanligt utfall orsakad av en vanlig exponering som studeras. Kohortstudier används oftast för det motsatta förhållandet. Definitioner Studiebasen utgörs av nyfödda barn (båda könen) och deras mödrar. De väljs konsekutivt då de uppsöker vården. Mödrarna och barnen ska vara bosatta i Stockholms, Göteborgs eller Malmös innerstad. Då studieutfallet och incidensen av sjukdomen så vitt vi vet ej är årstidsberoende, kan studieperioden utgöras av tiden från studiens start till dess att ett tillfredställande stort antal individer fångats upp i fall-gruppen. Individer till kontrollgruppen väljs med matchning av mödrarna med avseende på ålder, boende, arbete, utbildningsnivå, inkomst, näring och tid för partus. Detta för att minska risken för systematiska fel i studien. Fallen definieras med utgångspunkt i neurodiagnostiska kriterier för hjärnskador som lett till grava kognitionsrubbningar hos förstfödda barn. Anledningen är att störst avgiftning av upplagrade PBDE i kvinnan sker i samband med första graviditeten. Avgiftningen sker då de studerade ämnena kan vandra över placentan och intagas av barnet via modersmjölken. Individer till både fall- och kontrollgrupp väljs till studien efterhand som dessa söker upp vården. Det finns ej någon alternativ kontrollgrupp att välja om påverkansrisken från möjliga confounding faktorer skall minimeras. Halten PBDE i bröstmjölk mäts efter ett halvår. Att detta test görs efter sex månader är för att modern skall ha hunnit amma barnet ett tag och för att barnet ej skall ha hunnit exponera sig självt för agenset. Dessutom underlättas en neurologisk kognitionsutredning om en tid förlöpt efter partus. Detta sker i fall- respektive kontrollgruppen. Exponering definieras som en förhöjd halt av PBDE i bröstmjölk med mer än två standardavvikelser från medelvärdet av PBDE i bröstmjölk bland ammande svenska kvinnor. Precision För att uppnå hög precision är det viktigt att mätmetoderna för kognitionsrubbningen är lika från mätning till mätning och att kriterierna för vad som klassificeras som grav kognitionsrubbning (diagnos som krävs för att inkluderas i studien) är väl definierad. Hög precision erhålls om ett och samma instrument används och samma läkare (barnneurolog) utför kognitionsutvecklingstestet.
Felklassificering Felklassificeringar med avseende på exponering och utfall kan ske. För att minimera risken för detta är det viktigt att väl definiera urvalsgruppen som ovan för att undanröja så många confounders som möjligt från början. Felklassificering av exponering är mindre trolig i denna studie då exponeringsgraden av PBDE mäts som en koncentration, en metod som är lätt att standardisera och som ger noggranna värden. Felklassificering av utfallet är möjligt, men risken minskas med väldefinierade diagnostiska kriterier för kognitiv rubbning. Diagnosen ska dessutom fastslås av en och samma läkare. Om detta inte skett skulle risken för felklassificering av utfallet vara förhållandevis stor. Confounders och bortfall Confounders som skulle kunna ge missvisande resultat är annan exponering som orsakar liknande utfall, exempelvis exponering för bly och metylerat kvicksilver som likt PBDE kan överföras från moder till barn. Därför kan exempelvis även halten av dessa metaller mätas i blod. Detta ger en säkrare bild av PBDE-molekylernas inverkan och dessas roll i det kausala samband som studien eventuellt påvisar. Återigen är det viktigt att mödrarna i både fall- och kontrollgruppen är väl matchade, så när som på hjärnskadan hos de förstfödda barnen. Bortfall kommer att finnas, exempelvis mödrar som ej ammat sina barn själva. Detta är ett selektivt bortfall. Riskvärdering och åtgärder Måttet på risk i en epidemiologisk fall-kontrollstudie är beräkning av oddskvot mellan fall och kontroller, vilket kan ses som en skattning av den relativa risken. I vårt fall innebär detta att om oddskvoten blir >1 i studien så tyder det på ett samband mellan kognitionsrubbningar och exponering för PBDE. Om oddskvoten exempelvis är 2 så är risken dubbelt så stor att utveckla kognitionsstörningar i gruppen som exponerats för PBDE-halter två standardavvikelser högre än snittet i befolkningen. Om studien påvisar ett sådant samband mellan kognitionsrubbningar och exponering för bromerade flamskyddsmedel skulle detta kunna ge upphov till vidare konsekvensutredning av användandet alternativt ett direkt förbud mot bromerade flamskyddsmedel. Man skulle dock behöva ta hänsyn till hur stor riskökningen är samt fundera över eventuella confounders innan införandet av sådana åtgärder. Ett problem med ett eventuellt nationellt förbud är att det skulle vara svårt att tillämpa praktiskt eftersom det finns BFRs i så oerhört många produkter. Dessutom skulle det inte nödvändigtvis undanröja exponeringen eftersom flamskyddsmedlen kan transporteras långa sträckor i atmosfären. Det bästa sättet att få ner halterna av BFR torde vara att jobba för ett förbud på det internationella planet så att de inte andvänds över huvud taget i tillverkningen av nya produkter.