Detection of mutations in dihydropteroate synthase (dhps) and dihydrofolate reductase (dhfr) in Plasmodium falciparum in eastern Sudan

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet, 180 hp Examensarbete, 15 hp, VT-11 Detection of mutations in dihydropteroate synthase (dhps) and dihydrofolate reductase (dhfr) in Plasmodium falciparum in eastern Sudan Mariam Nakintu Handledare: Göte Swedberg Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Uppsala universitet

ABSTRACT Malaria is one of the most frequent infectious diseases in the world and is mostly found in the tropical and subtropical parts of the world. WHO estimates that there are 300-500 million malaria cases every year. Malaria is caused by a parasite from the Plasmodium genus and of five species, which can cause infections in humans, of which Plasmodium falciparum is the most pathogenic. In eastern Sudan, the malaria transmission is limited to the three months long rain season, which is followed by nine months of dry season. It is during the dry seasons that an infected person develops an asymptomatic infection. Due to mutations, changes that happen naturally in genes, the malaria parasite has managed to become resistant to all antimalarial drugs that are available today. There are specific mutations in the parasites dhps- and dhfr-genes that are responsible for resistance to the sulfadoxine-phyrimethamine antimalaria drug. The dhps and dhfr enzymes are involved in the parasites folate-synthesis, which is needed for the synthesis of DNA nucleotides during replication. The aim of this study was to use PCR to detect mutations in the dhps- and dhfr-genes in P. falciparum infected patients from eastern Sudan that showed parasitic infection during the rain- and dry season. The result showed mutated parasite clones in the dhps-gene during the dry season. This was surprising because drug treatment was, in the study, limited to the rain season and therefore there should not be any mutant clones. Due to lack of time no analysis where done on the dhfr-gene. Keywords: Sulfdadoxin-Phyrimethamine, malaria resistance, nested-pcr 2

INTRODUKTION Malaria är en av mänsklighetens mest frekventa sjukdomar. I över ett sekel med upprepade försök att utrota eller få kontroll över malaria, består sjukdomen som ett stort växande hot mot människans hälsa främst i utvecklingsländer i de tropiska och subtropiska delarna i världen. 40% av jordens befolkning lever i områden där malaria har stor spridning. En uppskattning av antalet malariafall i världen har gjorts till 300-500 miljoner varje år. Dödssiffran beräknas vara 2,7 miljoner varje år varav 90 % utgörs av barn under 5 år som lever i de subtropiska delarna av världen (Gardner et al., 2002). Malaria är en parasitinfektion som kan drabba människan. Infektionen orsakas av protozoer, encelliga organismer, som tillhör släktet Plasmodium. Inom Plasmodiumsläktet finns det 5 olika Plasmodium-arter som kan orsaka sjukdom hos människan, P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale (Greenwood et al., 2005) och den nyligen upptäckta P. knowlesi (Oddux et al., 2011). Av dessa fem arter är P. falciparum den farligaste. Den orsakar flest allvarliga infektioner och står för största andelen dödsfall av malaria (Greenwood et al., 2005). Spridningen av parasiten sker via honorna av Anopheline myggan (Greenwood et al., 2005). P. falciparums livscykel i människan består av tre stadier. Första stadiet är det pre-erytrocytiska stadiet och inleds då myggan suger ut blod från en människa samtidigt som den sprutar in saliv, som är till för att utvidga och förhindra koagulation i de omkringliggande blodkärlen, i vävnaden under huden eller i vissa fall direkt in i blodbanan. Med myggans saliv sprutas sporozoiter (parasiter), in. Dessa tar sig till levern där de infekterar en del av levercellerna, hepatocyterna. Inne i hepatocyterna utvecklas varje enskild sporozoit till tiotusentals dotterceller, asexuella parasiter även kallade för merozoiter. Det andra stadiet, det asexuella stadiet, i cykeln börjar efter ca 1 vecka då merozoiterna tar sig ut ur levern och in i blodbanan. Det är i det här stadiet som den smittade personen utvecklar symptom för malaria. Väl inne i blodbanan påbörjas merozoitens cykel som består av infektion av erytrocyter, replikation, spräckning av erytrocyter och mer utsläpp av merozoiter ca var 48:e timme. Det tredje och sista stadiet i P. falciparums livscykel i människan sker då en liten del av merozoiterna övergår till sexuell form, gametocyter. Gametocyterna, som ligger kvar i erytrocyten, kan i sin tur fångas upp av nästa mygga som kommer för att suga blod och på så sätt sprids parasiten vidare från människa till människa 3

(Crompton et al., 2010). Parasiten genomgår en annan cykel i myggans mage. Där genomgår gametocyterna flera utvecklingsstadier där det sista utvecklingsstadiet är sporozoiter som tar sig från myggans mage till myggans saliv. I Sudan, som i så många andra afrikanska länder, är malaria ett stort problem. Det sker 7,5 miljoner infektioner och 35000 dödsfall i landet årligen. Den största andelen infektioner och dödsfall orsakas av P. falciparum (A-Elgayoum et al., 2009). I de östra delarna av Sudan sker smittspridningen under landets ca 3 månader långa regnperiod som följs av en lång torrperiod med bara några enstaka malariafall. Personer som blir smittade under regnperioden utvecklar oftast långvariga asymptomatiska infektioner efter att regnperioden är över (Babiker et al., 1998). I denna typ av infektion kan gametozyterna tas upp av nästa mygga och spridas vidare. Närvaro av P. falciparum i Sudan har medfört resistensutveckling mot malariamedlen. Resistens mot klorokin sågs först på 1980-talet i de östra delarna av Sudan och p.g.a. den ökade resistensutvecklingen har landet bytt till malariamedlet Sulfadoxin-Pyrimetamin (SP) (Babiker et al., 1995). En av de största anledningarna till varför malaria runt om i världen är och har varit svår att få kontroll över är malariaparasitens ökade resistensutveckling mot de antimalariamedel som finns ute på marknaden (Wongsrichanalai et al., 2002). Med resistens mot anti-malariamediciner menas en parasits förmåga att överleva och/eller dela sig trots patientens intag av rekommenderad dos av antimalariamedlet, dock inom patientens toleransnivå (WHO, 2001). Denna överlevnadsförmåga beror på naturligt förkommande punktmutationer, förändringar, i sekvenser i en parasits gener som gör att läkemedlet inte får någon verkan på parasiten. Spridningen av resistens beror på många faktorer såsom utsträckningen av läkemedlets användning, läkemedlets uppbyggnad, mänskliga faktorer såsom människors resande runt om i världen, hur parasiten tar upp läkemedlet, genetiska mutationer hos parasiten och även miljöfaktorer kan påverka resistensutvecklingen. Klorokinresistenta parasiter kan t.ex. överleva bättre i en Anopheline-mygga som lever i Sydamerika jämfört med en mygga som lever i Afrika. (Wongsrichanalai et al., 2002). 4

För Plasmodium-arterna har resistens påvisats i P. falciparum och P. vivax. Ingen resistens har dokumenterats för P. malariae och P. ovale (Wongsrichanalai et al., 2002). De antimalariamedel som har använts mest är kinin, klorokin och Sulfadoxin- Pyrimetamin (SP). Kinin är ett av det äldsta och mest kända antimalariamedlen men som dock inte har använts lika frekvent och spritt jämfört med andra antimalariamedel. Det förekommer naturligt i cinochonaträdets bark i Sydamerika och upptäcktes på 1600-talet. Det första resistensfallet rapporterades in i början av 1900- talet och sedan dess har enstaka fall av kininresistens rapporterats in. Idag används medlet som andra- eller tredjehandsval för malariabehandling. Klorokin framställdes på 1940-talet och blev snabbt det mest använda och effektivaste syntetiska antimalariamedlet 40 år framåt. Då fler och fler klorokinresistensfall rapporterades in utvecklades nya medel däribland SP. Idag har klorokinresistens rapporterats in överallt från P. falciparum-malariadrabbade områden. Den höga klorokinresistensen har lett till att över 10 afrikanska länder bytt ut sitt förstahands-antimalariamedel, klorokin, till SP (Wongsrichanalai et al., 2002). Kombination av Sulfadoxin och Pyrimetamin framställdes för första gången 1967 och redan samma år rapporterades det första SP-resistensfallet in från de thailändska gränserna. Innan SP-kombinationen användes de båda medlen var för sig. Idag är SPresistensen hög i stora delar av sydöstra Asien och södra Kina. På 1980-talet började man se ökad SP-resistensutveckling över den Afrikanska kontinenten. SP-resistensen sprids allt snabbare bland de malariadrabbade länderna i världen (Wongsrichanalai et al., 2002). P. falciparum är den art som står för största andelen infektioner och dödlighet och är därför den art vars gener det forskats mest om. Gällande antimalariamedel är den genetiska bakgrunden till SP-resistensen den mest undersökta (Wongsrichanalai et al., 2002). Genetiskt finns det två typer av benämningar hos organismer, vildtyp och mutant. Med vildtyp menas en arts naturliga genetiska förekomst. Vildtypen representerar alltså den ursprungliga förekommande genvarianten hos en art. Med mutant menas att det skett en eller flera mutationer i vildtypen. Hos P. falciparum har dessa mutationer lett till resistensutveckling mot olika antimalariamedel. Malariainfekterade patienter 5

kan antingen bära på parasiter av typen vildtyp, mutant eller båda två. Bär de på båda har de en så kallad blandinfektion. Specifika mutationer som är kopplade till SP-resistensen hos P. falciparum har identifierats. Sulfadoxin och Pyrimetamin samverkar vilket ger en större effekt än de båda medlen skulle göra separat. Sulfadoxin inhiberar enzymet dihydropteroatsyntetas (dhps) och Pyrimetamin inhiberar enzymet dihydrofolatreduktas (dhfr) i P. falciparum. Genom att inhibera dessa enzymer, som ingår i olika katalytiska steg i parasitens men inte människans folatsyntes, blockeras parasitens möjlighet att tillverka DNA-byggstenar och därmed kan inte DNA replikation ske vid delning. Det har identifierats att punktmutationer vid kodon N51I, C59R, S108N och I164L i dhfrgenen är direkt kopplade till parasitens resistens mot Pyrimetamin där varje punktmutation resulterar i högre grad av resistens. Punktmutationer vid kodon S436A/F, A437G, K540E, A581G och A613T/S i dhps-genen är kopplade till parasitens Sulfadoxinresistens (Ndiaye et al., 2005). Ett helgenomsekvenseringsprojekt för P. falciparum-klonen, 3D7 (vildtyp), har utförts av en grupp forskare. Det 22,8 Mega-baspar (Mb) genomet består av 14 kromosomer och kodar för 5300 gener (Gardner et al., 2002). För detektionen av en muterad P. falciparum klon (DD2) användes 3D7 som referens i denna studie. Snabb och korrekt detektion av en Plasmodium-infektion hos en patient är extremt viktigt i försöken att förhindra svåra infektioner och dödsfall i framförallt de tropiska delarna av världen där en blandinfektion är vanlig (Rosanas-Urgell et al., 2010). Den laboratoriemetod som använts längst för detektion och diagnos av malaria är ljusmikroskopering av en tjock bloddroppe och ett tunt blodutstryk. Med den metoden går det att detektera olika Plasmodium-arter kvantitativt. På senare tid har snabbtestmetoden börjat användas allt oftare ute i fält där det är speciellt viktigt att ställa en snabb diagnos. Med ett malaria-snabbtest detekterar man specifika antigen (proteiner), som malariaparasiten producerar i en infekterad patients blod. För detektion av olika Plasmodium-arter på molekylär nivå används PCR. Metoden gör det även möjligt att detektera olika kloner inom en Plasmodium-art (Rosanas-Urgell et al., 2010). I denna studie används konventionell PCR och nested-pcr för detektion av olika Plasmodium falciparum-kloner. Nested-PCR, dubbel-pcr, innebär att man 6

använder sig av två primerpar. Det första primerparet, som basparar till ett specifikt område, används till den första PCR-omgången. Till den andra PCR-omgången används PCR-produkt från den första PCRen och ett nytt primerpar. Detta primerpar basparar till ett område innanför det område som det första primerparet basparat till. Med nested-pcr höjs känsligheten och specificiteten och risken för kontamination minskar. Syftet med denna studie är att detektera mutationer i dhfr- och dhps-generna i P. falciparum infekterade patientprover från östra Sudan, som uppvisat parasitinfektion under både regn- och torrperioden. Man vill ta reda på om proverna innehåller parasiter av typen vildtyp eller en mutant. Detta för att se vilken typ av parasitklon som dominerar och om det finns något mönster. MATERIAL OCH METOD Provmaterial Fryst färdigextraherat DNA från P. falciparum-infekterade patienter från östra Sudan och färdigextraherat DNA från 3D7 (vildtyp) och DD2 (mutant) laboratorieodlade parasitkloner användes. Provmaterialet är från år 1993-1994 och har använts i en tidigare studie. Patienterna genomgick klorokinbehandling mot P. falciparuminfektion, under regnperioden, där ett blodprov togs varje månad genom hela regnoch torrperioden (15 månader). Patientproverna i denna studie representerar de patienter, som trots behandling, behöll en parasitinfektion. DNA extraherades från blod på filterpapper enligt Chelexmetoden (Plowe et al., 1995). Detta steg utfördes av en annan gruppmedlem i forskningsgruppen innan denna studie sattes igång. Preparation av 3D7- (vildtyp) och DD2- (mutant) kontroller för dhfr- och dhpsgenerna PCR amplifiering av dhfr-genen Den totala volymen för PCR-mixen var 20µl och innehöll DreamTaq Green buffer (Fermentas), 0,05µM av respektive specifik primer som är riktad mot målsekvensen, pfdhfr1 5 -ATGATGGAACAAGTCTGCGAC-3, pfdhfr2 5-7

CTTGATAACAACGGAACCTCC-3 (Eurofins MWG Operon), 0,1mM dntp (Fermentas), 2,5u/ DreamTaq DNA polymerase (Fermentas), samt 2µl DNA-prov. Det program som ställdes in på PCR-maskinen, GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) för dhfr-amplifieringen var denaturering vid 94 o C i 2min, 94 o C i 30sek, annealing vid 50 o C i 1min och elongering vid 72 o C i 1min. Detta upprepades i 25 cykler följt av 72 o C i 10min varefter 4 o. PCR amplifiering av dhps-genen Totalvolymen för PCR-mixen var 20µl och hade samma innehåll som PCR för dhfrgenen bortsett från primer. Amplifikationen av dhps-genen utfördes i två PCRomgångar och programmet som ställdes in var denaturering vid 94 o C i 3min, 94 o C i 1min, annealing vid 51 o C i 2min och elongering vid 72 o C i 1min. Detta upprepades i 25 cykler därefter 74 o C i 10min följt av 4 o C. Till den första PCRen användes primer N218 outer forward 5 -TGATACCCGAATATAAGCATAATG-3 (Eurofins) och N185 outer reverse 5 -ATAATAGCTGTAGGAAGCAATTG-3 (Eurofins). Till den andra PCR-omgången användes primer Rc nested forward 5 - GGTATTTTTGTTGAACCTAAACG-3 (Eurofins) och Rd nested reverse 5 - ATCCAAATTGTGTGATTTGTGGAC-3 (Eurofins). Som DNA-prov togs 2µl av PCR-produkten från första omgångens PCR. Kontroll av PCR amplifiering med agarosgelelektrofores Proverna kördes på en 0,8 %-ig agarosgel som preparerades genom att blanda agarospulver, Agarose ultra pure (Invitrogen), med 1X TBE-buffert (Tris borate EDTA). Därefter togs 40ml av blandningen och 0,07 % etidiumbromid (dropperbottle, Applichem) tillsattes, detta för att senare kunna synliggöra DNA-banden med hjälp av UV-strålning. Spänningen sattes på 90V i 1h varefter gelen lades på ett UV bord och fotograferades för avläsning. Rening av PCR-produkter Reningen av PCR-produkten gjordes enligt medföljande kit manual, GeneJET PCR purification kit #K0701, #K0702 (Fermentas). Detta steg görs för att rena PCR-produkten från eventuellt överskott av t.ex. primer och rektionsbuffert och för att få en koncentrering av produkten. Detta kit bygger på att DNA-sekvensen binds till en hydrofob matris, som tvättas varefter DNA elueras. 8

Genkloning Kloningen utfördes enligt medföljande kit manual, CloneJet PCR Cloning Kit #K1231 (Fermentas) Detta steg gjordes för att föra in, ligera, den amplifierade genen i en plasmidvektor som i sin tur kan transformeras in i en bakterie. Transformation Till transformationen, insättningen av plasmidvektorn med det ligerade DNAt in i bakterier, användes E. coli DH5α celler. Dessa preparerades genom att tillsätta en koloni av E. coli DH5α bakterier till 20ml BHI-lösning, Brain heart infusion (OXOID) löst i destillerat H 2 O. Lösningen sattes på skak i 37 o C så bakterierna kunde växa till sig upp till en turbiditet på 0,35-0,40 vid 600nm. Lösningen centrifugerades, i 10min på 4000xg varefter supernatanten hälldes av och 10mL kyld 50mM, ph 8,0 kalciumklorid tillsattes. Bakterielösningen sattes på is i 15min och centrifugerades sedan i ytterligare 10min på 4000xg. Supernatanten hälldes av och ytterligare 2mL kyld 50mM, ph 8,0 kalciumklorid tillsattes. Blandningen hölls på is tills den användes. Till 200µl av E. Coli-bakterielösningen tillsattes 10µl ligeringsmix (plasmidvektor med ligerat fragment). Sedan utfördes en värmechock, för att bakterierna skulle ta upp plasmiden, genom att lösningarna lades på is i 30min och därefter i ett 42 o C värmeblock i 2min. Efter inkubationen tillsattes 1ml LB-medium, LB BROTH LENNOX (CONDA) och lösningen inkuberades i 37 o C i 1tim. Efter inkubationen centrifugerades lösningen, i 3min på 3000xg för att samla bakterierna i rörens botten. Supernatanten hälldes av och bakteriepelleten resuspenderades i vätskan som blev kvar i rören. Dessa racklades sedan ut på agarplattor innehållande ampicillin (50µg/ml) och inkuberades i 37 o C över natten. Koloni-PCR (kontroll av transformationen) 6-8 bakteriekolonier valdes slumpmässigt ut från de inkuberade plattorna från föregående dag för att testa om insättningen av det ligerade DNAt lyckats. Detta gjordes genom att köra en PCR. PCRen kördes med samma program som vid PCRamplifieringen av dhfr- och dhps-generna och med samma antal cykler. Dock användes andra primrar, 1µl 10µM pjet1.2 forward 5-9

CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3 (Fermentas) och 1µl 10µM pjet1.2 reverse 5 -AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3 (Fermentas) för denna PCRanalys. Dessa primrar binder till vektorn vilket gör att det går att ta reda på om bakterierna tagit upp plasmiden eller inte och om fragmentet ligerats in korrekt. Proverna kördes på en 0,8 %-ig agarosgel som preparerades på samma vis som vid kontroll av PCR-amplifieringen av dhfr- dhps-generna. Klyvning av DNA fragment med restriktionsenzym Innan klyvningen gjordes en rening av PCR-produkterna på samma sätt som tidigare. För klyvningen av dhfr-genen med restriktionsenzymet, TaqI (Fermentas), som klyver mutanten vid R59, tillsattes 2µl 10X Buffer TaqI med BSA (Fermentas), 10µl renad PCR-produkt, 12µl H 2 O och 0,5µl 10u/µl TaqI. Till Tsp509I (Fermentas), som klyver vildtypen vid I51, tillsattes 2,5µl 10X Buffer B med BSA (Fermentas), 10µl renad PCR-produkt, 12µl H 2 O och 0,5µl 10u/µl Tsp509I. Proverna inkuberades i 62 o C i 1tim. Till klyvningen av dhps-genen med restriktionsenzymet 10u/µl AvaII (Fermentas) som klyver både vildtyp och mutant vid kodon G437 och restriktionsenzymet 10u/µl FokI (Fermentas) tillsattes 2,5µl 10X Buffer R med BSA (Fermentas), 10µl renad PCR-produkt, 12µl H 2 O och 0,5µl AvaII. Proverna inkuberades i 37 o i 1h. Proverna för dhfr-genen kördes på en 2 %-ig agarosgel och proverna för dhps-genen kördes på en 0.8 %-ig agarosgel som förbereddes på samma sätt som tidigare varefter gelen lades på ett UV bord och fotograferades för avläsning. Plasmidpreparation Plasmidpreparationen gjordes enligt medföljande kit manual GeneJET Plasmid miniprep kit #K0502, (Fermentas). Detta steg görs för att rena plasmiderna, med det ligerade fragmentet, från E. colibakterierna så man får fram en lösning med bara plasmider som kan användas som kontroller vid analys av patientprover. 10

Analys av patientprover Analysmetoden för patientproverna gick till på samma sätt som metoden för preparationen av kontrollerna dock i en annan ordning. Först utfördes PCR för amplifiering, därefter agaros-gel-elektrofores, rening av PCRprodukt, klyvning med restriktionsenzym och agaros-gel-elektrofores som kontroll för klyvningen. För de prover som inte gav starka band på gelen gjordes en transformation, koloni-pcr, gel-elektrofores, rening av PCR-produkt och sist klyvning med restriktionsenzym varefter resultatet noterades. RESULTAT Preparation av 3D7- (vildtyp) och DD2- (mutant) kontroller för dhps- och dhfrgenen. För att kunna undersöka om det finns muterade parasitkloner i patientproverna måste kontroller för vildtypen och mutanten göras. Första delen av projektet gick ut på att preparera dessa kontroller genom att isolera målsekvensen där mutationen finns och använda sig av restriktionsenzym för klyvning vid olika kodon där mutationerna finns. Kontroller gjordes för både dhps- och dhfr-genen. Först preparerades 3D7- och DD2-kontrollerna för dhfr-genen. Klyvningen av vildtypen och mutanten skedde med restriktionsenzymerna TaqI som klyver mutanten, och Tsp509I som klyver vildtypen. Fig 1. visar resultatet för klyvningen av dhfr-genen. Därefter preparerades 3D7- och DD2-kontroller för dhps-genen. Till klyvningen användes restriktionsenzymet AvaII som klyver både vildtyp och mutant vid kodon G437. Fig 2. visar resultatet för klyvningen av dhps-genen. För DD2-kontrollen för dhfr-genen upprepades alla stegen i metoden 4 gånger då det inte skett någon bakterietillväxt efter varje transformation. Alla stegen utfördes på samma sätt med samma material. Vid det fjärde försöket av PCR-analysen, för kontroll av transformationen, byttes DreamTaq Green Buffer (Fermentas) ut mot Pfu Buffert med MgSO 4 (Fermentas) och DreamTaq DNA polymeras (Fermentas) byttes ut mot Pfu DNA Polymeras rekombinant (Fermentas). Detta för att Pfu DNA polymeraset är stabilare jämfört med DreamTaq DNA polymeraset. Detta gav resultat. 11

Figur 1. Klyvning av 3D7- (vildtyp) och DD2- (mutant) med TaqI och Tsp509I för dhfr-genen. Sista provet är en kontroll som består av okluvet DD2-prov. 1= 3D7(3)-TaqI, 3= 3D7(4)-TaqI, 6= DD2(2)Tsp509I, 7=DD2(5)-TaqI. Siffrorna inom parentes representerar de utvalda bakteriekolonier som tagit upp plasmidvektorn. 2=3D7(3), 4=3D7(4), 5=DD2(2), 8=DD2(5), 9=kontroll-DD2 utan restriktionsenzym. Figur 2. Klyvning av 3D7 och DD2 med AvaII för dhps-genen. Banden till vänster om storleksmarkör 1, 1 kbp-stege (Fermentas), representerar utvalda bakteriekolonier för 3D7-proverna. Banden till vänster om storleksmarkör 2 representerar utvalda bakteriekolonier för DD2 proverna. 12

Analys av patientprover Syftet med studien var att detektera mutationer i dhps- och dhfr-genen i P. falciparum-infekterade patienter med hjälp av restriktionsenzym som klyver vid specifika kodon. Tab 1 visar resultatet för upptäckta mutationer i dhps-genen vid kodon G437 Tabell 1. Detektion av mutationer i dhps-genen vid kodon G437. Patient nr Månads nr dhps VT/MT 30 2 VT 30 3 VT 30 4 Ingen PCR-produkt 30 5 Ingen PCR-produkt 30 6 VT 30 7 VT 30 8 VT 30 9 VT 30 10 VT 30 11 Ingen PCR-produkt 34 3 VT 34 5 VT 34 6 VT 34 7 VT 34 8 MT 34 9 MT 34 10 MT 34 11 VT 34 12 VT 34 13 Ingen PCR-produkt 34 16 Ingen PCR-produkt VT står för vildtyp och MT står för mutant 13

För några av proverna kunde inte tillräckligt med DNA amplifieras vid PCRkörningen och kunde därför inte analyseras. Pågrund av tidsbrist gjordes inga analyser på dhfr-genen. DISKUSSION Malaria infektioner har blivit allt svårare att behandla pga. av malariaparasitens resistensutveckling mot de antimalariamedel som finns ute på marknaden idag. Resistensutvecklingen beror på mutationer i parasitens gener som gör att medlet inte längre är verksamt mot parasiten. För att kunna detektera muterade parasitkloner använder man sig av PCR-metoden, för att få en stor mängd av mål-sekvensen och restriktionsenzym som klyver vid specifika kodon i DNA-sekvensen där mutationerna finns. Vid analysen av patientprover måste kontroller för vildtypen och mutanten finnas. Vid preparationen av kontrollerna var det speciellt svårt att få till en lyckad transformation för DD2-kontrollen för dhfr-genen. En förklaring till detta kan vara att den extraherade DNA-mängden för DD2 var mindre jämfört med DNA-mängden för 3D7. Detta gav en mindre mängd PCR-produkt att arbeta vidare med. Problemet åtgärdades genom att ta DNA-extrakt från ett annat DD2-originalprovrör och byta ut DNA-polymeras till ett mer stabilare enzym (se Kontroll av koloni-pcr med agarosgelelektrofores i material och metod). Detta gav bättre resultat. En anledning till problemen kan vara att provmaterialet i det första orginalprovröret med extraherat DNA förstörts efter upprepad upptining och nedfrysning. Klyvningen av 3D7 och DD2 för dhfr-genen lyckades, dock blev resultaten inte som förväntat. I teorin klyver TaqI DD2 (mutant) och Tsp509I klyver 3D7 (vildtyp) men när klyvningen utfördes blev resultatet annorlunda. I Figur 1. ses resultatet för klyvningen. Där kan man se att 3D7 klövs av TaqI och DD2 klövs av både TaqI och Tsp509I. Detta innebar att teori och praktik inte stämde överens men att kontroller för vildtyp och mutant fåtts fram. Den sannolika förklaringen till resultatet är att proverna blandades ihop någonstans under metodens gång och att en kontamination har skett för det DD2-prov som klövs som både mutant och vildtyp. Resultatet i Figur 2. visar att både 3D7 och DD2 klövs av AvaII för dhps-genen vilket också var förväntat då båda klonerna har G437. Av de patientprover som klövs av AvaII borde fortsatt analys göras i form av sekvensering för att bekräfta om provet innehåller vildtypklon eller mutantklon. Resultatet i Figur 2. visar även 3D7 och DD2 14

kloner som inte kluvits av restriktionsenzymet FokI. Detta berodde på de båda klonerna inte har det kodon där FokI klyver vid. På grund av att det tog längre tid än väntat att preparera kontrollerna gjordes ingen analys av dhfr-genen i patientmaterialet. Tabell 1. visar därför bara analysresultaten för patientproverna vad gäller dhps-genen. Resultatet av två patientprover visar att prov från patient nr 30 bara innehöll vildtypklonen av P. falciparum under hela perioden medan patient nr 34 innehöll både vildtyp och muterad parasitklon. Mutantklonen hos patient 34, ses under en 3 månadersperiod varefter vildtypklonen ses igen. I den tidigare studien som patienterna ingick i, genomgick de behandling under de 3 första inledande månaderna, regnperioden. Då de inte längre uppvisade några symptom och inga parasiter kunde påvisas i mikroskop under torrperioden avslutades behandlingen. Det resultat som fåtts fram, att patienten bär på resistenta mutantkloner, är därför överraskande. Resultatet leder till funderingar kring hur det kommer sig att patienten plötsligt uppvisar muterade parasitkloner i blodet trots frånvaro av antimalariabehandling. Är det något som händer i kroppen hos patienten eller rör det sig om spridning av mutantkloner från andra infekterade personer eller har den misslyckade behandlingen lett till att mutantparasiter uppstått dvs. har den korta närvaron av antimalariamedel lett till muterade parasitkloner? Om vidare analyser av fler patientprover kunnat göras skulle detta kunna ge en tydligare bild av om det finns ett mönster. Är det många patienter som uppvisar mutantkloner? Det finns en liknande studie som gjorts tidigare i Senegal, som visar att en kombination av mutationer i dhps-genen och mutationer i dhfr-genen leder till en ökad misslyckad SP-behandling (Ndiaye et al., 2005), alltså en ökad resistensutveckling. Om analyser gjorts på dhfr-genen i denna studie så kanske resultatet hade visat samma mönster och fler mutantkloner i båda generna hittas hos fler patienter. I denna studie användes PCR-metoden för detektion av olika parasitkloner och mutationer i dessa. Den traditionella metoden som använts längst för att diagnostisera en malariainfektion är ljusmikroskopi. Med denna metod undersöks ett färgat 15

blodutstryk från patienten i ett ljusmikroskop. Fördelen med denna metod jämfört med en molekylär metod, PCR, är lägre analyskostnader, enkel preparation av prover och så går det att göra en artbestämning och även se vilket stadium parasiten befinner sig i. Nackdelen med metoden är den stora risken för falskt negativ diagnos vid låg parasitkoncentration i blodet och felidentifiering av parasitart. Ljusmikroskopering tillåter heller ingen identifiering av olika parasitkloner, dvs. om det rör sig om en vildtyp eller mutant eller blandinfektion. Detta går att upptäcka med PCR-metoden, speciellt nested-pcr. En annan fördel med PCR-metoden är att metoden har högre känslighet jämfört med ljusmikroskopering. Hos patienter med en asymptomatisk infektion eller patienter som genomgått en antimalariabehandling och sedan blivit symptomfria är det oftast svårt att upptäcka parasiter i blodet med hjälp av ljusmikroskopering. Detta betyder att det är för få parasiter i blodet för att kunna upptäckas i mikroskop men tillräckligt för att upptäcka med hjälp av PCR. Dock finns det nackdelar med PCR-metoden också såsom höga analyskonstader, dyr analysutrustning, långa analystider för proverna och ökad risk för kontamination. Dessutom är metoden inte kvantitativ. Snabb diagnostik är nödvändig för att minska dödligheten i malaria och p.g.a. detta har snabbtest börjat användas mer och mer ute i fält i utvecklingsländer. Med ett malaria-snabbtest detekteras specifika antigen (proteiner), som malariaparasiten producerar, i en infekterad patients blod. Fördelen med detta test, förutom att det ger möjlighet till en snabb diagnos på plats, är att det inte behövs någon provförberedelse vilket det behövs med de andra metoderna. Dock begränsas metoden av att det inte är möjligt att detektera någon annan parasitart än P. falciparum (Rosanas-Urgell et al., 2010, Ochola et al., 2006, Hassanpour et al., 2011). Idag finns det inget antimalariamedel som är tillräckligt effektivt för att kunna användas som behandlingsform till de svåraste malariainfektionerna. Mer forskning kring bl.a. mutationer i parasitens gener behövs för att på så sätt kunna utveckla ett antimalariamedel som ger en effektivare behandling än den som finns idag. Dessutom behövs utveckling av olika metoder som t.ex. PCR-metoden så det blir möjligt att utföra analyserna på kortare tid och även utveckla bligare material som behövs så att de värst drabbade, utvecklingsländerna, kan använda sig av denna metod och därmed kunna diagnostisera fler personer vilket leder till att behandling sätts in snabbare och fler kan bli fria från sin infektion. 16

REFERENSER A-Elgayoum, El-Feki Ael-K, Mahgoub BA, et al., 2009, Malaria over diagnosis and burden of malaria misdiagnosis in the suburbs of central Sudan: special emphasis on artemisinin-based combination therapy era, Diagnostic microbiology and infectious disease, May;64(1):20-6 Babiker HA, Abdel-Muhsin AM, Ranford-Cartwright LC, et al., 1998, Characteristics of Plasmodium falciparum parasites that survive the lengthy dry season in eastern Sudan where malaria transmission is markedly seasonal, The American journal of tropical medicine and hygiene, Oct;59(4):582-90 Babiker HA, Satti G, Walliker D, 1995, Genetic changes in the population of Plasmodium falciparum in a three-year period, The American journal of tropical medicine and hygiene, jul;53(1):7-15 Crompton PD, Pierce SK, Miller LH, 2010, Advance and challenges in malaria vaccine development, The journal of clinical investigation, Dec 1;120(12):4168-78 Gardner MJ, Hall N, Fung E, et al., 2002, Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum, Nature, Oct 3;419(6906):498-511 Greenwood BM, Bojang K, Whitty CJ, Targett GA, 2005, Malaria, Lancet, Apr 23-29;365(9469):1487-98 Hassanpour G, Mohebali M, Raeisi A et al., 2011, Detection of malaria infection in blood transfusion: a comparative study among real-time PCR, rapid diagnostic test and microscopy: Sensitivity of malaria detection methods in blood transfusion, Parasitology research, Jan 8 [Epub ahead of print] Ndiaye D, Daily JP, Sarr O, et al., 2005, Mutations in Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase and dihydropteorate synthase genes in Senegal, Tropical medicine and international health, Nov 10;(11):1176-9 Ochola LB, Vounatsou P, Smith T et al., 2006, The reliability of diagnostic techniques in the diagnosis and management of malaria in the absence of a gold standard, The lancet infectious diseases, Sep 6;(9):582-8 Oddux O, Debourgogne A, Kantele A, et al., 2011, Identification of the five human Plasmodium species including P. knowlesi by real-time polymerase chain reaction, European journal of clinical microbiology & infectious diseases, Apr 30;(4):597-601 Plowe CV, Djimde A, Bouare M, et al., 1995, Pyrimethamine and proguanil resistance-conferring mutations in Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase:

polymerase chain reaction methods for surveillance in Africa, The American journal of tropical medicine and hygiene, Jun;52(6):565-8 Rosanas-Urgell A, Mueller D, Betuela I, et al., 2010, Comparison of diagnostic methods for the detection and quantification of the four sympatric Plasmodium species in field samples from Papua New Guinea, Malaria journal, Dec 14;9:361 WHO, Drug resistance in malaria, WHO/CDS/CSR/DRS/2001.4 http://www.who.int/drugresistance/publications/who_cds_csr_drs_2001_4/en/, 2011-04-3 Wongsrichanalai C, Pickard AL, Wernsdorfer WH, Meshnick SR, 2002, Epidemiology of drug-resistant malaria, The lancet infectious diseases, Apr 2;(4):209-18 18