En metodjämförelse mellan vätskebaserad cytologi och cellblock vid immuncytokemisk färgning

Transkript

1 Örebro Universitet Institutionen för hälsovetenskap och medicin Program: Biomedicinska analytikerprogrammet Kurs: BMLV C, Biomedicinsk laboratorievetenskap, Examensarbete Datum: En metodjämförelse mellan vätskebaserad cytologi och cellblock vid immuncytokemisk färgning Författare: Malin Fritzell Handledare: Jessica Larsson Cytodiagnostiker, Laboratoriemedicinska länskliniken, Örebro universitetssjukhus

2 SAMMANFATTNING En av svårigheterna i att ställa diagnos utifrån exsudat är att det finns många olika differentialdiagnoser. Förr baserades hela bedömningen på betraktarens kunskap om cellernas morfologiska utseende och sätt att arrangera sig. Idag finns bland annat immunologiska metoder som kan erbjuda stöd vid diagnosen. Resultaten av sådana färgningar kan dock variera beroende på vilket sätt det cytologiska materialet överförs till objektsglaset. Syftet med den här studien var att jämföra tre prepareringsmetoder, vätskebaserad cytologi med ThinPrep Liquid-based Cytology Preparation System och två olika cellblockmetoder, Shandon Cytoblock Cell Block Preparation System och Cellient Automated Cell Block System. Prepareringsmetodernas positiva och negativa egenskaper sammanställdes i metodutvecklande syfte. Cellerna analyserades immuncytokemiskt med tre olika antikroppar och teknikernas påverkan på den immuncytokemiska färgningen utvärderades. Slutsatsen blev att alla tre metoder hade sina respektive för- och nackdelar. En studie med större antal prov och fler antikroppar vore nödvändigt. Intressant vore även att studera resultaten av Shandon Cytoblock på CytoLytfixerat material. Nyckelord: Vätskebaserad cytologi, ThinPrep, Cellblock, Cellient, Immuncytokemi

3 INNEHÅLLSFÖRTECKNING 1. BAKGRUND Exsudat och mesotelceller Vätskebaserad cytologi Cellblock Immunfärgning SYFTE METOD OCH MATERIAL Urval och etik Vätskebaserad cytologi Cellblock Immuncytokemi Mikroskopisk granskning RESULTAT ThinPrep Shandon Cytoblock Cellient DISKUSSION OMNÄMNANDEN REFERENSER... 21

4 1. BAKGRUND Den diagnostiska cytologin har vuxit fram ur många års arbete och forskning inom anatomi, fysiologi, histologi och patologi, för att med tiden utveckla fungerande tekniker. De senaste årtiondenas utveckling inom biokemi och molekylärbiologi, och kanske framförallt genombrott inom provfixering och färgning har gjort cytologin till en fantastisk möjlighet till en detaljerad bild av celler och dess beståndsdelar (1). Cytologin accepterades som diagnostisk metod efter att George Papanicolaou, som har kommit att kallas cytologins fader, hade ägnat över 20 års arbete inom cytologin och utvecklandet av det så kallade Paptestet. Detta är en metod för cellutstryk som till en början användes till gynekologiska prover. Cytologin kopplas därför av många än idag främst till cervix och gynekologiska prover, trots att tekniken kan användas till i stort sett alla celltyper oavsett härkomst (1). 1.1 Exsudat och mesotelceller I denna studie användes celler från exsudat, det vill säga vätskeansamlingar i kroppens hålrum som orsakats av patologiskt ökad permeabilitet i kapillärer. Två typer av exsudat användes; pleuravätska och ascites (2,3). Serösa membran som till exempel pleuran och peritoneum består av mesotelceller. Det finns alltid två lager, ett visceralt som täcker organen och ett parietalt som täcker den yttre väggen, det vill säga toraxväggen eller bukväggen i dessa fall. Mesotelets yta fuktas av en serös vätska som förhindrar friktion mellan viscerala och parietala lagren. Mängden vätska är normalt liten. Större vätskeansamlingar orsakas oftast av infektion, inflammation, olika typer av organsvikt eller malignitet (4). Mesotelet i dessa serösa membran är en typ av epitel med tydligt runda eller ovala kärnor som normalt är jämna i sitt kromatin. Normala mesotelceller som kan ses i ett exsudat befinner sig en och en eller i små grupper, se figur 1. Metastaserande celler från exempelvis ett adenocarcinom befinner sig också i grupper eller en och en, men de är ofta större och vakuoliserade. De har kärnförändringar och ofta en eller flera stora oregelbundna nukleoler, se till höger i figur 1. Andra celler som också ofta syns i exsudat är erytrocyter och inflammatoriska celler, som lymfocyter, neutrofiler och makrofager. Makrofager som ibland kan likna mesotelceller känns igen och skiljs från dessa på den ljusare cytoplasman (4,5). 1

5 Figur 1: Till vänster normala mesotelceller från pleuravätska (20x). Till höger pleuravätska innehållande seröst adenocarcinom som härstammar från ovariet (20x) (6). Svårigheten i att ställa diagnos i pleuravätska och ascites är att det finns många olika differentialdiagnoser. Mesotelceller uppvisar många gånger reaktiva förändringar som ibland kan vara svåra att skilja från en malignitet. Förr baserades hela bedömningen på betraktarens kunskap om cellernas morfologiska utseende och sätt att arrangera sig. Idag finns bland annat immunologiska metoder som kan erbjuda stöd vid diagnosen (5). Resultaten av sådana färgningar kan dock variera beroende på provpreparering. Provprepareringar som till exempel klassiska utstryk, cytospin, vätskebaserad cytologi eller cellblocktekniker (7,8). 1.2 Vätskebaserad cytologi Med den vätskebaserade cytologin (VBC) fixeras celler i en metanolbaserad lösning med hemolyserande samt slemreducerande effekt. Lösningen ger där av en mindre mängd blod, och genom en filtreringsteknik vid prepareringen även färre inflammatoriska celler som kan störa bilden vid granskning. VBC ger möjlighet till en effektiv och tillförlitlig uppsamling av celler samt en enhetlig behandling av samtliga prov. Tekniken har precis som den konventionella cytologin sina rötter inom vaginalcytologin men har utvecklats vidare för andra provtyper. Metoden är känd för att ge färre ej bedömbara preparat samt den goda egenskapen att kvarvarande material kan analseras vidare med andra tekniker, exempelvis molekylärbiologiska (3,9,10). Den första VBC-metoden för screening av cervikal malignitet godkändes år 1996 av American Food and Drug Administration. Idag används VBC som rutin för både gynekologiska och andra typer av prov (11). Det finns flera typer av preparationssystem som 2

6 baseras på vätskebaserad cytologi. ThinPrep är ett av de vanligast förekommande systemen (3,10). ThinPrep ThinPrep 2000 från Cytyc är ett system som använder sig av trycklufts- och fluiditetsprinciper för spridning, insamling och överföring av celler till ett objektsglas. Provmaterialet skall förvaras i en burk innehållande 20 ml PreservCyt-lösning för att kunna behandlas i systemet. PreservCyt är en metanolbaserad lösning som är till för att fixera celler och bevara dess morfologi (12). PreservCyt gör det möjligt att förvara celler under lång tid, för att sedan kunna utföra exempelvis rutinfärgning eller immunfärgning. PreservCyt bibehåller cellernas immunreaktivitet och förhindrar korsreaktioner och bakgrundsfärgning. Vissa antikroppar kan dock påverkas av alkoholfixeringen (8). Tekniken använder sig av ett biologiskt neutralt filter bestående av ett poröst membran. Detta roterar ner i ThinPrep-burken med cellsuspensionen och på så sätt separerar celler och annat störande material, som blod och slem. Med hjälp av vakuum drar ThinPrep 2000 cellerna mot filtret där de fastnar, flödet känns av i systemet och när ett enda cellager är uppsamlat vänds filtret och pressas mot objektsglaset. Det är både ytspänning och lufttryck som fäster cellerna på glaset i en cirkel, se figur 2. Glaset fixeras sedan i 95 % etanol (13). Processen skadar inte den adhesionskraft som binder cellgrupper samman och inte heller de enskilda cellernas uppbyggnad vilket är viktigt rent diagnostiskt (12,14). Figur 2: Bilden redogör för hur ThinPrep 2000 använder sig av vakuum för att samla upp celler på ett filter och sedan överföra dessa till ett objektsglas (13). 3

7 1.3 Cellblock Cellblocktekniken beskrevs första gången Den är sedan 1947 en allmänt accepterad metod inom diagnostiken då det bevisades att den kunde tillvarata en stor andel av cellmängden, även i cellfattiga prov, vid undersökning av cytologiskt material (15,16). Tekniken går ut på att material extraheras från vätska, packas ihop och formalinfixeras varefter det härdas genom att tillsätta Histogel. Till sist bäddas materialet i paraffinkloss (16). HistoGel är en vattenbaserad provbearbetningsgel med uppgift att kapsla in celler i ett stelnat medium (17). Detta kan senare snittas med mikrotom på samma sätt som ett histologiskt material (16). Cellblockmetoden har lagt grunden för en stor utveckling inom cytologin, den har på flera sätt revolutionerat diagnostiken i området genom att erbjuda en typ av material som går bra att analysera immuncytokemiskt. Idag är cellblockmetoden en del av rutinen på många laboratorier (15,16). På många vis är det just på grund av sina likheter med histologiska preparat som metoden har kommit att bli så användbar (18). Manuellt cellblockkit, Shandon Cytoblock Shandon Cytoblock Cell Block Preparation System från Thermo Scientific är en metod som skall ge snabb och tillförlitlig bearbetning av cytologiskt material. Det cytologiska materialet centrifugeras var efter ett reagens tillsätts, det består av formalin och alginat (alginic acid). Det bildar en gel vars funktion är att kapsla in cellerna. En trattformad provkammare och en cytoblock-kassett sätts samman i en cytoclip, se figur 3. Cellerna överförs till provkammaren och cytoclipsen centrifugeras i en Cytospin, en särskild typ av centrifug som med centrifugalkraften ger cellerna tillräcklig fart för att passera filtret som sitter i anslutning till tratten. Vätskan absorberas av ett filter på baksidan av provkammaren och cellerna passerar över till cytoblock-kassettens provbrunn. Kassetten fixeras i zinkformalin, detta på grund av att vanlig fosfatbuffrad fixering sakta bryter ner gelmaterialet i reagensen (19). 4

8 Figur 3: Till vänster syns cytoclips och provkammare där provet placeras, till höger en cytoblockkassett med tillhörande reagens (20,21). Automatiserat cellblocksystem, Cellient Cellient Automated Cell Block System har sedan ett antal år funnits som ett alternativt sätt att göra cellblock. Denna metod erbjuder en alkoholbaserad fixering, då alltså det hälsoskadliga formalinet undviks. Cellblocks i Cellient innehåller istället provmaterial preparerat med vätskebaserad teknik, med användning av medierna CytoLyt och PreservCyt (16,22). Cellient Automated Cell Block System från Hologic bygger på ett helautomatiserat system som ger instrumentet möjlighet att på mycket kort tid färdigställa cellblock. Tekniken baseras på ThinPrep -teknik och använder sig av vakuumassisterad filtrering. Systemet ska ge god cellularitet även från cellfattiga prov samt bevara cellerna utan att förändra dess form och utseende (23). Figur 4 visar en översiktlig bild av vad som sker i instrumentet. Provburk, pipetter och kassett laddas i första steget. Provet pipetteras i provbrunnen, eosin kan appliceras och dras genom provet med hjälp av vakuum, detta för att göra cellerna tydligare. Cellerna filtreras sedan med alkohol för att dehydreras. Det sista filtreringssteget går ut på att filtrera med xylen för att avlägsna alkoholen. Provet bäddas sedan genom tillsatts av paraffin. Slutligen avslutas denna automatiska process genom att ännu ett lager paraffin tillsätts och klossen är klar för snittning (24). 5

9 Figur 4: Framställningen av cellblock med Cellient Automated Cell Block System. 1.) Prov och kassetter laddas, 2.) provet filtreras, 3.) cellerna bäddas, 4.) processen avslutas med ännu ett lager paraffin (24). 1.4 Immunfärgning Immunfärgningen har kommit att bli revolutionerande för den diagnostiska patologin. Vad som gör denna metod så framstående är bland annat att den är kompatibel med de rutinmässiga metoderna, det vill säga att immunfärgning kan utföras på paraffininbäddat material. Metoden har även hög sensitivitet och specificitet (25). Immunfärgningen, eller immunhistokemin, ger möjligheten att undersöka om vävnad innehåller specifika antigen, detta med hjälp av antikroppar och förmågan till selektiv bindning. Användandet av antikroppar för färgning kan även användas till cytologiska preparat och metoden kallas då immuncytokemi. Immunfärgningen har inte varit riktigt lika utbredd inom cytologin som inom histologin men en stadig ökning har setts de senaste åren (4). Med hjälp av immuncytologi är det möjligt att bland annat bestämma celltyp och cellhärkomst, det görs då med sitespecifika markörer. Immuncytologin kan också användas för att gruppbestämma infektioner, klassificera tumörer och gradera malignitet (8). Innan immunfärgning kan utföras sker först en förbehandling i tre steg för att avparaffinera och rehydrera cellerna, samt genom värmeinducerad epitopåtervinning frigöra antigen som maskerats av fixeringen, vanligen formalin. Därefter tillsätts ett blockreagens för att stoppa 6

10 alla enzymatiska processer som kan ge falskt positiva resultat. Immunfärgningen går ut på att komplex bildas när antikropp och enzym binder in till antigen i cellerna eller på dess yta och därmed sker en färgförändring (26). I det här projektet färgades preparaten med en polymerbaserad immunfärgning där en typ av dextranpolymer används, EnVision +. En primär antikropp tillsätts som binder in till antigenet, se figur 5. En eller flera sekundära antikroppar binder till den primära antikroppen. De sekundära antikropparna sitter på en dextranryggrad (26), en typ av polysackarid (27), tillsammans med inbundna enzymer. Enzymerna kan visualiseras med hjälp av ett kromogen, som med påverkan av enzym får en färgförändring. På detta sätt kan en cancertumörs ursprung fastställas, det vill säga om det är en primär cancertumör eller om cellerna härstammar från en metastaserande tumör. Det är antigenen som tumörcellerna utrycker som avslöjar deras ursprung (26). Figur 5: En beskrivning av hur tvåstegs polymermetoden Envision + fungerar. En primär antikropp binder till antigenet i vävnaden. Den primära antikroppen drar sedan till sig en sekundär antikropp som sitter i ett komplex med en enzymtäckt dextranryggrad (26). Antikroppar Med hjälp av ett antal kompletterande antikroppar går det att med stor säkerhet skilja mesotelceller från andra celltyper, som har andra färgningsmönster (4). 7

11 Calretinin: Antikroppen markerar i de flesta fall calretinin i mesoteliala celler samt patologiska celler med mesotelialt ursprung. I exsudat färgar antikroppen oftast mesoteliom men inte adenokarcinom från till exempel lunga, kolon eller bröst och inte heller melanom. Alltså är den brukbar när maligna epiteliala mesoteliom ska identifieras och när dessa skall skiljas från metastaserande adenokarcinom. Antikroppen ger cellerna nukleär och cytoplasmatisk färgning (28). BER-EP4: Denna antikropp är en allmän epitelial markör som binder till epitelialt antigen (BER-EP4) och intensiteten av färgningen beror på epitelets ursprung. Den färgar oftast inte icke-epiteliala celler, dessutom blir pleura samt cellerna som omger peritoneum i de flesta fall inte infärgade. I onormala prov bör antikroppen märka epiteliala tumörceller oberoende av dess differentiering. Antikroppen används ofta för att skilja adenocarcinom från malignt mesoteliom eller frodiga reaktiva mesoteliala celler då den färgar de flesta epitelceller. Antikroppen ger membran- och cytoplasmafärgning (29). CD45: Antikroppen består av två kloner, det vill säga två monoklonala antikroppar som riktar sig mot olika epitop. De binder in till Leukocyte Common Antigen (CD45) och är mycket användbara vid identifiering av lymfoida tumörceller. Detta på grund av att de märker in både normala och neoplastiska lymfoida celler. De färgar oftast membranen i cellerna men vid vissa tillfällen även cytoplasman (30). 2. SYFTE Syftet med den här studien var att jämföra tre prepareringsmetoder med varandra, vätskebaserad cytologi med ThinPrep Liquid-based Cytology Preparation System och två olika cellblockmetoder, Shandon Cytoblock Cell Block Preparation System och Cellient Automated Cell Block System. Jämförelsen gjordes efter immuncytokemisk färgning i metodutvecklande syfte. 3. METOD OCH MATERIAL 3.1 Urval och etik Målet var att under våren samla in exsudat, ofixerade prover som inkommit till Laboratoriemedicinska länskliniken Örebro universitetssjukhus (USÖ), avidentifiera dessa 8

12 samt spara till försöket. Enligt riktlinjerna rörande sekretess och behörighet till vårdsystem för studerande och forskare ska alla prover avidentifieras vid metodutveckling, vilket också gjordes. Av de tio inkomna proverna var tre maligna och sju benigna. De tio proverna preparerades med tre preanalytiska metoder och varje prov färgades immuncytokemiskt med tre olika antikroppar, detta med ett sammanlagt antal glas på 90 st. 3.2 Vätskebaserad cytologi Alla tio prover preparerades från ofixerat material till ThinPrep-burkar (TP-burkar). Proverna hade förvarats i kylskåp från det att de samlades in, de prover som förvarats längst hade stått i ca fyra veckor och de färskaste var endast ett par dagar gamla. Från varje prov centrifugerades 10 ml ofixerat material i tio minuter, 600 g. Supernatanten hälldes av och cellerna slammades upp i ca 1 ml celltvätt (ThinPrep CytoLyt Solution, Cytyc, Marlborough, MA) med vortex. Rören fylldes upp med CytoLyt till 50 ml och cellerna centrifugerades, tio minuter 600 g. Supernatanten hälldes av. Av TP-burkens vätska (ThinPrep PreservCyt Solution, Cytyc, Marlborough, MA) överfördes 3-4 ml till bottensatsen för att pelleten skulle kunna lösas upp med vortex. Sedan hälldes resterande PreservCyt-lösning över till röret och blandades för att slutligen hällas tillbaka till TP-burken, nu innehållande cellsuspension. Cellerna preparerades sedan på objektsglas (Dako FLEX IHC Microscope slides, Dako Denmark A/S, Glostrup Denmark, REF K8020) i instrumentet ThinPrep 2000 (ThinPrep Liquid-based Cytology Preparation system, Cytyc, Marlborough, MA). För varje prov laddades instrumentet med märkt objektsglas, TP-burk innehållande 20 ml cellsuspension samt ett filter (ThinPrep UroCyte, Hologic EMEA S.A., Lausanne, Switzerland). Tre glas, ett för varje antikropp, preparerades med celler från alla tio prov. TP-burkarna fylldes på med PreservCyt så att de vid varje preparering innehöll ca 20 ml. Glasen placerades efteråt i en behållare med 95 % etanol fram tills färgning. Till dessa glas användes inga kontroller. 3.3 Cellblock Manuellt cellblockkit, Shandon Cytoblock Preparering med kitet Shandon Cytoblock från Thermo Scientific (Shandon Cytoblock Cell Block Preparation System, Thermo Scientific, Pittsburgh, USA). Från varje prov 9

13 centrifugerades 10 ml ofixerat material i tio minuter, 600 g. Supernatanten hälldes av. I varje rör droppades två till fyra droppar Reagens 2 (blå lösning) och pelleten blandades upp i vätskan med vortex. Filtret i provbrunnen fuktades med en droppe Reagens 1 (ofärgad lösning) och kassetten placerades i metallclipset tillsammans med filtertratten. Cellösningen överfördes till tratten, max 500 µl. Kassetterna placerades i en Cytospin (Shandon Cytospin 2 Phicom Company Applied Technology, Cheshire, England) och centrifugerades i sex minuter vid 1500 rpm. Metallclipsen öppnades och filtertratten avlägsnades försiktigt. Cellerna täcktes med ännu en droppe Reagens 1 och kassetterna stängdes. De fick sedan fixera i Zinkformaldehydlösning (Zigma Life Science, Zinkformalin fixative, St Louise USA) i 24 timmar innan klossarna enligt rutin kunde dehydreras och materialet bäddas. Bäddningen skedde enligt rutin på avdelningen för patologi på USÖ. Efter att klossarna bäddats snittades de i mikrotom (MIKROM International, Section Transfer System HM 355 S, Walldorf, Germany) med vattenfall och de 4 µm tjocka snitten överfördes till objektsglas (Dako FLEX IHC Microscope slides, Dako Denmark A/S, Glostrup Denmark, REF K8020) med snittad histologisk vävnad som kontroller. Automatiserat cellblocksystem, Cellient Alla tio prover preparerades från ofixerat material till TP-burkar. Från varje prov centrifugerades 10 ml ofixerat material i tio minuter, 600 g. Supernatanten hälldes av och cellerna slammades upp i ca 1 ml celltvätt (ThinPrep CytoLyt Solution, Cytyc, Marlborough, MA) med vortex. Rören fylldes upp med CytoLyt till 50 ml och cellerna centrifugerades, tio minuter 600 g. Supernatanten hälldes av. Av TP-burkens vätska (ThinPrep PreservCyt Solution, Cytyc, Marlborough, MA) överfördes 3-4 ml till bottensatsen för att pelleten skulle kunna lösas upp med vortex. Sedan hälldes resterande burkvätska över till röret och blandades för att slutligen hällas tillbaka till TP-burken, nu innehållande celler. De skickades sedan till avdelningen för patologi på Skånes universitetssjukhus i Lund där cellblock tillverkades i instrumentet Cellient Automated Cell Block System från Hologic. Till dessa cellblock användes ett annat paraffin än det som brukas i rutin, (Paraplast, Sigma-Aldrich Corporation, Missouri USA). När klossarna anlände åter till Örebro snittades de i mikrotom (MIKROM International, Section Transfer System HM 355 S, Walldorf, Germany) och de 4 µm tjocka snitten överfördes till objektsglas (Dako FLEX IHC Microscope slides, Dako Denmark A/S, Glostrup Denmark, REF K8020) med snittad histologisk vävnad som kontroller. 10

14 3.4 Immuncytokemi Förbehandling för färgning av VBC-glas Glasen fick stå i formalin i tio minuter. Formalinet hälldes av och glasen sköljdes i 95 % etanol, därefter fick de stå i etanol i 15 minuter. Etanolen hälldes av och glasen sköljdes i rinnande destillerat vatten. Glasen stod sedan i destillerat vatten tills de färgades. Förbehandling för färgning av cellblockpreparat Glasen med celler från de två cellblockmetoderna placerades i värmeskåp, en timma i 60 C. De tilläts svalna för att sedan förvaras i kylskåp fram tills färgningen. De formalinfixerade och paraffininbäddade preparaten avparaffinerades, rehydrerades och utsattes för värmeinducerad epitopåtervinning (HIER) i PT-Link förbehandlingsinstrument (PT Link, Dako Denmark A/S, Glostrup Denmark). Motfärgning gjordes med EnVision FLEX Hematoxylin (EnVision FLEX Hematoxylin, Dako Denmark A/S, Glostrup Denmark kod K8008). Antikroppar I projektet användes tre olika antikroppar vid den immuncytokemiska färgningen. Antikropparna var Monoklonalt Mus Anti-Human Calretinin (klon DAK-Calret), Monoklonalt Mus Anti-Human Epitelialantigen (klon Ber-EP4) samt Monoklonalt Mus Anti- Human CD45, Leukocyt common antigen (kloner 2B11 + PD7/26). Alla tre var Ready-to-use antikroppar från Dako, anpassade för användning i Autostainer Link-instrument. Färgning Glasen färgades i Autostainer Link instrument (Autostainer Link 48, Dako Denmark A/S, Glostrup Denmark) enligt rutin på avdelningen för patologi på laboratoriemedicinska länskliniken. Detta innebar användning av Dako EnVison FLEX+ detektionssystem (Dako EnVison FLEX+, Dako Denmark A/S, Glostrup Denmark) där de tre ready-to-use antikropparna och reaktionerna mellan dessa och cellerna visualiserades med ett kromogen (EnVision FLEX+ DAB+ Chromogen, Dako Denmark A/S, Glostrup Denmark). 3.5 Mikroskopisk granskning Det färgade cytologiska materialet granskades sedan i mikroskop där färgningsmönstret för varje prov, i de tre antikropparna calretinin, BER-EP4 och CD45, bedömdes utefter det förväntade färgningsmönstret. Förväntat färgningsmönster baserades på om respektive prov var benignt eller malignt samt om det innehöll inflammatoriska celler. 11

15 Resultaten för varje metod granskades av Malin Fritzell (författaren, BMA-student) och Jessica Larsson (Cytodiagnostiker) och lades samman till en översiktlig bedömning av den aktuella metodens positiva och negativa egenskaper. Rådgivning i svårbedömda fall gavs av Agnes Hegedüs valt Närkeslätten (Patolog). De tre metoderna bedömdes först efter tidsåtgång vid preparering och förbehandling, detta inkluderade snittningen för cellblockmetoderna, samt tillgången på material. Sedan bedömdes immuncytokemisk infärgning av de tre antikropparna, där överensstämmelse med förväntat resultat, infärgningens styrka och eventuell bakgrundsfärgning noterades. 4. RESULTAT 4.1 ThinPrep Att framställa ett glas redo för immunfärgning från färskt cytologisk material uppskattades ta ca 1,5 h. Cellmängden som överfördes till glasen med ThinPrep var i många fall strax över vad som kunde räknas som representativt för bedömning. Åtta av tio prov gav förväntat resultat, se figur 6. Prov 1, 4 och 8 förväntades vara positiva för alla antikroppar. Prov 4 och 8 överensstämde medan prov 1 avvek genom att vara negativt för calretinin. Resterande prov förväntades vara positiva för calretinin, negativa för BER-EP4 och positiva för CD45. Prov 2, 3, 5, 7, 9 och 10 gav förväntat resultat. Prov 6 gick inte att bedöma på grund av låg cellmängd. Infärgningen var generellt god för alla tre antikroppar. Metoden gav inte upphov till störande bakgrundsfärgning i någon avgörande utsträckning. 4.2 Shandon Cytoblock Att framställa ett glas redo för immunfärgning från färskt cytologisk material uppskattades ta ca 30 h. Cellmängden som överfördes till klossarna var god. Dock orsakade snittningen visst bortfall av material i tre fall av tio (prov 5, 7 och 10). Alla prov gav förväntat resultat se figur 6. Prov 1, 4 och 8 förväntades vara positiva för alla tre antikroppar vilket de också var. Resterande prov (2, 3, 5, 6, 7, 9 och 10) förväntades vara positiva för calretinin, negativa för BER-EP4 och positiva för CD45. Alla överensstämde med förväntat resultat. Infärgningen var generellt mycket god. Det fanns en viss mängd störande bakgrundsfärgning i alla prov. 12

16 4.3 Cellient Att framställa ett glas redo för immunfärgning från färskt cytologisk material uppskattades ta ca 1,5 h. Systemet Cellient gav i de flesta fall god tillgång på material. Snittningen var däremot komplicerad då praffinet var svårsnittat, något som i flera fall påverkade mängden överfört material. Att preparatet färgats med eosin underlättade snittningen. Sex fall av tio gav förväntat resultat. Prov 1, 4 och 8 förväntades vara positiva i alla tre antikroppar vilket de också var. Resterande prov förväntades vara positiva för calretinin, negativa för BER-EP4 och positiva för CD45. Prov 3, 9 och 10 gav förväntat resultat. Prov 2, 5 och 6 avvek från det förväntade genom att vara negativa i calretinin, prov 2 bedömdes dock som tveksam. Prov 7 gick inte att bedöma på grund av okänt fel någonstans i processen. Infärgningen var i åtta av fallen betydligt svagare än i de andra två metoderna. Störande bakgrundsfärgning fanns i ungefär hälften av fallen. Tabell 1: Resultatet för de tre prepareringsmetoderna ThinPrep 2000, Shandon Cytoblock Cell Block Preparation System och Cellient Automated Cell block System efter immuncytokemisk färgning med antikropparna Calretinin, BER-EP4 och CD45. Färgningsresultatet markeras som positivt (+), negativt ( ) eller ej bedömbart (x) samt om färgningsmönstret stämde överens med vad som var förväntat. Prov ThinPrep 2000 Shandon Cytoblock Cellient Ej förväntat resultat Cal BER-EP4 CD45 Cal BER-EP4 CD45 Cal BER-EP4 CD45 1 1, ThinPrep ,2,3 + Cellient Cellient 6 x x x ThinPrep & Cellient x x x Cellient Negativt i calretinin, 2 Tveksam, 3 Svag infärgning 13

17 ThinPrep 2000 Shandon Cytoblock Cellient Överensstämmande resultat Ej överensstämmande resultat Tveksamt resultat Ej bedömbart resultat Figur 6: Översiktlig redovisning av resultaten för de tre prepareringsmetoderna. Andelen av proverna vars resultat överensstämde med vad som var förväntat, det vill säga färgningsmönster karakteristiska för benignt respektive malignt prov. Figur 7: Prov 10 med infärgning av calretinin. Från vänster; ThinPrep 2000 med god infärgning, Shandon Cytoblock med god infärgning samt Cellient med svag infärgning. Liten cellmängd i ThinPrep, övriga metoder god cellmängd. Figur 8: Prov 8 med infärgning av BER-EP4. Från vänster; ThinPrep 2000 med mycket kraftig infärgning, Shandon Cytoblock med god samt tydlig membran- och cytoplasmafärgning och Cellient med svag infärgning. God cellmängd i alla metoder. 14

18 Figur 9: Prov 4 med infärgning av CD45. Från vänster; ThinPrep med karakteristiska cellgrupper och god infärgning, Shandon Cytoblock med god infärgning men viss mängd bakgrundsfärgning, samt Cellient med god infärgning och riklig mängd bakgrundsfärgning. Cellgrupperna kunde endast ses efter preparering med ThinPrep. 5. DISKUSSION VBC med ThinPrep används idag i rutin, dock med andra filter än de som testades i detta försök. Metoden har brukats vid immuncytokemisk analysering av cytologiskt material i ca sex år och fungerar förhållandevis bra. Att metoden vid sparsamma prov inte riktigt uppnår önskad nivå, samt att det inte finns tillgång till lämpligt kontrollmaterial vid immunfärgning har lett till att införandet av en kompletterande metod övervägs. Cellblockmetoder har rykte om sig att ge god materialtillgång även vid cellfattiga prov samt att det finns möjlighet att använda vävnadskontroller på samma sätt som till histologiska preparat. Därför utfördes denna metodutvecklande studie för att undersöka hur väl VBC fungerar i jämförelse med cellblock för immuncytokemisk färgning, samt om en cellblockmetod eventuellt bör införas i rutinen på USÖ i framtiden. Ett större antal prover hade givit mer tillförlitliga resultat i studien, men även ett litet antal prover kunde visa skillnader mellan de tre prepareringsmetoderna. Då studien endast hade tillgång till prover som inkom till avdelningen under en begränsad tidsperiod fanns det inte utrymme för att invänta fler prover. Ett större antal maligna prover hade även önskats. Att ha både benigna och maligna prover var nödvändigt i studien för att se om antikropparna fungerade som avsett. Vid diagnos utifrån exsudat i rutinen används många fler kompletterande antikroppar. I studien valdes endast tre av de vanligaste som tillsammans 15

19 kunde urskilja mesotelceller samt malignitet hos dessa, men även skilja dem från lymfoida celler. Intressant var endast att jämföra prepareringsmetodernas för- och nackdelar. Den främsta nackdelen med VBC, ThinPrep i det här försöket var cellmängden, som i många fall var mycket låg och strax över vad som kunde räknas som representativt. Detta berodde troligen på de filter som användes, ThinPrep UroCyte. De är utformade för urincytologi och valdes därför att de har en mindre membranyta och alltså utnyttjar en mindre mängd cellsuspension för varje glas. Till detta projekt ansågs det vara en fördel därför att det i rutinen är önskvärt att kunna framställa flera immunglas även på prov med sparsamt material. Proven hade fått stå ofixerade i upp till fyra veckor vilket gjorde att cellerna därmed hade degenererat i en del av dem. Det kan ha lett till att stora mängder oönskat material blockerade filtren. Möjligen kunde en extra tvätt i CytoLyt ha förbättrat resultaten. ThinPrep var den metod som gav minst bakgrundsfärgning. De metanolbaserade lösningarna CytoLyt och PreservCyt, med förmågan att lysera blod och lösa upp slem, kan tänkas ha bidragit till god immuncytokemisk färgning med en störningsfri bakgrund. Både genom förvaringen i lösningarna samt tvättsteget under preparationen. Det bör dock tilläggas att materialmängden på dessa glas var så låg att om en större mängd hade överförts är det möjligt att även material med förmågan att bakgrundsfärgas hade överförts. Metanolfixeringen har också sina nackdelar, vissa antigen kan förstöras av den typen av fixering (8). Fetsch med kollegor menar att detta främst gäller lymfoida markörer (7). I den här studien, där den lymfoida markören CD45 användes, sågs inte det fenomenet. Däremot fanns misstankar om att metonaolfixeringen kan ha påverkat antigenet calretinin, en markör för mesotelceller. Det var främst cellerna preparerade med Cellient som uppvisade svag eller ingen infärgning av calretinin. Det är möjligt att metanolfixeringen, och därefter alkohol och xylen, skadade eller maskerade antigenen i cellerna. Inte enbart mesotelcellerna blev svagt infärgade, även övriga celler som färgats med motfärgande hematoxylin blev svaga och ibland knappt synliga. Svag infärgning var därför systemets främsta nackdel. Eftersom att cellerna fixerades i samma metanolbaserade lösningar i Cellient som i ThinPrep men i den senare färgades starkare vore det lite underligt om det enbart berodde på fixeringen, möjligen även någon annan del i processen. 16

20 Van Hemel och Suurmeijer gjorde bedömningen att PreservCyt inte var ett optimalt fixeringsmedel för immuncytokemi. Calretinin var en av antikropparna som inte stämde överens med det förväntade resultatet i deras studie. De menade ändå att ett brett spektrum av antikroppar kunde appliceras till PreservCytfixerade prov som preparerats med Cellient. De var positiva till att frångå användningen av formalin (22). Wagner med kollegor som skrev den första rapporten om Cellient beskrev fler falskt negativa färgningar än vid konventionell cellblock, för andra antikroppar än i denna studie, (CA125, P63 och TTF-1) (15,22). Van Hemel och Suurmeijer fick dock överensstämmande resultat med det förväntade för dessa antikroppar. De beskrev också en avgörande förbättring av den immuncytokemiska färgningen om ytterligare tvättsteg utfördes (22). Det råder alltså delade meningar om metanolbaserad fixering, hur och vida det är fördelaktigt eller inte. Herzberg med kollegor menade att det är att föredra över formalinfixerat material, som i till exempel Shandon Cytoblock (4). Cellblockmetoderna som testades i denna studie är trots olika fixeringar båda utformade för att förhindra att cytologiskt material går förlorat vid bäddning, något som anses ha varit ett problem med tidigare metoder. Enligt företaget Hologic ska Cellient ge mycket god uppsamling av celler (23). Metoden kräver inte att materialet hanteras av personal eller att cellerna bäddas för hand vilket minskar risken att material går förlorat. Den risken kvarstår fortfarande till viss del med Shandon Cytoblock. Dock underlättar gelen från Reagens 2 bäddningen genom att kapsla in cellerna i en så kallad cellknapp, likt andra metoder användande Histogel. Den främsta nackdelen med Shandon Cytoblock är att det tar över ett dygn för ett ofixerat prov att blir redo för immunfärgning. Om en cellblockmetod som Shandon Cytoblock skulle börja användas i rutin hade den varit relativt enkel att införa i det dagliga arbetet då en cytospin redan finns på plats och brukas idag. Övrig preparering kräver varken mycket plats eller ytterligare upplärning då det är en mycket enkel procedur. Det skulle självklart ändå vara utöver dagens rutin och skapa extra arbete. Vi har i den här studien använt Shandon Cytoblock på ofixerat cytologiskt material. Vissa prov som inkommer till avdelningen är fixerade i CytoLyt, till exempel lungcytologiska prov. Eftersom de prepareras med VBC i dagsläget skulle preparering med Shandon Cytoblock innebära dubbel fixering av dessa celler, det vill säga först i metanol och sedan i formalin. Kontzoglou och kollegor skrev att det går att preparera cellblock på överblivet material från vätskebaserad cytologi (31). I bruksanvisningen för vår cellblockmetod nämns 17

21 finnålsaspirat, mellannålar, kroppsvätskor och restsediment från andra cytologiska prepareringar som användbart material till Cytoblockmetoden (19). Intressant vore att veta om material fixerat i CytoLyt kan räknas in under kategorin andra cytologiska prepareringar. Om det inte är möjligt att blanda dessa två fixeringstyper kommer det inte heller vara möjligt att göra cytoblock på en andel av de prover som inkommer till laboratoriet idag. Alltså skulle de positiva egenskaperna hos Shandon Cytoblock ändå inte kunna utnyttjas fullt ut. Vid ett eventuellt införande av ett system som Cellient hade inte det problemet uppstått eftersom att systemet tillverkar cellblock från kvarvarnade material från ThinPrep-burkar. Att laboratoriet i dessa fall även skulle avstå från användningen av formalin och istället fixera cellerna med metanol, hade inte bara givit fördelarna av att ett mycket hälsoskadligt ämne undveks, metanol skulle också vara skonsammare mot cellerna. Det hade i sin tur medfört att andra tester där bevarandet av DNA är av vikt hade fått bättre resultat. Det ska tilläggas att inte heller metanol är ofarligt, men det anses inte vara skadligt i samma grad som formalin (16,22). Hur positivt detta än låter, skulle införandet av ett sådant system inte bespara laboratoriepersonalen från kontakten med formalin, det används i rutinen till allt histologiskt material. Något som inte lär förändras inom den närmsta framtiden. För framställning av cellblock i Cellient användes ett annat paraffin, Paraplast, än det som brukas i rutinen. Det föredras på grund av att standardparaffinet har visat sig olämpligt genom att ge svårsnittade klossar. I denna studie uppstod ändå, trots specialparaffin, problem vid snittning med torra och sönderfallande snitt. Som vid de flesta andra analytiska tester bör positiva och negativa kontroller användas vid immuncytokemisk färgning, helst tillsammans med varje prov. Idag används inte kontroller för varje prov i rutin, men vid varje laddning av instrumentet. Inom immuncytologin används vanligen vävnadssnitt som kontroller. Mer korrekt vore att använda cytologiskt kontrollmaterial då histologisk vävnad inte är fullt representativ på grund av de olika fixeringarna. Det är möjligt att använda cytologiska material men det sker sällan då det är betydligt mer komplicerat än ett vävnadssnitt. Tillgången är också mycket begränsad vilket gör det omöjligt i praktiken för de flesta laboratorier (8). I detta försök användes vävnadskontroller, precis som i rutin. För att använda cytologiska kontroller krävs att det kommer in material som är positivt för de antikroppar som används. Vilket i många fall innebär ovanliga tillstånd. Ett ytterligare problem är förvaringen, inga bra alternativ finns där att tillgå idag. Därför är det inte möjligt, och vävnadssnitt uppfyller syftet även om de inte är 18

22 optimalt. Detta är ändå en av de främsta anledningarna till att en annan metod utöver VBC är önskvärt. Studiens mest avgörande felkälla var troligen degenerationen av cellerna på grund av att proverna stått ofixerade. Det var dock ett medvetet val då alla metoder skulle ha samma förutsättningar. Detta påverkade alla tre metoder likvärdigt. En faktor som inte påverkade metoderna lika var den mänskliga faktorn. Alla påverkades under överföring av material från provflaska till TP-burk respektive cytoblock-kassett. Därefter var ThinPrep metoden mindre påverkad då dess material inte skulle snittas. Shandon Cytoblock påverkades mycket genom manuell bäddning och snittning. Cellient påverkades inte av mänsklig faktor under tillverkande av klossen. Vid snittningen var den mänskliga faktorn avgörande. Snittningen i de båda cellblockmetoderna gjordes dessutom på olika mikrotomer, visserligen av samma variant, men till Shandon användes vattenfall och till Cellient plockades snitten med borste. Det kan ha påverkat cellmängden olika. Att glasen som preparerades med cellblockmetoderna, framför allt Shandon, stod länge i kylskåp innan färgning var också en möjlig felkälla, men inga tydliga tecken tydde på någon större påverkan. När resultaten från de tre metoderna hade granskats och jämförts blev Shandon Cytoblock den metod som resulterade i de mest lättolkade objektsglasen, det vill säga de med störst mängd material samt den kraftigaste infärgningen. Det var också med denna metod som färgningsmönstret för calretinin, BER-EP4 och CD45 i högst grad stämde överens med de förväntade resultaten för proverna. Däremot gav den en ganska kraftig bakgrundsfärgning i vissa prov. Cellient utmärkte sig genom sin mycket tidsbesparande och automatiska framställning av cellblock samt av att den baserades på material ur en ThinPrepburk. Något som ansågs vara positivt på grund av att cytologiskt material i dagsläget prepareras på det viset, i rutin för VBC. Burkarna skulle alltså kunna behandlas direkt i instrumentet. Metoden gav dock en svag infärgning av vissa antikroppar. Det är en stor prisskillnad mellan Cellient och Shandon Cytoblock då det rör sig om ett instrument jämfört med ett kit. Den förstnämnda innebär en engångskostnad (samt inköp av förbrukningsvaror) och den sistnämnda blir flera mindre inköp som kan anpassas utefter behov. Båda cellblockmetoder har alltså sina för- och nackdelar vid ett eventuellt införande i rutin, precis som VBC har i dagens användning. För att verkligen komma till en slutsats i ämnet skulle en större studie behöva göras, löpande på prov som inte är gamla samt på olika provtyper. I fortsatta studier hade det varit intressant att använda större antal prov och fler 19

23 antikroppar, men också att prova att göra cellblock med Shandon Cytoblock på CytoLytfixerat material. Intressant vore även att lägga till ett ytterligare tvättsteg innan preparering med systemet Cellient, för att se om det skulle ge starkare immuncytokemisk färgning. 6. OMNÄMNANDEN Jag vill börja med att tacka Jessica Larsson, Gisela Helenius och Åsa Bergström för att ni gjorde det möjligt för mig att skriva min C-uppsats på avdelningen för patologi, och även gav mig mitt drömprojekt! Ett särskilt stort tack vill jag ge till min handledare Jessica Larsson som har väglett och stöttat mig, men också diskuterat enormt mycket och på så vis hjälpt mig att förstå och komma förbi varje svårighet under resans gång. Jag har lärt mig väldigt mycket av dig och blivit oerhört inspirerad! Slutligen vill jag tacka Alla anställda på avdelningen för patologi för att ni har svarat på frågor även i stressiga tider. 20

24 7. REFERENSER 1. Keebler, C.M. & Somrak, T.M. (Red.) (1993). The Manual of Cytotechnolog. (7. ed). Chicago: American Society of Clinical Pathologists 2. Nilsson-Ehle, P., Berggren Söderlund, M., & Theodorsson, E. (Red). (2012). Laurells Klinisk Kemi i Praktisk Medicin. (9. Uppl.) Lund: Studentlitteratur. 3. DeMay, R. M., (2012). The Art & Science of Cytopathology. (2 ed.) Chicago: Amenican Society for Clinical Pathology 4. Herzberg, A. J., Raso, D. S. & Silverman, J. F (1999). Color Atlas of Normal Cytology. Philadelphia: Churchill Livingstone 5. Butler, E. B. & Stanbridgde, C. M. (1986). Cytology of Body Cavity Fluids: A coluor Atlas. London: Chapman och Hall 6. CytologyStuff (Internet). Bedford, Hologic, Inc (Uppdaterad: 2014, Citerad: 2014 Apr 11). Tillgängligt från: 7. Fetsch, P.A., Simris, A., Brosky, K. & Abati, A. Comparison of Three Commonly Used Cytologic Preparations in Effusion Immunocytochemistry. Diagnostic Cytopathology, 2002;26: Monaco, S.E. & Dabbs, D.J. (2014). I Dabbs, D.J. (Ed.) Diagnostic Immunochemistry: Theranostic and Genomic Applications. (4. ed.). Philadelphia: Saunders Elsevier 9. Imura, J., Abe, K., Uchida, Y., Shibata, M., Tsunematsu, K., Sathoh, M., Miwa, S., Nakejima, T., Nomoto, K., Haysashi, S. & Tsuneyama, K. Introduktion and utility of liquid-based cytology on aspiration biopsy of peripheral nodular lesions of the lung. Oncology Letters 2014;7: Benjapibal, M. & Laiwejpithaya, S. (2012). Cervical Cancer Prevention by Liquid- Based Cytology in a Low-Resource setting, Topics on Cervical Cancer With an Advocact for Prevention, Dr Rajamanickam, R. (Ed.), InTech, (Uppdaterad: Citerad: 2014 Apr 23). Tillgänglig från: Kirscher, B., Simonsen. K. & Junge, J. Comparison of conventional Papanicolaou 21

25 smear and SurePath liquid-based cytology in the Copenhagen population screening programme for cervical cancer. Cytopathology. 2006;17: Cytyc C. Systemet Thinprep 2000 Användarhandbok. Boxborough; The ThinPrep Paptest (Internet). Hologic (Uppdaterad: 2010, Citerad 2014 Mar 15). Tillgänglig från: l 14. ThinPrep CytoLyt Solution Material Safety Data Sheet (MSDS) (Internet). Marlborough Massachusetts Hologic. (Uppdaterad: 2010 Feb, Citerad: 2014 Apr 03). Tillgänglig från: Wagner, D.G., Russel, D.K., Benson, J.M., Schneider, A.E, Hoda, R.S & Bonfiglio, T.A. Cellient automated cell block versus traditional cell block preparation: A comparison of morphologic features and immunohistochemical staining. Diagnostic Cytopathology 2011;39: Montgomery, E., Gao, C., de Luca, J., Bowler, J., Attwood, K. & Ylagan, L. Validation of 31 of the Most Commonly Used Immunohistochemical Antibodies in Cytology Preperad Using the Cellient Automated Call Block System. Diagnostic Cytopatholgy 2014;00: Joiner, K.S. & Spangler, E.A. Evaluation of HistoGel -embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 2012;24(4): Hecht, S.A. & McCormack, M. Comparison of three cell block techniques for detection of low frequency abnormal cells. Dovepress: Pathology and Laboratory Medicine International 2013:5: Thermo Electron Corporation Anatomical Pathology. Shandon Cytoblock Cell Block Preparation System, Användarhandbok. Pittsburgh, USA. 20. Cellab mer än instrument (Internet). Sollentuna Cellab Nordia AB. (Uppdaterad: 2014, Citerad: 2014 Mar 15). Tillgänglig från: Thermo Scientific (Internet). Thermo Fisher Scientific Inc. (Uppdaterad: 2014, Citerad: 2014 Mar 15). Tillgänglig från: 22

26 22. Van Hemel, B. M. & Suurmeijer, A. J. H. Effective Application of the TM Methanol- Based PreservCyt Fixative and the CellientTM Automated Cell Block Processor to Diagnostic Cytopathology, Immunocytochemistry, and Molecular Biology. Diagnostic Cytopathology 2013;41(8): Cellient Automated Cell Block System (Internet). West Sussex UK, Hologic, Inc. (Uppdaterad: 2008, Citerad: 2014 Mar 28). Tillgänglig från: Cellient Automated Cell Block System (Internet). West Sussex UK, Hologic, Inc. (Uppdaterad: 2008, Citerad: 2014 Mar 15). Tillgängligt från: Dabbs, D. J. (2010). Diagnostic Immunochemistry: Theranostic and Genomic Applications. (3. Uppl.). Philadelphia: Saunders Elsevier 26. Dako, Pathology. Education Guide Immunohistochemical Staining Methods (4 Ed). 27. Dextrans (Internet). Missouri USA, Sigma-Aldrich Co. CLL. (Uppdaterad: 2014, Citerad: 2014 Maj 08). Tillgänglig från: Dako FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Calretinin, Specification Sheet (Internet). Dako Denmark A/S. (Uppdaterad: 2014, Citerad: 2014 Mar 03). Tillgänglig från: Dako FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Epitherlial Antigen Clone Ber-EP4, Specification Sheet (Internet). Dako Denmark A/S. (Uppdaterad: 2014, Citerad: 2014 Mar 03). Tillgänglig från: Dako FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human CD45, Luococyte Common Antigen Clones 2B11 + PD7/26, Specification Sheet (Internet). Dako Denmark A/S. (Uppdaterad: 2014, Citerad: 2014 Mar 03). Tillgänglig från: Kontzoglou, K., Moulakakis, K.M., Konofaos, P., Kyriazi, M., Kyroudes, A. & Karakitsos, P. The Role of Liquid-Based Cytology in the Investigation of Breasy Lesions Using Fine_needle Aspiration: A Cytohistopathological Evaluation. Journal of Surgical Oncology 2005;89: