$-0$/,1. Eleanor Bremler. Biologiskt aktiva naturprodukter i läkemedelsutveckling, 5p Uppsala universitet Höstterminen 2005

Transkript

1 $-0$/,1 Uppsala universitet Höstterminen 2005

2 ,QQHKnOOVI UWHFNQLQJ Innehållsförteckning... 2 Inledning... 3 Historisk bakgrund... 3 Metodbeskrivning för isolering av ajmalin... 4 Beskrivning av biologisk aktivitet... 5 Klinisk effekt och användning... 5 Referenser (6)

3 ,QOHGQLQJ Ajmalin är en tertiär alkaloid som förekommer naturligt i växten 5DXYROILDVHUSHQWLQD (L.) Benth ex Kurz (figur 1). Det är en vintergrön, halvmeterhög buske med gröna, spetsiga och avlånga blad. Blommorna sitter i oregelbundet kvastliknande knippen och är vita med nyans av violett. Blomfodret är slätt och klarrött. Frukten är en äggformig lilasvart stenfrukt. Figur 1. Bild på 5DXYROILDVHUSHQWLQD(L.) Benth ex Kurz ( Rauvolfia växer i lövskogar och är på den indiska halvön associerad med bambuskogar. Växten hör hemma i Indien, Pakistan, Sri Lanka, Burma och Thailand. 5DXYROILD VHUSHQWLQD innehåller ett flertal alkaloider som är farmakologiskt aktiva. 90 % av totala mängden alkaloider i rauvolfiaroten finns i rotbarken. Den procentuella mängden alkaloider beror på växtens geografiska läge samt årstiden då växten skördats. Växtens ålder har däremot ingen påverkan på mängden alkaloider. Reserpin är den viktigaste alkaloiden i Rauvolfia Serpentina och används i en rad läkemedel i västvärlden mot hypertension och vid vissa mentala sjukdomar (Phytomedical Technologies Inc.). Ajmalin däremot, har inga sedativa eller hypotensiva effekter utan används som terapi vid hjärt- och kärlsjukdomar tack vare dess antiarytmiska effekt (Kirillova HWDO, 2001). +LVWRULVNEDNJUXQG Legenden om rauvolfiaplantan i Indien har sitt ursprung i en saga om en mungo som tuggade på växtens blad för att få styrka innan mötet med en kobra i strid. Att en sinnessjuk person befriades av galenskap när han åt av rauvolfiaroten bidrog till att legenden om växtens läkande krafter tilltog. Indiska medicinmän gav saft från bladen och pulveriserad rot mot sjukdomar som epilepsi, sömnlöshet, sinnesjukdom, diarré, kolera, huvudvärk och blindhet (Gupta, 2000). 5DXYROILD VHUSHQWLQD heter Sarpagandha på sanskrit och finns med i den ayurvedska farmakopén (Gupta, 2000). Den har använts i flera sekel i Indien som feberstillande medel och som antidot vid insekts- och ormbett. Den äldsta skriftliga referensen till rauvolfia finns i den ayurvedska texten Charaka Washita, som är en samling gammal visdom som överförts genom hörsägen i tusentals år innan den skrevs ner 600 f.kr. (Phytomedical Technologies Inc.). 3 (6)

4 Det sägs att Mahatma Gandhi drack te av rauvolfia regelbundet för att hjälpa honom i meditationen (Phytomedical Technologies Inc.). I västvärlden blev rauvolfia inte känd förrän på 1600-talet då den tyska botanisten Dr. Leonard Rauwolf namngav den. Men europeiska och amerikanska läkare trodde inte på västens läkande verkan utan såg på det som indiskt kvacksalveri (Gupta, 2000; Phytomedical Technologies Inc.) lyckades Dr. Salimuzzaman Siddiqui och Dr. Rafat Hussain Siddiqui, i Ayurvedic and Unani Tibbia College, isolera fem kristallina alkaloider. Tre var vita och namngavs ajmalin, ajmalinin och ajmalicin efter Hakim Ajmal Khan, grundaren av forskningsinstitutet. De andra två var gula till färgen och kallades serpentin och serpentinin. Ram Nath Chopra vid School of Tropical Medicine i Calcutta undersökte tillsammans med sina forskare olika indiska läkemedel och rapporterade i en rad publikationer i början av 1933 att rå rauvolfiarot hade sedativa och blodtryckssänkande egenskaper (Gupta, 2000; Phytomedical Technologies Inc.). Men förbryllande nog kunde inte de isolerade alkaloiderna matcha den oerhört starka effekten som hela roten hade. 1944, hade de lyckats spåra aktiviteten till rotens kåda. Men deras analytiska teknik räckte inte till för analys av det amorfa materialet (Phytomedical Technologies Inc.). Under tiden hade den kliniska användningen av rauvolfia ökat stadigt och en miljon patienter beräknades ta medicinen mot högt blodtryck under början av andra världskriget. Dr B B Bhatia, i Lucknow s King Edward Memorial Medical College, beskrev rauvolfia 1942 som ett läkemedel vars effekt på högt blodtryck är överlägsen de läkemedel som hittills använts. Han konstaterade att 5DXYROILDVHUSHQWLQD inte är botande men ger utan tvivel den bästa lindringen mot symptomen som orsakas av högt blodtryck (Gupta, 2000; Phytomedical Technologies Inc.). Hjärtspecialisten Dr. Rustom Vakil, som återvände till Indien efter studier i England, satte igång kliniska försök kring 5DXYROILD VHUSHQWLQD som blev klara I de flesta fall sänktes både det systoliska och diastoliska trycket (Gupta, 2000; Phytomedical Technologies Inc.). Detta gjorde att den första bevisade blodtrycksänkande medicinen introducerades i Västmedicinen. Till skillnad från Chopra vid School of Tropical Medicine i Calcutta, hade den schweiziska kemisten Dr. Emil Schlittler alla nödvändiga analytiska metoder till hands. I CIBA Laboratories i Basel, lyckades han extrahera och isolera kristallint ajmalin från råmaterialet. När Sir Robert Robinson från Oxford University besökte CIBA Laboratories 1947, bad han om ajmalin för att kunna undersöka dess kemiska struktur. Modertinkturerna som innehöll alla rauvolfia-alkaloider utom ajmalin sparades och Schlittler lät sina studenter på Basel universitet försöka få ut de andra alkaloiderna. Efter Vakils sensationella forskningsresultat 1949, lyckades de isolera serpentin och strukturen bestämdes. Schlittler började sedan titta på den lerbruna återstoden. Han kom fram till att det var samma fraktion som hade förbryllat Chopras kemister i Calcutta, det vill säga kådan. Tillsammans med Dr Johannes Müller lyckades Schlittler splittra kådan i fraktioner. En av fraktionerna bestod av vita kristaller. Farmakologisten H J Bein testade substansen på djur, vilka blev tysta i timmar. Schlittler, Müller och Bein hade 1952 alltså hittat den sedativa fraktionen i 5DXYROILDVHUSHQWLQD, vilken kallades reserpin (Gupta, 2000). 0HWRGEHVNULYQLQJI ULVROHULQJDYDMPDOLQ Ajmalins kemiska struktur (figur 2) är mycket komplex och det har därför varit mycket svårt att syntetisera alkaloiden. Istället måste ajmalin extraheras och isoleras från växten5dxyroildvhushqwlqd. Svårigheter att odla 5DXYROILDVHUSHQWLQD krävde förr import av växten, vilket inte riktigt tillgodosåg behoven av råmaterial (Kirillova HWDO, 2001; Dogru HWDO, 2000). 4 (6)

5 Figur 2. Kemisk struktur av ajmalin (Kiesecker HWDO, 2004) Idag har man istället lyckats odla stamkulturer av Rauvolfia serpentina Benth och använt dessa i framställningen av ajmalin för forskning. Kirillova et al. (2001) använde stammen K27 för att isolera ajmalin från vävnaden av Rauvolfia serpentina. Prov från kulturen homogeniserades i natriumfosfatbuffert med ph 7,8 och precipitaten centrifugerades bort. För att isolera ajmalin användes affinitetskromatografi med en kolonn packad med azoadsorbent innehållande katekol som ligand. Kolonnen tvättades med ättiksyra innan provet lades på. Kolonnen tvättades sedan med vatten och ajmalin eluerades ut med en gradient av olika NaCl-koncentrationer i saltsyra. Kloroform tillsattes sedan i provet och ajmalin extraherades. Det organiska lösningsmedlet evaporerades och isolerad ajmalin i fast form erhölls (Kirillova et al., 2001). %HVNULYQLQJDYELRORJLVNDNWLYLWHW Ajmalin blockerar natriumjonkanaler i hjärtat så att utströmningen av natriumjoner från myocyterna minskar vilket innebär att den snabba depolariseringen bromsas (Bahníková HW DO, 2002). Human ether a-go-go related gene (HERG) kanaler korrelerar till hjärtats kaliumström och en blockering av dessa kan orsaka dödlig kammararytmi. Kiesecker HW DO (2004) undersökte ajmalins effekt på HERG-kanaler i humana embryonjurceller. De kom fram till att ajmalin blockerade HERG-kanalerna vid IC 50 1,0 µmol/ l, vilket är inom det terapeutiska intervallet. Natriumjonströmmen blockerades av ajmalin vid IC 50 -värden 6,6-8,2 µmol/ l. Detta innebär att HERG-blockaden förmodligen bidrar till ajmalins antiarytmiska effekt (Kiesecker HWDO, 2004)..OLQLVNHIIHNWRFKDQYlQGQLQJ Ajmalin är ett mycket effektivt antiarytmiläkemedel och är klassificerad enligt Vaughan-Williams som klass 1a. Den har använts kliniskt i över 40 år vid behandling av takyarytmier i hjärtats förmak och kammare (Bahníková HWDO, 2002). Vid ihållande ventrikulär takykardi har behandling med ajmalin rapporterats vara mer effektiv än lidokain (Bahníková HWDO, 2002; Kiesecker HWDO, 2004). Ajmalin har också visats sig vara mycket effektivt vid behandling av patienter med Wolff- Parkinson-White-syndrom (Bahníková HW DO, 2002; Brugada HW DO, 2003; Kiesecker HW DO, 2004) samt spelat en stor roll vid diagnostisering av Brugadas syndrom. För att kunna tyda de elektrokardiografiska avvikelserna hos patienter med Brugadas syndrom krävs en blockering av natriumjonkanaler, vilket kan göras med klass 1a eller 1c antiarytmiläkemedel (Fish och Antzelevitch, 2004). Ajmalin sänker retledningshastigheten och förlänger refraktärperioden i hjärtat (Bahníková HWDO, 2002). Ajmalin kan endast ges intravenöst, vanligtvis genom korttidsinfusion. Optimal antiarytmisk effekt uppnås vid plasmakoncentrationer 0,4-2,0 µg/ l (Kiesecker HWDO, 2004). 5 (6)

6 5HIHUHQVHU %DKQtNRYi00DWHMRYL 33iVHN0ãLPXUGRYi0ãLPXUGD-$MPDOLQH-induced block of sodium current in rat ventricular myocytes. 6FULSWD0HGLFD%512,, Brugada, J., Brugada, P., Brugada, R. The ajmaline challenge in Brugada syndrome. (XURSHDQ+HDUW -RXUQDO,, Dogru, E., Warzecha, H., Seibel, F., Haebel, S., Lottspeich, F., Stöckigt, J. The gene encoding polyneuridine aldehyde esterase of monoterpenoid indole alkaloid biosynthesis in plants is an ortholog of the α/ β hydrolase super family. (XURSHDQ-RXUQDORI%LRFKHPLVWU\,, Fish, J. M. and Antzelevitch, C. Role of sodium and calcium channel block in unmasking the Brugada syndrome. +HDUW5K\WKP,, Gupta, S. P. K. Rustom Jal Vakil ( ) Father of modern cardiology, A profile. -RXUQDO,QGLDQ$FDGHP\RI&OLQLFDO0HGLFLQH / JIACM/ JanMar2002/ indjiacmhistory OfMedicine.html, Kiesecker, C., Zitron, E., Lück, S., Bloehs, R., Scholtz, E. P., Kathöfer, S., Thomas, D., Kreye, V. A. W., Katus, H. A., Shoels, W., Karle, C. A., Kiehn, J. Class 1a anti-arrhytmic drug ajmaline blocks HERG potassium channels: mode of action. 1DXQ\Q6FKPLHGHEHUJ V$UFKLYHVRI3KDUPDFRORJ\,, Kirillova, N. V., Smirnova, M. G., Komov, V. P. Sequential isolation of superoxide dismutase and ajmaline from tissue cultures of 5DXZROILDVHUSHQWLQD Benth. $SSOLHG%LRFKHPLVWU\DQG0LFURELRORJ\,, Phytomedical Technologies, Inc. / Plant/ Reserpine.asp, (6)