Metoder för att påvisa juverinfektion utan kliniska symtom hos get

Transkript

1 Bilaga 7 till Handledning för kontroll av hantverksmässig tillverkning av ost Metoder för att påvisa juverinfektion utan kliniska symtom hos get Av Ylva Persson

2

3 Bilaga 7 Metoder för att påvisa juverinfektion utan kliniska symtom hos get Bakgrund I getmjölksproduktionen är juverinflammation (mastit) den getsjukdom som kräver flest veterinärbehandlingar (Indrebö, 1987). Juverinflammation ger också sämre ostutbyte samt ökar riskerna för livsmedelsburna smittor, särskilt om getmjölken inte pastöriseras. Det är därför viktigt att kunna ställa rätt diagnos och sätta in rätt åtgärd för att kunna minska förekomsten av juverinflammation hos get. Detta leder i sin tur till förbättrad juverhälsa, livsmedelssäkerhet, ostproduktion, samt en förbättrad djurvälfärd inom getmjölksproduktionen. Subklinisk juverinflammation ger, till skillnad från klinisk juverinflammation, inga symtom på sjukdom hos djuret och heller inga synliga förändringar på mjölken. Istället kan man med hjälp av olika inflammationsmarkörer hitta förändringar i mjölken. Subklinisk juverinflammation hos get är vanligt förekommande (35-70 % enligt Leitner et al., 2004) och orsakas främst av bakterier så som koagulasnegativa stafylokocker (KNS) och Staphylococcus aureus (Mörk et al., 2007, Bergonier et al., 2003). Dessa bakterier kan även orsaka matförgiftning hos människa (Vernozy-Rozand et al., 1996). Subkliniska juverinflammationer är betydelsefulla för den allmänna juver(o)hälsan i getbesättningen eftersom getter med subklinisk juverinflammation ofta fungerar som effektiva smittspridare. Subkliniska juverinflammationer kan även blossa upp och bli kliniska juverinflammationer, vilket ger djurlidande. Eftersom subklinisk juverinflammation inte ger några synliga förändringar på geten eller dess mjölk måste man förlita sig på olika mätmetoder för att kunna ställa rätt diagnos. För närvarande finns inga riktigt bra metoder för användning på get och getnäringen är i stort behov av enkla och pålitliga markörer som helst går att använda ute i besättningen. Ett mycket viktigt tecken på subklinisk juverinflammation hos mjölkko är förhöjt antal celler i mjölken. Cellerna (oftast vita blodkroppar) stiger i mjölken vid inflammation i juvret. Mjölkens celltal har emellertid visat sig vara mer svårtolkat hos get. Getter har jämfört med kor och tackor generellt högre celltal i mjölken. Getens celltal stiger dessutom under hela laktationen (Paape och Capuco, 1997) och varierar mycket mellan individer och mellan besättningar (Schaeren och Maurer, 2006). På mjölkkor är CMT (California Mastitis Test) en vanlig fältmetod för att påvisa celler i mjölk. En del författare (Bergonier et al., 2003, Schaeren och Maurer, 2006) menar att CMT i fält är en opålitlig metod för att diagnostisera juverinfektion hos get. Andra författare anser att CMT-test är användbart för att diagnostisera avsaknad av infektion (Karzis 2007). Förutom celltal och CMT finns en mängd substanser i mjölk som har visat sig förändras vid juverinflammation hos kor (Kitchen, 1981). Laktos i mjölk har i flera studier på både kor Åkerstedt 2003) och getter (Leitner et al., 2004) visat sig vara en markör för juverinflammation och skulle kunna vara möjlig att mäta i fält på gårdsnivå. Laktoshalten sjunker i den juverdel som är inflammerad. Ytterligare markörer för juverinflammation är ph och flockningstid som också är möjliga att analysera på gården. Mjölkens ph stiger vid juverinflammation och flockningstiden, som i sin tur är ett mått på mjölkens ystningsförmåga, förlängs. Kunskapen om subkliniska juverinflammationer och hur man bäst diagnostiserar dessa hos get är alltså förhållandevis bristfällig. Studier under svenska förhållanden saknas i det närmaste

4 helt. Eftersom det inte finns någon bra metod för att identifiera juverinflammation (dvs. närvaro av inflammationsmarkörer som t.ex. celler) hos getter har vi i denna studie fått förlita oss på enbart bakterieväxt som ett mått på juverhälsan. I fortsättningen kommer därför den mer korrekta benämningen juverinfektion (växt av bakterier i mjölk) att användas. Syftet med denna studie var att hitta robusta fältmetoder för att hitta juverinfektion hos get. I studien jämfördes undersökning av CMT, celler och laktos på gården med mätning av celler och laktos på laboratorium (lab) för att se om metoderna fungerade i fält. Vidare relaterades celltalen och laktoshalten med bakteriologiska fynd för att se om dessa markörer var användbara för att hitta getter med juverinfektion. På två av gårdarna mättes också mjölkens ph och flockningstid. Det övergripande målet med denna studie är en uthållig och ekonomiskt lönsam svensk getnäring som bygger på friska getter och säkra livsmedel av hög kvalitet Material och metoder Djur och gårdar Etthundraelva getter i fem besättningar (fyra i Jämtland och en i Uppland) provtogs vid ett tillfälle i augusti En utbildad provtagare skötte provtagningen på samtliga getter. Getterna var i huvudsak av lantras. Fyra gårdar provtogs vid morgonmjölkningen och en gård provtogs vid eftermiddagsmjölkningen. Besättningsstorleken varierade mellan 28 och 165 mjölkande getter. Endast kliniskt friska djur med normal mjölk ingick i försöket. Provtagningen utfördes på juverdelsnivå, dvs. prov från höger och vänster juverhalva togs från samtliga getter i studien. Djurens ålder noterades i ett protokoll. Provtagning och analysmetoder Lika delar mjölk och CMT-vätska blandades i en så kallad paddel. Reaktionen avlästes inom några sekunder efter provtagning och graderades från ett till fem, där fem indikerade högst celltal. Mjölk droppades på ph-papper direkt från spenen och ph-värdet kunde efter några sekunder avläsas i form av ett färgomslag. Från varje juverdel togs prov i ett mjölkrör för bakteriologisk odling. Direkt efter provtagning doppades en mastistrip-pinne i mjölkröret för en annan typ av bakteriologisk odling. Mjölkproverna skickades samma dag som provtagningen till mastitlab, SVA för odling av bakterier. Från varje juverdel mjölkades omkring 80 ml mjölk i ett provrör med tillsatt bronopol som konserveringsmedel. Ur denna burk togs sedan prov för analys av celler i fält med DeLavals celltalsräknare (DCC) samt analys av laktos (samt fett, protein och torrsubstans (TS) som analyseras samtidigt) med en Miris mjölkmätare. Resten av mjölken skickades till SLU, institutionen för husdjurens utfordring och vård för analys av celltalet med Fossomatic samt analys av laktos (samt fett, protein och TS). På två gårdar gjordes även ph-mätning med en ph-mätare och dessutom mättes mjölkens flockningstid, dvs. den tid det tar för mjölken att flocka sig efter tillsats av löpe. Statistik Statistik har utförts av företaget Statisticon. Nedan följer några förklaringar av de tester som utförts.

5 Kappakoefficienten är ett mått på hur väl två bedömningar stämmer överens och koefficienten brukar graderas på följande sätt: < 0,20 Ingen/mycket svag korrelation 0,21 0,40 Svag korrelation 0,41 0,60 Hyfsad korrelation 0,61 0,80 God korrelation 0,81 1,00 Mycket god korrelation Intra Class Correlation (ICC) används för att visa likheter mellan olika mätmetoder och ICC är den andel av variansen som ses mellan olika prover till skillnad från variansen mellan de olika mätmetoderna. ICC=variation mellan prover/(variation mellan prover + variation mellan mätmetoder). Om ICC < 0.5 är alltså variansen mellan mätmetoderna större än den mellan prover, och överensstämmelsen därmed inte så god. I en regressionsmodell har hänsyn tagits till flera variabler. Efter varje regression har den variabel med högst p-värde (som är minst signifikant) plockats bort. En GEE-metod (Generalised Estimating Equations) har använts som kompenserat för variation mellan olika besättningar. Resultat och diskussion Hur fungerade fältmetoderna i relation till referensmetoderna? Celler Celltalsmätning i fält med celltalsräknare (DCC) hade mycket hög samstämmighet (ICCkoefficient 0,959) med celltalsmätning på lab utförd med Fossomatic. CMT i sin tur hade god korrelation (0,65) till celltalsmätning i fält. I fortsättningen ingår endast celltal i fält i analyserna. Både CMT och analys med DCC uppfattades som enkla och snabba metoder i fält. CMTmätningen är dessutom en billig metod. Laktos Laktos i fält hade en viss överensstämmelse (ICC-koefficient 0,481) med referensmätningen på lab. Dock hade mätningen i fält färre decimaler vilket gjorde att dessa mätningar inte var tillräckligt noggranna för att visa den variation i laktoshalt som referensmätningen på lab noterade..jämförelser mellan mätvärden med olika antal decimaler är inte helt tillförlitlig. Det är troligt att noggrannare mätvärden i fält skulle ge högre korrelation. I fortsättningen ingår endast laktos i fält i analyserna. Laktosmätning i fält tog relativt lång tid med Miris analysinstrument och uppfattades som krångligare än mätningen med DCC. Protein, fett och TS Protein, fett och TS hade mycket god överensstämmelse (ICC-koefficient 0,864, 0,979, 0,964 respektive) mellan fält- och labmätning. Mätning i fält av dessa parametrar med Miris analysinstrument uppfattades som ganska omfattande Bakteriologi Totalt växte bakterier hos 30 getter. Nio av dessa hade bakterieväxt på båda juverhalvorna och hos tre av dessa getter var det olika typer av bakterier som växte från de båda juverhalvorna. Det vanligaste fyndet var koagulasnegativa stafylokocker (KNS), följt av Stafylococcus aureus. Av de koagulasnegativa stafylokockerna var 73 % penicillinasnegativa (pc-), dvs.

6 känsliga för penicillin, och 27 % var penicillinaspositiva (pc+), dvs. penicillinresistenta. S aureus hittades i nio juverdelar (åtta getter) och samtliga dessa var pc-. En get hade växt av Streptococcus dysgalactie i båda juverdelarna. I flertalet mjölkprov från två av gårdarna växte det mycket blandflora vilket är en indikation på förorening vid provtagning. Förhållandevis få getter hade infektion, vilket kan förklaras både av en god juverhälsa och att man inte hittar alla bakterier. Det är väl känt att man vid ett enstaka provtagningstillfälle inte hittar alla djur med infektion på grund av att de för tillfället inte utsöndrar bakterier. För att fånga upp fler getter med bakterieväxt bör man i kommande studier göra upprepade provtagningar. Hur väl kunde markörerna identifiera bakterieväxt? Celler Det fanns ett mycket starkt samband (p-värde = 0,000199) mellan CMT och växt av bakterier. CMT 1 tydde i denna studie på att juvret var fritt från bakterier och CMT 2 indikerade växt av bakterier. Även celltalet mätt med DCC korrelerade starkt (p-värde = 0, ) till bakterieväxt. Getens ålder spelade mindre roll för celltalet. De getter som hade positiv bakterieväxt hade också högst celltal och de juverhalvor som hade positiv bakterieväxt hade också högre celltal än de juverhalvor som inte hade bakterieväxt. I en regressionsmodell där alla ingående markörer ingick var det CMT som föll ut som den bäst förklarande variabeln för bakterieväxt. Enligt litteraturen stiger cellerna under hela laktationen (Paape och Capuco, 1997) och det är därför svårt att säga hur en CMT- eller celltalsmätning skulle se ut i början av laktationen. I kommande studier skulle man därför vilja ta prov i tidig, mitt- och sen laktation. Laktos Det fanns inga samband mellan laktos och bakterieväxt. ph Mätning av ph med ph-papper var en snabb och enkel metod som dock visade sig vara mycket svårbedömd på grund av det otydliga färgomslaget. Mätning med ph-mätare var snabb och enkel och gav ett mer exakt värde. Mjölkens ph (mätt med ph-mätare) var högre i de prover som hade bakterieväxt jämfört med dem som inte hade bakterieväxt, men det förekom ganska stora variationer och skillnaden var inte signifikant. Flockningstid Det fanns inget samband mellan flockningstid och celltal, eller mellan flockningstid och bakterieväxt, men det fanns ett samband mellan flockningstid och ph.

7 I tabell 1 redovisas CMT, celler, laktos, bakteriologi, ph och flockningstid för varje besättning och totalt. Tabell 1. Medelvärden för CMT, celltal (fält), laktos (fält), bakterieväxt av S aureus samt övriga bakterier, ph samt flockningstid. Inom parentes efter medelvärdet anges min- och maxvärden. CMT Celler (1000/ ml) Laktos (%) ph Gård A (n=10) Gård B (n=24) Gård C (n=24) Gård D (n=26) Gård E (n=27) Totalt (n=111) 1,1 (1-2) 1,5 (1-3) 1,9 (1-5) 1,3 (1-3) 1,9 (1-4) 1,6 (1-5) 129 (15-629) 498 ( ) 793 ( ) 465 ( ) 490 ( ) 519 ( ) 4,32 (4,10-4,50) 4,38 (4,10-4,70) 4,28 (3,85-4,50) 4,44 (4,15-4,70) 4,39 (3,93-4,75) 4,37 (3,85-4,75) Bakterieväxt S aureus (antal getter) Bakterieväxt Övriga bakterier (antal getter) 0 1 6,6 (6,43-6,67) 0 6 6,6 (6,45-6,74) (n=15) 8 2 6,5 (6,36-6,65) (n=12) ,5 (6,36-6,74) n=37 Flockningstid (min) 6,3 (3-9) 8,1 (3-14) (n=15) 7,1 (4-20) (n=12) 7,3 (3-20) n=37 Praktiska råd och tillämpningar utifrån denna studie Både celler och CMT visade sig kunna identifiera juverinfektion i denna studie. Då CMT är en enkel och billig metod som inte kräver några större investeringar vill jag rekommendera alla getbesättningar att införskaffa en så kallad paddel och CMT-vätska. För större besättningar kan en celltalsmätare vara ett bra komplement då den ger en mer exakt information om celltalet. Efter genomgång av en van provtagare (t.ex. besättningsveterinären) och lite träning, kan alla lära sig CMT-bedömning. Det kan dock vara bra att, särskilt i början, verifiera sina resultat med en mer objektiv metod, t.ex. celltalsmätning med DCC. Jag rekommenderar att CMT-undersöka alla getter i besättningen i början av laktationen så fort råmjölksperioden är över. De getter som har CMT 1 i båda juverdelarna och tidigare god juverhälsa kan grupperas som friska getter. De getter som har CMT 2 i minst en juverdel och tidigare problem med juverhälsan grupperas som riskgetter. De friska getterna bör om möjligt hållas åtskilda från riskgetterna. Riskgetterna bör mjölkas sist. Getter med CMT 2 i någon juverdel och okänd juverhälsostatus provtas för bakteriologisk undersökning och grupperas som riskgetter. Mjölkproven bör sändas i ett mjölkrör eller som Mastistrip till SVA, Uppsala. Djur med växt av Staphylococcus aureus bör om möjligt slås ut. Under fortsatt laktation CMT-testas samtliga djur minst en gång per månad och provtas enligt ovan. Det allra bästa är förstås att bedöma CMT-reaktionen enligt skalan 1-5, men med utgångspunkt från resultaten i denna studie skulle man kunna förenkla bedömningen till: Ingen reaktion (dvs. ingen förändring i mjölken konsistens) Reaktion (allt från svag förtjockning till gelbildning) Ingen åtgärd, gruppera som frisk get Provta geten för bakteriologisk odling, gruppera som riskget

8 Mätning av mjölkens ph med en ph-mätare skulle eventuellt kunna bidra med ytterligare information för att identifiera eventuella juverinfektioner. Laktos har i denna studie inte kunnat användas för att identifiera juverinfektion. Dock kan Miris mätutrustning användas för att analysera mjölksammansättning på gårdsnivå, vilket kan vara av värde för ostproduktionen. Kommande studier I skrivande stund har anslag sökts för att identifiera fler möjliga mastitmarkörer (t ex laktatdehydrogenas). I kommande studier vore det även önskvärt att tydligare kunna fastställa gränsvärden för CMT och celltal vid olika tidpunkter i laktationen samt att ytterligare jämföra bakteriologisk odling från mjölkrör och Mastistrip, helst med upprepade provtagningar. Tack Ett stort tack till Nordiska ministerrådet och Livsmedelsverket som gjort studien möjlig och till DeLaval som lånat ut celltalsmätaren. Tack också till Ida Olofsson, JiLU, Rösta mejeri för ovärderlig hjälp med allt! Och slutligen tack till alla djurägare och alla fina getter. Ylva Persson Leg. veterinär, VMD. Bitr. statsveterinär Svensk Mjölk/Sektionen för lantbrukets djur Enheten för djurhälsa och antibiotikafrågor Statens Veterinärmedicinska Anstalt (SVA) SE Uppsala Telefon ylva.persson@sva.se Referenser Bergonier D, de Crémoux R, Rupp R, Lagriffoul G, and X. Berthelot Mastitis of dairy small ruminants. Vet Res. 34: Review. Indrebö A Jursykdomer hos småfe. Kompendium för veterinärstudenter. Karzis, J., Donkin, E.F., and I.M. Petzer The influence of intramammary antibiotic treatment, presence of bacteria, stage of lactation and parity in dairy goats as measured by the California Milk Cell Test and somatic cell counts. Onderstepoort J Vet Res. 74:161-7 Kitchen, B.J Review of the progress of dairy science: Bovine mastitis: milk compositional changes and related diagnostic tests. J. Dairy Res. 48: Leitner G., Merin U., and N. Silanikove Changes in milk composition as affected by subclinical mastitis in goats. J Dairy Sci. 87: Moroni, P., Pisoni, G., Ruffo, G., and P.J. Boettcher Risk factors for intramammary infections and relationship with somatic-cell counts in Italian dairy goats. Prev Vet Med. 12: Mörk, T., Jarle Fiskvik, O., Jörgensen, H.J., Steihaug Barstad, A. och L. Sölveröd Mastitt hos geit. Forelöpige resultater fra en studie i 6 besetninger. Opubl. Paape MJ and Capuco AV Cellular defense mechanisms in the udder and lactation of goats. J Anim Sci. 75: Schaeren, W., and J. Maurer Prevalence of subclinical udder infections and individual somatic cell counts in three dairy goat herds during a full lactation. Schweiz Arch Tierheilkd. 148: Vernozy-Rozand, C., Mazuy, C., Prevost, G., Lapeyre, C., Bes, M., Brun, Y., and J. Fleurette Enterotoxin production by coagulase-negative staphylococci isolated from goats' milk and cheese. Int J Food Microbiol. 30: Åkerstedt M Förändras mjölkens proteinsammansättning i separata juverdelar i samband med höga celltal (SCC)? Examensarbete 181, SLU.

9 Råd rörande juverhälsa för mjölkkobesättningar som inte är med i kokontrollen För att nå en god juverhälsa i en mjölkkobesättning krävs god hygien och bra smittskyddstänkande tillsammans med kunskap om besättningens juverhälsoläge. Besättningar som är med i kokontrollen får varje månad ett mått på kornas juverhälsoläge i form av ett celltal. Celltalet är ett mått på juverinflammation eftersom cellhalten i mjölken stiger vid en juverinflammation (mastit). Besättningar som inte är anslutna till kokontrollen bör utföra cellkontrollen på gården, antingen med en celltalsräknare (tex delaval DCC) eller med CMT (California Mastitis Test). Den sistnämnda metoden mäter indirekt mjölkens celltal. Undersökning med CMT och gruppering Vi rekommenderar att CMT- undersöka (se separat bilaga för instruktion) alla nykalvade kor och kvigor så fort mjölken blivit vit, vilket i allmänhet inträffar vid 5-6:e urmjölkningen. Därefter bör samtliga kor undersökas varje månad samt vid misstanke om juverhälsoproblem. Slutligen bör samtliga kor undersökas ca två veckor före beräknad sinläggning. CMT-undersökningen ska ligga till grund för gruppering, provtagning samt eventuell behandling. De kor som har CMT 1-2 och tidigare god juverhälsa grupperas som FRISKA KOR. De kor som har haft tidigare problem med juverhälsan och höga CMT-värden vid undersökningen grupperas som RISKKOR. Om CMT 3 tas ett mjölkprov för bakteriologisk undersökning. Odlingarna bör sändas i ett mjölkrör eller som Mastistrip till SVA Uppsala. Kor som har kategoriserats som riskkor bör stå uppstallade för sig samt mjölkas sist. Åtgärder vid juverinflammation Kor med växt av Staphylococcus aureus bör omgående slås ut. Om kon får kliniska symtom på juverinflammation (feber, juversvullnad mm) måste veterinär tillkallas för bedömning, provtagning och behandling. Endast akuta kliniska juverinflammationer bör behandlas med antibiotika under laktation. En viktig del av behandlingen av juverinflammationer är den understödjande. Den består av extra urmjölkningar, oxytocininjektioner, smärtstillande och febernedsättande samt vätska, allt efter behov. Självklart ska kons miljö optimeras i form av foder och vatten av bra kvalitet och en ren och mjuk liggplats. Subkliniska juverinflammationer ska inte behandlas med antibiotika under laktation. De ska istället åtgärdas med smittskyddsinsatser (gruppering, mjölkningsordning, hygien), sinläggning av juverdel-/ar, utslaktning samt sintidsbehandling med antibiotika. Sintiden Två veckor före beräknad sinläggning CMT-undersöks samtliga kor. Om CMT 3 tas ett mjölkprov för bakteriologisk undersökning. Kor med känd infektionsstatus behöver inte provtas. Kor med CMT 3 och/eller bakterier i juvret sintidsbehandlas med antibiotika efter kontakt med och förskrivning av veterinär. Sintidsbehandling med antibiotika i form av juvertuber görs efter noggrann rengöring av spenspetsen direkt efter sista urmjölkningen. Alla fyra juverdelar ska alltid behandlas. Effekten av behandlingen bör följas upp vid kalvning och under kommande laktation. Även under sintiden är det viktigt att gruppera korna utifrån om de bedöms vara friska kor eller riskkor. Foder, vatten och liggyta ska förstås hålla god hygienisk kvalitet även under sintiden. Liten ordlista CMT Mastit Klinisk mastit Subklinisk mastit Akut mastit Kronisk mastit Mastistrip Intramammarier California Mastitis Test, ett test som indirekt mäter cellhalten i mjölken Juverinflammation Juverinflammation med synliga symtom i form av feber, juversvullnad mm Juverinflammation utan symtom på djuret eller synliga förändringar i mjölk Juverinflammation som uppträder plötsligt, kan vara både klinisk och subklinisk Juverinflammation med ett mer utdraget förlopp, kan vara både klinisk och subklinisk Provtagningskassett för bakterieodling på mjölk Juvertuber, oftast med antibiotika

10 California Mastitis Test (CMT) Princip Testen är en indirekt mätning av celltalet i mjölk genom att testvätskan reagerar med DNA i cellkärnorna varpå viskositeten (konsistensen) ökar. Utförande Vid fältarbete används en plastpaddel försedd med fyra låga skålar, en för var juverdel. Efter att först ha mjölkat ur några strålar i ett kontrollkärl mjölkas, från vardera juverdel, några strålar i var och en av skålarna. Håll paddelns handtag i riktning mot kons huvud. Det gör det lätt att avgöra vilken skål som hör till vilken juverdel. När mjölk samlats upp från alla juverdelar vänds paddeln nästan lodrätt så att en del av mjölken rinner ut (detta görs i lämpligt kärl eller vask). En del paddlar har ett streck som visar hur mycket mjölk som ska vara kvar (ca 2 ml). Testvätska tillförs sedan från en sprutflaska av plast. Undvik inblandning av luft eftersom det gör avläsningen svårare. Volymförhållandet mellan mjölk- och testvätska skall vara 1:1 eller 1:1,5. Därefter blandas mjölk och testvätska genom att paddeln rörs i långsamma cirkulära rörelser. Resultatet avläses under rörelse inom sekunder. Efteråt hälls blandningen i ett uppsamlingskärl eller i vask och paddeln rengörs i vatten. Torkning är inte nödvändig. Bedömning av CMT-reaktion Tecken Innebörd Synlig reaktion 1 Negativ Blandningen förblir homogen utan tecken på förtjockning. 2 Spår En svag förtjockning uppstår, som syns bäst när man sakta vickar paddeln fram och tillbaka så att blandningen flyter i ett tunt skikt på botten. Denna svaga förtjockning försvinner lätt om man fortsätter att hålla vätskan i rörelse. 3 Svagt En tydlig förtjockning uppstår men ingen tendens till positiv gelbildning. Även här kan reaktionen försvinna vid 4 Tydligt positiv 5 Starkt positiv fortsatt rörelse av paddeln. Blandningen blir omedelbart trögflytande med en viss tendens till gelbildning. Vid rotation av paddeln samlar sig blandningen mot skålens mitt så att dennas botten exponeras längs kanten. När rotationen upphör flyter blandningen åter ut över skålens hela botten. Blandningen bildar en så stark gel att dess yta blir konvex. Vanligen bildas i centrum av gelen en topp som står kvar även sedan rotationen av paddeln upphört. Viskositeten är så stark att blandningen häftar vid skålens botten. Blandningens färg (bromkresolpurpur): Intensiv purpurlila = alkalisk reaktion (ph 7) Gul = sur reaktion (ph 5.2) Motsvarighet i celler/ml > Karin Persson Waller, Ylva Persson 2008