Föreläsningens innehåll. Rekombinanta läkemedel. genterapi. Generella principer. Några enzymbehandlingar. 13 november 2009 Patrik Samuelson

Transkript

1 Föreläsningens innehåll Rekombinanta läkemedel och genterapi 13 november 2009 Patrik Samuelson Rekombinanta proteiner Enzymer Monoklonala antikroppar Produktion av rekombinanta antikroppar i E. coli Nukleinsyror som potentiella läkemedel RNA RNA-DNA Genterapi virusvektorer icke-virala metoder Prodrug activation Rekombinanta läkemedel Rekombinanta läkemedel rekombinant insulin lanserat 1982 nu över 165 st. rekombinanta läkemedel på marknaden fviii, fviia, fix, hgh, FSH, EPO, tpa, INF-a,-b,-g, PDGF, diverse mab, m.fl. >750 kandidater i kliniska prövningar Major recombinant therapeutic products 2008 Anti-TNF Antibodies 16.4 bln US dollars Major Cancer Antibodies 15.6 bln US dollars Insulin and Insulin Analogs 10.9 bln US dollars Erythropoietins 10 bln US dollars Coagulation factors 5 bln US dollars hgh 2.7 bln US dollars Identifiering av protein Generella principer genetisk kod klona till värdorganism expressionsvektor produktion och rening av protein Några enzymbehandlingar Cystisk fibros: DNAse I - variant med minskad aktinbindning Alginate lyase - bryter ner alginate (högviskös polysackarid) från Pseudomonas Fenylketonuri (PKU, phenylketonuria): (brist på fenylalaninhydroxylas leder till förhöjd fenylalaninhalt) Phenylalanin ammonia lyase (PAL) - kapslat enzym ges oralt (för att minska immunologiska reaktioner vid upprepad behandling) Blodproppar (infarkter): recombinant tissue plasminogen activator (rh-tpa)

2 Antikroppar som läkemedel The development of antibody therapeutics Immunoglobulin G monoklonala antikroppar (mab) chimeric mab Problems Immunogenicity Problems with therapeutic antibodies Solutions Humanization (loop grafting, transgenic mice) Affinity/stability Difficult binding targets Antibody size prevents tissue permeation Selections on various library display formats Use other scaffolds Use Fab fragments S.Dübel Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, (2007) Monoklonala antikroppar Monoklonala antikroppar förhindra avstötning av transplantat behandling av hjärntumörer behandling av bröstcancer neutralisera toxiner mot RSV-infektion hos barn (ger skydd i ca dagar) behandling av kroniska inflammationssjukdomar, tex. Crohns sjd, rematoid artrit Development of monoclonal antibodies (part 1) Development of monoclonal antibodies (part 2) Figure 8-8 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Figure 8-8 (part 2of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

3 Production of hybrid cells (hybridomas if one of the parent cells was from a tumor cell line) Targeting aktiva substansen når inte målcellerna med tillräckligt hög koncentration åtgärd: targeting (liposomer) (toxingener i tumörinflitrerande lymfocyter) koppling till monoklonal antikropp (mab) enzym som omvandl prodrug till drug kopplad till mab Figure 8-7 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Humana monoklonala antikroppar human myeloma cell-linje finns ej försök med immunisering av människor oetiska mänskliga stamceller i SCID-möss transgena möss: humana Ig-gener (sedan standard hybridoma-metoder) Engineered antibodies humanized antibodies antibody fragments and conjugates Hudson P.J. And Souriau C. Nature Medicine 9, (2003) Human-Mouse monoclonal antibodies Phage display-based antibody engineering chimeric antibody humanized antibody MUS HUMAN generna kodande för CDR1, CDR2, CDR3 är från musmonoklonala antikroppar. kombineras med gener för humant IgG S.Dübel Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, (2007)

4 Recombinant methods to select human antibody fragments Nukleinsyror som läkemedel (DNA-bindare - antigen-oligonukleotid) RNA-bindare - antisense-rna RNA-bindare - antisense-oligonukleotid (dsdna-oligonukleotider som binder enzymer) ribozym RNA-DNA-komplex RNAi S.Dübel Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, (2007) Antisense Ribozymes = catalytic RNA RNA gen transkriberas till RNA RNA binder mål-rna X oligonucleotide binder mål-rna X modifierade nukleotider fosforotioatbindning peptide nucl. acid Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Ribozymes = catalytic RNA Hairpin ribozyme Table 6-5 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Rasmussen et al. Microbial Cell Factories :24 Jennifer A. Doudna & Thomas R. Cech Nature 418, (2002)

5 Ribozymes = catalytic RNA Targeted ribozymes Hammerhead ribozyme FIGURE Monika Martick and William G. Scott Cell 126: (2006). FIGURE Biotechnology: Applying the genetic revolution. Clark & Pazdernik, Academic Press RNA-DNA-molekyler Gene-patch oligonucleotide Gene-patch oligonucleotide: ribonukleotider och deoxyribonukleotider dubbel hårnålsformation metylering av syre på 2 -kolet i ribos central komplementär region, med en mismatch korrigerar punktmutation FIGURE 17.1 Biotechnology: Applying the genetic revolution. Clark & Pazdernik, Academic Press interfererande RNA GENTERAPI RNAi skyddar växter och djur från virus? nukleas binds till dsrna dsrna klyvs och dissocierar till ssrna ssrna-nukleas binder till mrna, som klyvs

6 Exempel på ärftliga sjukdomar: 7000 kända monogena sjukdomar defekter i metabolism Gauchers sjukdom Fenylketonuri felaktigt strukturellt protein hemofili A (blödarsjuka) Behandling av ärftliga sjukdomar specialdiet inhibering av enzymer ta bort toxiska ämnen ersättning av saknat/felaktigt ämne förändring av felaktigt ämne transplantation genterapi Genterapi Approved Gene Theraphy Clinical Trials tillförsel av en funktionell gen till en mänsklig cell för att korrigera en gendefekt somatiska celler (ej germ line cells ) 1990 första människo-genterapi-försöket virala vektorer icke-virala metoder Phases of Gene Theraphy Clinical Trials Diseases Addressed by Gene Theraphy Clinical Trials

7 Gene Types in Gene Theraphy Clinical Trials Frågeställningar hur nås målcellerna? hur ska genen levereras? hur stor del av målcellerna måste transfekteras? hur ska transkriptionen regleras? kommer nya genen behållas av cellen och transkription bli livslång? Selektiv expression i målceller Isolering av målceller + gene delivery målsökande vektor selektiv expression Genöverföringstekniker Icke-biologiska metoder Liposomer och poly-katjoner (lipofection) Elektroporering In situ naked-dna injektion Gene gun (DNA-coatade guldpartiklar) Receptormedierat upptag (DNAt bundet till protein som interagerar med receptor Biologiska metoder Transduktion (virus-medierad överföring) Inkapslade celler Promoter Suicid / toxisk gene Vectors Used in Gene Theraphy Clinical Trials DNA i främmande cell Integration i kromosom Episom

8 Liposom-DNA complex (lipoplex) Receptor-medierat upptag Ingen begränsning i storlek på DNA Episomal Expression under kort tid Många olika målcellstyper Instabilt in vivo Kärna Endosom Lysosom [H + ] Förbättring av receptormedierat upptag poly-l-lysin länkat till bindningsmolekylen DNA binds till + laddat polylysinςtoroid peptider som ökar cellspecifik bindning, membranfusion och internalisation av DNA peptider som stabiliserar DNA och underlättar inträde i kärnan Human artificial chromosomes ligering av kromosomala byggstenar: centromer, ori, telomer, diverse gener Deletion av material från en ursprunglig kromosom: trunkering in situ bildar minikromosom Odlade celler vävnadsspecifika celler som transfekterats och odlats upp i cellkultur celler inkapslade i semipermeabelt membran implanteras immunsystemet ser inte de inkapslade cellerna proteiner produceras Adenovirus vectors Do not integrate in the host genome Infect humans and some other primate species Provokes an immune response, thereby making it difficult to use it repeatedly (long-term use) Relatively easy to culture Biology well understood Relatively short lived (transient) expression

9 Adenovirus structure Adenovirus entry FIGURE 17.2 Biotechnology: Applying the genetic revolution. Clark & Pazdernik, Academic Press FIGURE 17.3 Biotechnology: Applying the genetic revolution. Clark & Pazdernik, Academic Press Retrovirala vektorer Retroviral packaging cell line Storlek på insert 8-10 kb Slumpmässig kromosomal integration (kan orsaka ex cancer) Endast integrering i prolifererande celler Expression under kort eller lång tid Olika värdceller Svårt att producera i stor skala Immunogena gag = capsid protein env = envelope protein pol = reverse transcriptase/integrase Ψ = packaging signal FIGURE 17.7 Biotechnology: Applying the genetic revolution. Clark & Pazdernik, Academic Press Retroviral packaging cell line Adeno-associated viral vectors (AAV) Integration at a specific chromosomal location, AAVS1 on Chr. 19 Stable expression Infects humans and some other primate species Can infect both dividing and non-dividing cells Causes a very mild immune response The unusually small particle size ensures efficient tissue penetration Can only harbor relatively small inserts due to the small virus genome size (4.7 kb).

10 Prodrug activation therapy: HSV thymidinkinas- Ganciclovir HSVtk P Endogenous enzyme P P P Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber's congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial Background: Gene therapy has the potential to reverse disease or prevent further deterioration of vision in patients with incurable inherited retinal degeneration. We therefore did a phase 1 trial to assess the effect of gene therapy on retinal and visual function in children and adults with Leber's congenital amaurosis. Methods: We assessed the retinal and visual function in 12 patients (aged 8-44 years) with RPE65-associated Leber's congenital amaurosis given one subretinal injection of adeno-associated virus (AAV) containing a gene encoding a protein needed for the isomerohydrolase activity of the retinal pigment epithelium (AAV2-hRPE65v2) in the worst eye at low (1.5x10 10 ) vector genomes), medium (4.8x10 10 vector genomes), or high dose (1.5x10 11 ) vector genomes) for up to 2 years. Findings: AAV2-hRPE65v2 was well tolerated and all patients showed sustained improvement in subjective and objective measurements of vision (ie, dark adaptometry, pupillometry, electroretinography, nystagmus, and ambulatory behaviour). Patients had at least a 2 log unit increase in pupillary light responses, and an 8-year-old child had nearly the same level of light sensitivity as that in age-matched normal-sighted individuals. The greatest improvement was noted in children, all of whom gained ambulatory vision. The Lancet, Volume 374, Issue 9701, Pages , 7 November 2009