Simplexa Flu A/B & RSV Direct

Transkript

1 Simplexa Flu A/B & Direct REF MOL2650 Rev. F En realtids-pcr assay avsedd för in vitro kvalitativ detektion och differentiering av viralt RNA från influensa A, influensa B &. För in vitro-diagnostisk användning CLIA Måttlig komplexitet Receptbelagt AVSEDD ANVÄNDNING Simplexa Flu A/B & Direct assay från Focus Diagnostics är avsedd att användas på ett instrument av typen 3M Integrated Cycler för in vitro kvalitativ detektion och differentiering av RNA från influensa A-virus, influensa B-virus och respiratoriskt syncytialvirus () i pinnprover från nasofarynx (NPS) (nasofarynxprover) från humanpatienter med tecken och symtom på luftvägsinfektion i kombination med kliniska och epidemiologiska riskfaktorer. Testet är avsett att användas som ett hjälpmedel vid differentialdiagnostik av virusinfektioner med influensa A, influensa B och hos människor, och är inte avsett att detektera influensa C. Negativa utesluter inte influensa virus eller -infektion och ska inte ensamt stå till grund för beslut om behandling eller annan patientvård. Prestandaegenskaper för influensa A fastställdes med kliniska prover som samlades in under influensasäsongen 2010/2011 när H1N1-influensan och H3N2 från 2009 var de influensa A-virus som framförallt cirkulerade. När andra influensa A-virus träder fram kan prestandaegenskaperna variera. Om infektion med ett nytt influensa A-virus misstänks, baserat på gällande kliniska och epidemiologiska screeningskriterier som rekommenderas av Folkhälsomyndigheten, bör prover samlas in för att vidta lämpliga infektionskontrollåtgärder mot nya virulenta influensavirus. Proverna skickas till statliga eller lokala hälsovårdsinstitutioner för testning. Försök till virusodling ska inte göras i dessa fall, såvida inte en anläggning med biologisk skyddsnivå BSL 3+ kan ta emot och odla proverna. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING Influensa orsakas av tre immunologiska typer (A, B och C) av RNA-virus som tillhör familjen Orthomyxoviridae. Influensa A klassificeras sedan vidare baserat på de två virala proteiner som uttrycks på dess yta; hemagglutinin och neuraminidas. Hemagglutinin gör att viruset lättare kan binda till respiratoriska epitelceller medan neuraminidas har som funktion att bryta dessa bindningar till värdcellen så att nya virion kan släppas ut. Säsongsinfluensa orsakas vanligtvis av virus som innehåller en av de tre huvudsakliga subtyperna av hemagglutinin (H1, H2 eller H3) och en av de två subtyperna av neuraminidas (N1 eller N2). Influensa B klassificeras inte i subtyper. 1 Den klassiska sjukdomsbilden för influensa är en kombination av tecken och symtom i övre och nedre luftvägarna, feber, huvudvärk, muskelvärk och allmän sjukdomskänsla. Sjukdomen kan ta sig olika uttryck med alltifrån isolerade respiratoriska symtom som liknar förkylning till svår lunginflammation som kräver inläggning på sjukhus. Personer som har större risk för att behöva läggas in på sjukhus vid säsongsinfluensa inkluderar barn <2 års ålder, vuxna >65 års ålder samt personer med betydande samsjukligheter. Influensa kan förvärra underliggande sjukdomstillstånd, såsom astma eller hjärtsvikt. Sjukdomens varaktighet är vanligtvis 2-5 dagar men symtomen kan kvarstå en vecka eller längre. -infektion är mer prevalent hos spädbarn och småbarn och är den vanligaste orsaken till sjukhusvistelse i denna åldersgrupp. kan dock även orsaka sjukdom hos vuxna och bli svår i vissa populationer. 2 Hos spädbarn och unga barn kan -sjukdom orsaka alltifrån förkylningsliknande sjukdom, bronkit eller krupp, till infektioner i nedre luftvägarna såsom bronkiolit och lunginflammation. Hos vuxna brukar en symtomatisk infektion orsaka sjukdom i övre luftvägarna med rinnande näsa (rhinorré), halsont (faryngit) och hosta, där vissa patienter även får besvär såsom huvudvärk, trötthet och feber. Vuxna med hög risk, såsom de som har vissa kroniska sjukdomar eller är immunsupprimerade, kan få en svårare sjukdom, såsom lunginflammation. 3 PRINCIPER FÖR FÖRFARANDET Assaysystemet Simplexa Flu A/B & Direct är ett realtids-rt-pcr-system som möjliggör direkt amplifiering, detektion och differentiering av RNA från humant influensa A-virus (Flu A), influensa B-virus (Flu B) och från obehandlade pinnprover från nasofarynx, vilka inte har genomgått nukleinsyraextraktion. Systemet består av Simplexa Flu A/B & Direct assay, 3M Integrated Cycler (med programvaran Integrated Cycler Studio), Direct Amplification Disc och erforderliga tillbehör. I Simplexa Flu A/B & Direct assay används bifunktionella fluorescerande probe-primrar tillsammans med motsvarande omvända primrar för att amplifiera RNA från influensa A, influensa B, och den interna kontrollen. Assayen ger tre ; konserverade regioner från influensa A-virus (matrisgenen), influensa B-virus (matrisgenen) och (M-genen) fungerar som målsekvenser för att identifiera dessa virus i provet. En intern RNA-kontroll används för att påvisa felfunktion hos och/eller hämning av RT-PCR-reaktionen.

2 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 2 MEDFÖLJANDE MATERIAL Simplexa Flu A/B & Direct kit från Focus Diagnostics innehåller reagens som räcker till 24 reaktioner. Förvara vid -10 till - 30 ºC (använd ej en frostfri frys) så fort det levererats. Varje provrör innehåller tillräckligt med material för ett användningstillfälle. Använd inom 30 minuter efter det tagits ut från frysen. Beskrivning av kittet Komponentens namn REF EG-SYMBOL PÅ MÄRKNINGEN Namnförkor tning Lockets färg Antal provrör Reaktioner per provrör/kit Simplexa Flu A/B & Direct Reaction Mix MOL2651 REAG A RM Brun 24 1/24 50 µl Kit-komponent Beskrivning av komponenter Innehåll DNA-polymeras, omvänt transkriptas, RNas-hämmare, buffert och dntp:er, inkapslat RNA-templat, färgämnesmärkta fluorescerande primrar specifika för detektion av influensa A, influensa B och och den interna kontrollen. Probe Mål Fluorofor (Färgämne) Excitering Emission Målgen Volym per provrör Simplexa Flu A/B & Direct Reaction Mix (RM) (reaktionsmix) Flu A FAM matrix Flu B JOE matrix CFR Gen M Intern kontroll RNA IC Q N/A Streckkodskort för Simplexa Flu A/B & Direct Assayspecifika parametrar, batchnummer, utgångsdatum MATERIAL SOM TILLHANDAHÅLLS SEPARAT 1. Direct Amplification Disc Kit (REF MOL1455) a) Direct Amplification Discs för användning med Integrated Cycler MATERIAL SOM KRÄVS MEN EJ TILLHANDAHÅLLS 1. 3M Integrated Cycler med Integrated Cycler Studio Software version 4.2 eller senare 2. Simplexa Flu A/B & Positive Control Pack (REF MOL2660) 3. Pipett med fast volym på 50 µl (VWR Signature Fixed Volume Ergonomic High-Performance Pipettor, modell VWR FE50 eller motsvarande) 4. Sterila, nukleasfria engångsspetsar med filter (extra långa spetsar 91 mm rekommenderas för att pipettera direkt från de primära uppsamlingsrören för NPS). 5. En frys (manuell avfrostning) vid -10 till -30 C (för kittets komponenter samt förvaring av frysta prover) 6. Ett kylskåp på 2 till 8 C (för prover) 7. Puderfria engångshandskar REKOMMENDERADE MATERIAL 1. Universal Transport Media (UTM) för användning som No Template Control (NTC, kontroll utan templat). 2. Replacement Foil Wedges (REF MOL1550) HANTERING OCH FÖRVARING AV REAGENS 1. Förvara reagenserna vid -10 till -30 ºC (använd ej en frostfri frys). 2. Låt reagenserna tina vid rumstemperatur (ungefär mellan 18 och 25 C) före användning. 3. Använd inte kit eller reagenser efter deras utgångsdatum. 4. Påbörja test inom 30 minuter efter att reaktionsmixen har tagits ut ur frysen. 5. Vortexa inte reaktionsmixen. 6. Återfrys inte reaktionsmixen.

3 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 3 VARNINGAR OCG FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER 1. Använd personlig skyddsutrustning, såsom (men inte begränsat till) handskar och labbrock, vid hanteringen av kitreagensen. Tvätta händerna noggrant efter att testet har slutförts. 2. Varken rökning, förtäring av mat eller dryck, hantering av kontaktlinser eller sminkning är tillåten i områden där kitreagens och/eller humana prover används. 3. Kassera oanvända kitreagens och humana prover enligt lokala, kommunala och statliga förordningar. 4. Behandla alla prover och diskar som om de vore kapabla att överföra infektionsämnen. Kontaminering av patientprover eller reagens kan ge upphov till felaktiga. Tillämpa god laboratoriesed och kontrollerade arbetsflöden. 7,8 5. Använd endast det protokoll som beskrivs i denna bipacksedel. Avvikelser från protokollet eller användning av tider eller temperaturer andra än de som specifikt angetts kan ge upphov till felaktiga. 6. Assayförberedelserna ska utföras vid rumstemperatur (ungefär mellan 18 och 25 C). 7. Använd pipetter med fast volym eller motsvarande för att överföra prover och reaktionsmix. 8. Undvik att vidröra undersidan av det folie som kommer att vara i kontakt med brunnarna och diskytan. 9. Se till att prov och reagens tillsätts till rätt brunnar för att förhindra potentiellt felaktiga. 10. Avsluta laddandet och sätt på det självhäftande folieskyddet på en sektor innan foliet öppnas på intilliggande sektor. 11. Starta körningen inom 30 minuter efter att reaktionsmixen har tagits ut ur frysen. 12. Försök inte att återanvända sektorerna som använts i tidigare körningar eller ta bort det självhäftande folieskyddet från en sektor som har använts. 13. Diskarna kan återanvändas tills alla 8 sektorer har använts. Kassera använda diskar, utan att ta av folieskyddet, i en behållare för biologiskt riskavfall. 14. Efter varje användning ska DAD-diskarna förvaras plant med den numrerade foliesidan uppåt. 15. Reaktionsmixen innehåller > 1 % glycerol, vilket kan orsaka irritation vid inandning eller hudkontakt. Vid inandning eller hudkontakt ska första hjälpen-åtgärder vidtas. 16. Om kittets förpackning eller innehåll förefaller vara trasigt eller skadat ska det inte användas. Kontakta Focus Diagnostics. Kontaktinformationen finns på sista sidan i detta dokument. 17. Spektralmatrisen måste installeras i varje 3M Integrated Cycler och ska inte bytas ut såvida inte en uppdaterad QR-kod för instrumentet har tillhandahållits Focus Diagnostics. Spektralmatrisen är unik för varje 3M Integrated Cycler. Spektralmatrisen levererades tillsammans med 3M Integrated Cycler-instrumentet, på omslaget till hårdvarumanualen till 3M Integrated Cycler. Om det inte går att skanna matrisetiketten, eller om den har kommit bort, kontakta Focus Diagnostics. Kontaktinformationen finns på sista sidan i detta dokument. 18. Om spektralmatrixen inte installeras eller byts ut kan detta leda till falska. BRUKSANVISNING A. PROVINSAMLING OCH HANTERING Acceptabla typer av prover utgörs av pinnprover från nasofarynx (NPS) i ungefär 3 ml Universal Transport Media (UTM). Använd endast provpinnar med syntetisk spets (t.ex. Dacron, nylon eller rayon) och ett skaft av aluminium eller plast. Använd inte provpinnar med kalciumalginat, eftersom de kan innehålla ämnen som hämmar PCR-testerna. Proverna ska transporteras på is och förvaras vid 2 till 8 C. Om det tar lång tid innan proverna bearbetas, kan de frysas i -70 C i enlighet med bruksanvisningen för UTM. B. INSTRUMENTFÖRBEREDELSE INFÖR REALTIDS-PCR 1. Se användarmanualen för Integrated Cycler för information om hur Integrated Cycler Studio Software ska konfigureras för att lägga till en definition av en assay samt förbereda och analysera körningar på Integrated Cycler. C. LADDNING AV DIRECT AMPLIFICATION DISC OCH AMPLIFIERING MED REALTIDS-PCR OBS: Ingen provextraktion behövs före steget med PCR-amplifiering. 1. Välj ut de prover som behöver testas. 2. Tina provrören vid rumstemperatur (ungefär mellan 18 och 25 C). Tina ett provrör med reaktionsmix för varje prov eller kontroll som ska testas. 3. Scanna streckkoden på provröret för reaktionsmixen från Simplexa Flu A/B & Direct eller dess streckkodskort. 4. Scanna diskens streckkod på Direct Amplification Disc (DAD). 5. Scanna eller skriv in varje providentifierare. 6. Dra tillbaka det självhäftande foliet, från en sektor i taget, för att exponera brunnarna för prov (SAMPLE) och reaktion (R) utan att ta av det självhäftande folieskyddet helt och hållet. (Figur 1 & 2) Undvik att vidröra undersidan av det folie som kommer att vara i kontakt med brunnarna och diskytan. 7. Se till att reaktionsmixen är helt upptinad. Spinn snabbt ner provrören efter behov. (Vortexa inte reaktionsmixen) 8. Använd pipetten för fasta volymer för att överföra 50 µl reaktionsmix till reaktionsbrunnen (R). 9. Använd pipetten för fasta volymer för att överföra 50 µl prov eller kontroll; pipettera prov eller kontroll till provbrunnen (SAMPLE). 10. Täck över sektorn så att du försluter brunnarna med det avdragna självhäftande foliet genom att bestämt trycka neråt nära sektorns kant. Om det ursprungliga foliet har rivits sönder ska det bytas ut mot ett ersättningsfolie kallat Replacement Foil Wedge.

4 Simplexa Flu A/B & Direct Sida Riv av folieskyddets flik längs med perforeringen. 12. Upprepa steg 6 till 11 för efterföljande prov(er). 13. Ladda den förslutna Direct Amplification Disc i Integrated Cycler och starta körningen. Figur 1 Disk med folie, före användning, som lyfts från prov- och reaktionsbrunnar i sektor #3 Figur 2 Brunnar för prov [Sample] and reaktion [R] ANMÄRKNINGAR (i informationssyfte användaren behöver inte tolka/vidta åtgärd): 1. Kit från Focus Diagnostics kan innehålla versionnummer för definitioner av assayerna. Om versionnummer finns kommer det att bifogas definitionerna av assayerna, t.ex. Sample IVD Assay.2. När flera versioner finns kommer mjukvaran automatiskt att använda den assaydefinition som är kopplad till det scannade batchnumret. KVALITETSKONTROLL Simplexa Flu A/B & Positive Control Pack (MOL2660) kan användas som en extern kontroll för kvalitetskontrolltester (QC), utbildning eller färdighetstester. Universal Transport Media rekommenderas som kontroll utan templat (NTC). Intervall för kvalitetskontrollerna har fastställts enligt uppgifterna i tabellen nedan. Om kontrollerna inte ligger inom dessa parametrar ska patienten anses vara ogiltiga och assayen upprepas. Focus rekommenderar att testa kontrollerna en gång per dag. Varje laboratorium bör fastställa sina egna intervall för kvalitetskontroller (QC) och frekvens för QC-testning baserat på gällande lokala lagar, förordningar samt god laboratoriesed. Se bipacksedeln för Simplexa Flu A/B & Positive Control (PI.MOL2660) för instruktioner om hur den positiva kontrollen testas. Förväntade kontroll Kontrolltyp Flu A Flu B Intern RNA-kontroll (RNA IC) Simplexa Flu A/B & 1 Positive Control Detekterat Detekterat Detekterat Ej tillämplig2 Kontroll utan templat (NTC) Ej detekterat Ej detekterat Ej detekterat Giltig 1 Typiska Ct-värden för positiva kontroller ligger på mellan 25 och Detektion av Simplexa RNA Internal Control (RNA IC) krävs inte för att få ett giltigt. RESULTAT När körningen har slutförts kommer mjukvaran automatiskt att tolka och visa en. 1. För varje åtkomst-id (prov-id) som anges kommer mjukvaran att visa ett ( Detected [Detekterat], Not Detected [Ej detekterat] eller Invalid [Ogiltigt] ) för Flu A, Flu B och. a. Resultatet Detected [Detekterat] pekar på förekomst av RNA från Flu A och/eller Flu B och/eller i patientprovet. b. Resultatet Not Detected [Ej detekterat] pekar på avsaknad av RNA från Flu A och/eller Flu B och/eller i patientprovet. c. Resultatet Invalid [Ogiltigt] pekar på oförmåga att säkert fastställa förekomst eller avsaknad av RNA från Flu A och/eller Flu B och/eller i patientprovet. Detta kan bero på 1) att den interna kontrollen (RNA IC) inte fungerar eller 2) att det inte går att detektera tillräckligt med prov. Provet behöver återtestas. Se avsnittet Ogiltiga nedan. d. Resultatet EC500 pekar på ett datakvalitetsfel på gällande viral(a) analyt(er). Mjukvaran har inte kunnat fastställa en giltig amplifiering för analyten/analyterna ifråga. Provet bör återtestas om det har erhållits ett krav på att testa viruset/virusen ifråga. 2. Skriv ut rapporten efter behov. a. Exportera en efter behov.

5 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 5 OGILTIGA RESULTAT Om ett skulle vara Ogiltigt eller om en felkod anges, återtesta provet med ett nytt provrör reaktionsmix från samma kit eller ett nytt kit. Om problemet kvarstår, kontakta avdelningen för teknisk support på Focus Diagnostics. BEGRÄNSNINGAR 1. För in vitro-diagnostisk användning. 2. I USA är denna produkt avsedd att användas på vårdinstitutioner med lägsta nivå av CLIA-certifiering för måttlig komplexitet. 3. Denna assay är inte avsedd att användas som screeningtest för donatorer. 4. Denna assay är endast avsedd för yrkesmässigt bruk. 5. Alla från dessa tester och andra tester måste tolkas tillsammans med anamnes, epidemiologiska data och andra data som är tillgängliga för den kliniker som bedömer patienten. 6. Prevalensen av virala infektioner kan påverka testets prediktionsvärde. 7. Som med andra test kan inte Flu A-, Flu B-, eller -infektioner uteslutas vid negativa och testet ska inte ensamt ska stå till grund för beslut om behandling eller annan patientvård. 8. Falskt negativa kan uppkomma om viruset har genomiska mutationer, insertioner, deletioner eller omarrangemang eller om testet utförts i ett mycket tidigt sjukdomsstadium. 9. För att kunna detektera virala nukleinsyror måste insamling av prover, transport, hantering, förvaring och beredning ske på korrekt sätt. Underlåtelse att under något av dessa steg utföra förfarandena på korrekt vis kan leda till felaktiga. 10. Falskt negativa kan uppkomma om virusen förekommer på en nivå som ligger under assayens analyskänslighet. 11. Som med andra test kan falskt positiva förekomma. Upprepade tester eller tester med en annan produkt kan behövas i vissa sammanhang. 12. Virala nukleinsyror kan finnas kvar in vivo oberoende av virusets viabilitet. Detektion av målanalyten/målanalyterna innebär inte att motsvarande virus är infektiöst eller är orsaksfaktor till kliniska symtom. 13. Detta test är ett kvalitativt test och ger inget kvantitativt värde för de organismer som detekterats. 14. Testet kan inte utesluta infektioner orsakade av andra virala eller bakteriella patogener. 15. Informationen som finns på kittets streckkod kan endast överföras till Integrated Cycler Studio med hjälp av en streckkodsläsare. Om läsaren inte fungerar eller om du av någon anledning inte kan överföra informationen, kontakta teknisk support på Focus Diagnostics. 16. Testets prestanda har inte fastställts för screening av förekomst av influensa A, influensa B eller i blod eller blodprodukter. 17. Testets prestanda har endast utvärderats för användning av humant provmaterial. 18. Testets prestanda har inte fastställts för immunkomprometterade individer. 19. Testets prestanda har inte fastställts för patienter utan symtom på virusinfektion i luftvägarna. 20. Testets prestanda har inte fastställts för behandlingsövervakning av influensa A-, influensa B- eller -infektion. 21. Testets prestanda har inte fastställts för individer som fått ett inhalerbart influensavaccin. 22. Testets prestanda har inte fastställts för prover andra än pinnprover från nasofarynx. 23. Testets prestanda har inte fastställts för individer som använder sugtabletter mot halsont eller produkter innehållande mentol. 24. När mycket höga nivåer av influensa A förekommer med mycket låga nivåer av eller influensa B, kan eventuellt signalen från - eller influensa B-reaktionen vara för svag för att detekteras pga. kompetitiv interferens.

6 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 6 PRESTANDAEGENSKAPER KLINISK ÖVERENSSTÄMMELSE PROSPEKTIV STUDIE Tre externa ställen och ett internt ställe deltog i en prospektiv, klinisk studie. Referens för influensa A- och influensa B- virus samt respiratoriskt syncytialvirus genererades med hjälp av odlingar. Odlingsen överfördes till de som erhölls i samband med provinsamlingen. Totalt 722 pinnprover från nasofarynx erhölls från prospektivt insamlade prover från patienter med tecken och symtom på virusinfektion i luftvägarna. Prospektiva prover samlades in i östra USA mellan 10 november 2010 och 11 mars 2011, mellersta västra USA mellan 8 januari 2011 och 2 februari 2011 samt i Australien mellan 17 augusti 2010 och 20 oktober Av de 722 proverna hade 325 prover samlats in från kvinnliga patienter medan 397 prover hade samlats in från manliga patienter. Totalt 327 prover kom från patienter <5 års ålder, 223 prover kom från patienter mellan 5-22 års ålder, 158 prover kom från patienter mellan 22 och 60 års ålder och 14 prover kom från patienter >60 års ålder. Ett (1) prov uteslöts från den prospektiva analysen på grund av ogiltiga för Flu A, tre (3) prover uteslöts på grund av ett ogiltigt för Flu B och ett (1) prov uteslöts på grund av ett ogiltigt för. Procenttalet för prover med ogiltiga under studien uppgick till 0,4 % (3/722) med ett på 0,1 % till 1,2 %. Klinisk överensstämmelse Flu A (prospektiv kombination av alla ställen) Odlings Resultat från Simplexa - Flu A Känslighet/specificitet n Detekterat Ej detekterat Detekterat Ej detekterat Känslighet: 97,1 %(66/68) : 89,9 till 99,2 % Specificitet: 97,9 %(639/653) : 96,4 till 98,7 % Klinisk överensstämmelse Flu B (prospektiv kombination av alla ställen) Odlings Resultat från Simplexa - Flu B Känslighet/specificitet N Detekterat Ej detekterat Detekterat Ej detekterat Känslighet: 100,0 %(21/21) : 84,5 till 100,0 % Specificitet: 99,9 %(697/698) : 99,2 till 100,0 % Klinisk överensstämmelse (prospektiv Ställe 1) Odlings Resultat från Simplexa Känslighet/specificitet N Detekterat Ej detekterat Detekterat Ej detekterat a 323 Känslighet: 100,0 %(1/1) : 20,7 till 100,0 % Specificitet: 98,2 %(323/329) : 96,1 till 99,2 % a) 4/6 prover bekräftades vara -positiva med en nukleinsyratest (NAT) godkänd av FDA. Klinisk överensstämmelse (prospektiv Ställe 2) Odlings Resultat från Simplexa Känslighet/specificitet N Detekterat Ej detekterat a Känslighet: 98,6 %(72/73) Detekterat : 92,6 till 99,8 % Ej detekterat b 154 Specificitet: 89,5 %(154/172) : 84,1 till 93,3 % a) 1/1 prov bekräftades vara -positivt med en direktfärgning med fluorescerande antikroppar (DFA) godkänd av FDA. b) 11/18 prover bekräftades vara -positiva med en DFA godkänd av FDA.

7 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 7 Klinisk överensstämmelse (prospektiv ställe 3) Odlings Resultat från Simplexa Känslighet/specificitet N Detekterat Ej detekterat Detekterat Ej detekterat a 115 Känslighet: 90,0 %(9/10) : 59,6 till 98,2 % Specificitet: 84,6 %(115/136) : 77,5 till 89,7 % a) 20/21 prov bekräftades vara -positivt med en NAT godkänd av FDA. KLINISK ÖVERENSSTÄMMELSE RETROSPEKTIV STUDIE Tre externa ställen deltog i en retrospektiv, klinisk studie. Referens för influensa A- och influensa B-virus samt respiratoriskt syncytialvirus genererades med hjälp av odlingar. Odlingsen överfördes till de som erhölls då proven samlades in till provbanken. Totalt 223 pinnprover från nasofarynx erhölls från de prover som retrospektivt samlades in till provbanken från patienter med tecken och symtom på virusinfektion i luftvägarna. Klinisk överensstämmelse Flu A (retrospektiv kombination av alla ställen) Odlings Resultat från Simplexa - Flu A PPA/NPA* n Detekterat Ej detekterat Detekterat Ej detekterat PPA: 96,2 % (76/79) : 89,4 till 98,7 % NPA: 99,3% (143/144) : 96,2 till 99,9 % * PPA = Positive Percent Agreement (positiv procentuell överensstämmelse), NPA = Negative Percent Agreement (negativ procentuell överensstämmelse) Odlings Klinisk överensstämmelse Flu B (retrospektiv kombination av alla ställen) Resultat från Simplexa - Flu B N Detekterat Ej detekterat PPA/NPA* Detekterat Ej detekterat PPA: 97,6 % (40/41) : 87,4 till 99,6 % NPA: 100,0 % (182/182) : 979 till 100,0 % * PPA = Positive Percent Agreement (positiv procentuell överensstämmelse), NPA = Negative Percent Agreement (negativ procentuell överensstämmelse) Klinisk överensstämmelse (retrospektiv kombination av alla ställen) Odlings Resultat från Simplexa PPA/NPA* N Detekterat Ej detekterat Detekterat Ej detekterat PPA: 100,0% (12/12) : 75,7 till 100,0 % NPA: 98,6 %(208/211) : 95,9 till 99,5 % * PPA = Positive Percent Agreement (positiv procentuell överensstämmelse), NPA = Negative Percent Agreement (negativ procentuell överensstämmelse)

8 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 8 REPRODUCIBILITET Tre studieställen utvärderade produktens reproducibilitet mellan olika ställen, mellan olika dagar och inom/mellan olika assayer. Varje laboratorium testade en panel av sju tillblandade provpooler varav en var svag (ungefär 2-4 gånger LoD) och en medelstarkt positiv (ungefär 20 gånger LoD) för varje analyt samt en starkt negativ. Det starkt negativa provet innehöll en liten mängd influensa A, influensa B och och den var tillblandad så att den skulle bli negativ i ungefär 95 % av fallen. Assayerna utfördes i triplikat under fem olika dagar. Varje ställe hade två operatörer som sedan utförde assayer på hela provpanelen samt en positiv kontroll en gång per dag, för totalt två uppsättningar data per dag. Kombinerade från alla ställen presenteras i tabellerna nedan. Prov Flu A Svagt positiv Flu A Medelstarkt positiv Flu B Svagt positiv Flu B Medelstarkt positiv Svagt positiv Medelstarkt positiv Starkt negativ Total överensstämmelse Flu A Ställe 1 Ställe 3 Ställe 4 Total Överensstäm Överensstäm Överensstäm melse med Genomsn. melse med Genomsn. melse med Genomsn. %CV %CV %CV förväntade Ct* förväntade Ct* förväntade Ct* 34,3 0,9 31,9 0,6 34,4 0,9 32,1 0,4 90 % (27/30) 39,7 3,0 (210/210) 98,6 % (207/210) (210/210) överensstäm melse med förväntade 34,6 1,1 (90/90) 95,9 till 32,3 1,5 (90/90) 95,9 till (90/90) 95,9 till (90/90) 95,9 till (90/90) 95,9 till (90/90) 95,9 till 96,7% (87/90) 90,7 till 98,9 % 99,5 % (627/630) Prover som är negativa för en analyt får ett värde på 40,1 för enbart statistiska syften. Prover som är negativa har ett Ct-värde på noll (0). 98,6 till 99,8 % Prov Flu A Svagt positiv Flu A Medelstarkt positiv Flu B Svagt positiv Flu B Medelstarkt positiv Svagt positiv Medelstarkt positiv Starkt negativ Flu B Ställe 1 Ställe 3 Ställe 4 Total Överensstäm Överensstäm Överensstäm melse med Genomsn. melse med Genomsn. melse med Genomsn. %CV %CV %CV förväntade Ct förväntade Ct förväntade Ct 33,4 0,9 31,1 0,5 96,7 % (29/30) 40,0 1,0 96,7 % (29/30) 33,9 3,6 31,7 0,7 93,3 % (28/30) 39,9 2,4 överensstäm melse med förväntade (90/90) 95,9 till (90/90) 95,9 till 33,6 2,3 98,9 % (89/90) 94 till 99,8 % 31,2 0,9 (90/90) 95,9 till (90/90) 95,9 till (90/90) 95,9 till 96,7 % (29/30) 95,6 % (86/90) 89,1 till 98,3 % Total överensstämmelse 99,5 % (209/210) 98,6 % (207/210) 99,5 % (209/210) 99,2 % (625/630) 98,2 till 99,7 % Prover som är negativa för en analyt får ett värde på 40,1 för enbart statistiska syften. Prover som är negativa har ett Ct-värde på noll (0).

9 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 9 Prov Flu A Svagt positiv Flu A Medelstarkt positiv Flu B Svagt positiv Flu B Medelstarkt positiv Svagt positiv Medelstarkt positiv Starkt negativ Total överensstämmelse Ställe 1 Ställe 3 Ställe 4 Total Överensstäm Överensstäm Överensstäm melse med Genomsn. melse med Genomsn. melse med Genomsn. %CV %CV %CV förväntade Ct förväntade Ct förväntade Ct 33,4 1,6 31,6 1,8 33,7 1,2 32,5 2,9 90 % (27/30) 39,9 1,7 (210/210) 98,6 % (207/210) 99,5 % (209/210) överensstäm melse med förväntade (90/90) 95,9 till (90/90) 95,9 till (90/90) 95,9 till (90/90) 95,9 till 33,8 2,4 (90/90) 95,9 till 31,9 3,3 (90/90) 95,9 till 96,7 % (29/30) 40,1 0,4 95,6 % (86/90) 89,1 till 98,3 % 99,4 % (626/630) Prover som är negativa för en analyt får ett värde på 40,1 för enbart statistiska syften. Prover som är negativa har ett Ct-värde på noll (0). 98,4 till 99,8 % Ändringar infördes på Simplexa Flu A/B & Direct, prestandan validerades och likvärdig prestanda upprättades. Nedan följer uppdaterade tabeller för analyskänslighet/detektionsgräns, analysreaktivitet och korsreaktivitet. ANALYSKÄNSLIGHET/DETEKTIONSGRÄNS Tre (3) stammar av influensa A, två (2) stammar av influensa B och två (2) stammar av testades för att fastställa detektionsgränsen (LoD) för den modifierade Simplexa Flu A/B & Direct. Fyra (4) koncentrationer per virus testades i triplikat (3) under screeningsfasen för att fastställa en provisorisk LoD. Den lägsta koncentrationen med alla replikat som detekterats under screeningsfasen testades i trettiotvå (32) replikat för att bekräfta detektionen vid denna koncentration. LoD fastställdes om minst 31/32 ( 95,0 %) replikat detekterades. Följande tabell visar en jämförelse mellan detektionsgränserna för den ursprungliga Simplexa Flu A/B & Direct och den modifierade Simplexa Flu A/B & Direct. Virusstam LoD-koncentration (TCID 50/ml) Ursprunglig Simplexa Flu A/B & Direct Modifierad Simplexa Flu A/B & Direct Influenza A/ Hong Kong/8/68 (H3N2) 10 0,1 Influenza A/PR/8/34 H1N1 0,005 0,05 Influenza A/Swine NY/02/2009 (H1N1) 0,1 1 Influenza B/Great Lakes/1739/ Influenza B/Malaysia/2506/ A2 1 2 B CH93-18 (18) 3 2

10 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 10 ANALYSREAKTIVITET / KORSREAKTIVITET Analysreaktivitet Åtskilliga stammar av influensa A (H1, H2, H3, H5, H7 och H9 subtyper), fågelinfluensa A (subtyperna H1, H3, H4, H5, H6, H7, H10, H11, H12, H13 och H16), svininfluensa A (subtyperna H1 och H3), influensa B (linjerna Victoria och Yamagata) samt (subtyperna A och B) utvärderades. De senast förekommande stammarna samt geografiskt skilda stammar valdes ut. Kvantifierat viralt material tillsattes till en negativ matris i en enda spädning vid nedanstående koncentrationer. Varje assay kördes i triplikat. De erhållna Ct-värdena tyder på att alla virusstammar detekterades vid de testade koncentrationerna. Influensa A-virus Subtyp Analysreaktivitet med ytterligare virusstammar Organism Testad koncentration Resultat (H1N1) pdm09 A/California/4/ TCID 50/ml Flu A detekterat (H1N1) pdm09 A/California/7/2009 NYMC x-179-a 100 IU/ml 1 Flu A detekterat (H1N1) pdm09 A/California/12/ TCID 50/ml Flu A detekterat (H1N1) pdm09 A/Massachusetts/15/ CEID 50/ml 2 Flu A detekterat (H1N1) pdm09 A/Mexico/4108/ CEID 50/ml 2 Flu A detekterat (H1N1) pdm09 A/New York/18/ CEID 50/ml 2 Flu A detekterat (H1N1) pdm09 A/Swine NY/02/ TCID 50/ml Flu A detekterat H1N1 A/Brisbane/59/07 H1 100 TCID 50/ml Flu A detekterat H1N1 A/Hawaii/15/ CEID 50/ml 2 Flu A detekterat H1N1 A/New Caledonia/20/99 H1N1 100 TCID 50/ml Flu A detekterat H1N1 A/PR/8/ TCID 50/ml Flu A detekterat H1N1 A/Solomon Island/03/ TCID 50/ml Flu A detekterat H1N1 A/Taiwan/42/ TCID 50/ml Flu A detekterat H1N1 A/WS/ TCID 50/ml Flu A detekterat H2N2 A/Japan/305/57 3,26E-01 ng/µl 3 Flu A detekterat H3N2 A/Brisbane/10/07 H3 100 TCID 50/ml Flu A detekterat H3N2 A/California/02/ TCID 50/ml Flu A detekterat H3N2 A/New York/55/ CEID 50/ml 2 Flu A detekterat H3N2 A/Ohio/02/ CEID 50/ml 2 Flu A detekterat H3N2 A/Port Chalmers/1/ TCID 50/ml Flu A detekterat H3N2 A/Rhode Island/01/ CEID 50/mL 2 Flu A detekterat H3N2 A/Santiago/7981/ CEID 50/ml 2 Flu A detekterat H3N2 A/Switzerland/ / CEID 50/ml 2 Flu A detekterat H3N2 A/Texas/50/ TCID 50/ml Flu A detekterat H3N2 A/Wisconsin/67/05 H3 100 TCID 50/ml Flu A detekterat H3N2v A/Indiana/08/ TCID 50/ml Flu A detekterat H3N2v A/Minnesota/11/ CEID 50/ml 2 Flu A detekterat H5N1 A/Egypt/N03072/2010(H5N1)-PR8-IDCDC-RG29 1: Flu A detekterat H5N1 A/Hubei/1/2010(H5N1)-PR8-IDCDC-RG30 1: Flu A detekterat H5N1 A/India/NIV/2006(H5N1)-PR8-IBCDC-RG7 1: Flu A detekterat

11 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 11 Influensa A-virus (fortsättning) Subtyp Organism Testad koncentration Resultat H7N9 A/Anhui/1/ EID 50/ml 5 Flu A detekterat H9N2 A/Hong Kong/33982/2009(H9N2)-PR8-IDCDC_RG CEID 50/ml 2 Flu A detekterat 1 Infectious Units/ml 2 CEID 50/ml: Chicken Embryo Infectious Dose 3 1xTE användes för spädning. Japan/305/57 (H2N2) är renat RNA, inte virus som resten av panelen. 4 Inaktiverat virus späddes och testades. 5 EID 50/ml: Egg Infectious Dose Fågelinfluensa A-virus Subtyp Organism Testad koncentration Resultat H1N3 A/shorebird/Delaware Bay/211/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H1N8 A/red knot/delaware Bay/240/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H3N6 A/redhead/Alberta/192/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H3N8 A/duck/Chabarovsk/1610/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H4N6 A/duck/Czechoslovakia/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H4N6 A/red knot/delaware/541/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H5N1 A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008(H5N1)-PR8-IDCDC-RG12 1: Flu A detekterat H5N2 A/pheasant/New Jersey/1355/1998(H5N2)-PR8-IBCDC-4 1: Flu A detekterat H6N2 A/turkey/Massachusetts/3740/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H7N2 A/turkey/Virginia/4529/2002 (H7N2)xPR8-IBCDC-5 1: Flu A detekterat H7N7 A/mallard/Netherlands/12/2000(H7N7)/PR8-IBCDC-1 1: Flu A detekterat H10N1 A/mallard/Wisconsin/4230/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H10N7 A/chicken/Germany/N/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H10N7 A/mallard/Illinois/10OS4334/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H10N8 A/quail/Italy/1117/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H11N9 A/American green-winged teal/mississippi/300/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H12N5 A/mallard/Wisconsin/4218/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H12N6 A/duck/Wisconsin/480/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H13N6 A/black-legged kittiwake/quebec/ / CEID 50/ml 1 Flu A detekterat H16N3 A/shorebird/Delaware/172/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat 1 CEID 50/ml: Chicken Embryo Infectious Dose 2 Inaktiverat virus späddes och testades. OBS: Även om detta test har visats kunna detektera odlade virus från den nya fågelinfluensan A (H7N9) och H3N2v har man inte fastställt prestandaegenskaperna hos denna produkt för kliniska prover som är positiva för de nya influensavirusen fågelinfluensa A (H7N9) och H3N2v.

12 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 12 Analysreaktivitet (fortsättning) Svininfluensa A-virus Subtyp Organism Testad koncentration Resultat H1N1 A/Swine/1976/ TCID 50/ml Flu A detekterat H1N1 A/Swine/Iowa/15/ TCID 50/ml Flu A detekterat H1N2 A/swine/Ohio/09SW1477/ TCID 50/ml Flu A detekterat H3N2 A/swine/Ohio/09SW83E/ CEID 50/ml 1 Flu A detekterat 1 CEID 50/ml: Chicken Embryo Infectious Dose Fågelinfluensa B-virus Linje Organism Testad koncentration Resultat Victoria B/Brisbane/33/ CEID 50/ml 1 Flu B detekterat Victoria B/Brisbane/60/ CEID 50/ml 1 Flu B detekterat Victoria B/Florida/02/ TCID 50/ml Flu B detekterat Victoria B/Lee/ TCID 50/ml Flu B detekterat Victoria B/Nevada/03/ CEID 50/ml 1 Flu B detekterat Victoria B/Texas/02/ TCID 50/ml Flu B detekterat Victoria B/Victoria/304/ CEID 50/ml 1 Flu B detekterat Yamagata B/Christchurch/33/ TCID 50/ml Flu B detekterat Yamagata B/Florida/07/ TCID 50/ml Flu B detekterat Yamagata B/Florida/04/ TCID 50/ml Flu B detekterat Yamagata B/Guangdong-Liwan/1133/ CEID 50/ml 1 Flu B detekterat Yamagata B/Maryland/1/ TCID 50/ml Flu B detekterat Yamagata B/Massachusetts/2/ IU/ml 2 Flu B detekterat Yamagata B/Panama/45/ TCID 50/ml Flu B detekterat Yamagata B/Phuket/3073/ CEID 50/ml 1 Flu B detekterat Yamagata B/Utah/9/ CEID 50/ml 1 Flu B detekterat Yamagata B/Wisconsin/01/ CEID 50/ml 1 Flu B detekterat Okänt B/Allen/ TCID 50/ml Flu B detekterat Okänt B/Hong Kong/5/ TCID 50/ml Flu B detekterat Okänt B/Taiwan/2/ TCID 50/ml Flu B detekterat 1 CEID 50/ml: Chicken Embryo Infectious Dose 2 Infectious Units/ml Subtyp Organism Testad koncentration Resultat N/A ATCC PFU/ml detekterat A A 1997/ TCID 50/ml detekterat A A 1998/ TCID 50/ml detekterat A A 1998/ TCID 50/ml detekterat (fortsättning)

13 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 13 Subtyp Organism Testad koncentration Resultat A A 2000/ TCID 50/ml detekterat A A 2001/ TCID 50/ml detekterat A A 2001/ TCID 50/ml detekterat A A Long 100 TCID 50/ml detekterat B B TCID 50/ml detekterat B B/Wash/18537/ TCID 50/ml detekterat B B/WV/14617/ TCID 50/ml detekterat Korsreaktivitet (analysspecificitet) Analysspecificiteten hos assayen Simplexa utvärderades genom att testa förmågan att identifiera uteslutande influensa A-virus och/eller influensa B-virus och/eller utan någon korsreaktivitet med organismer som är närbesläktade eller orsakar liknande kliniska symtom eller förekommer i den normala floran i de provtyper som är av intresse. Trettiotvå (32) potentiella korsreaktanter tillsattes individuellt i en matris av pinnprover vid kliniskt relevanta koncentrationer. Även matrisen utan tillsatta reaktanter testades, så att det kunde fungera som baslinje. Proverna testades i triplikat för att screena för korsreaktivitet. Om signal detekterades i någon av detektionskanalerna (Flu A, Flu B, ) i något av de tre replikaten testades ytterligare 5 replikat för att bekräfta et. Ingen korsreaktivitet detekterades för Flu A, Flu B eller. Simplexa TM Flu A/B & Direct Korsreaktivitet Organism Testad konc. N Flu A (FAM) % Detektion (# Detekterad / # Total) Flu B (JOE) (CFR610) IC (Q670) Baslinje N/A 5 0,0 % (0/5) 0,0 % (0/5) 0,0 % (0/5) 100,0 %(5/5) Adenovirus 1 4,17E+05 TCID 50/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Adenovirus 7A 5,37E+05 TCID 50/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Bordetella pertussis A E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Chlamydia pneumoniae 1,00E+06 IFU/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Cytomegalovirus (CMV) 1,04E+05 U/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Coronavirus 229E 5,89E+05 TCID 50/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Coronavirus OC43 1,95E+05 TCID 50/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Corynebacterium diphtheriae 4,00E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Enterovirus Typ 71 1,10E+05 TCID 50/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Epstein-Barr-virus (EBV) 1,10E+05 kopior/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Escherichia coli O157:H7 1,10E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Haemophilus influenzae 1,41E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Lactobacillus plantarum, ,97E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Legionella longbeachae 8,63E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Mässling 1,95E+05 TCID 50/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Metapneumovirus 9 1,58E+05 TCID 50/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Moraxella catarrhalis, NE1 1,49E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Påssjuka 8,51E+05 TCID 50/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Mycobacterium tuberculosis (genomiskt DNA) 6,54E+06 c/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3)

14 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 14 Organism Testad konc. N Flu A (FAM) % Detektion (# Detekterad / # Total) Flu B (JOE) (CFR610) IC (Q670) Mycoplasma pneumoniae, M129 3,16E+06 ccu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Neisseria elongata 2,05E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Neisseria meningitides 7,07E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Parainfluensa 1 1,15E+05 TCID 50/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Parainfluensa 2 3,80E+05 IU/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Parainfluensa 3 1,95E+05 TCID 50/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Pseudomonas aeruginosa 3,93E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Rhinovirus 1A 1,26E+05 TCID 50/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Staphylococcus aureus, KOL 1,42E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Staphylococcus epidermidis 9,23E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Streptococcus pneumoniae 9,20E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Streptococcus pyogenes, M1 1,36E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) Streptococcus salivarius 2,12E+06 cfu/ml 3 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 0,0 %(0/3) 100,0 %(3/3) INTERFERENS Prestandan för Simplexa HSV 1 & 2 Direct assay utvärderades med potentiellt interfererande ämnen som kan förekomma i nasofaryngeala passager. Potentiellt interfererande ämnen utvärderades i ett tillblandat prov som innehöll influensa A (influenza A/PR/8/34 H1N1) i en koncentration på 0,01 TCID 50/ml och influensa B (influenza B/Malaysia/2506/2004) i en koncentration på 40 TCID 50/ml och A2 i en koncentration på 4 TCID 50/ml. Alla stammar testades vid två til fyra gånger LoD. Det fanns inga bevis på interferens orsakad av ämnena vid de testade koncentrationerna. Potentiella interferenter Aktiv beståndsdel Interferent Koncentration Afrin nässpray Oximetazolin 15 % (v/v) Antibakteriellt, systemiskt Tobramycin 4 µg/ml Antibiotika, nässalva Mupirocin 6,6 mg/ml Blod N/A 2 %(v/v) Renat mucinprotein Bovin submaxillär körtel, typ I-S 60 µg/ml Nasal kortikosteroid - Beconase AQ Beklometason 5 % (v/v) Nasal kortikosteroid - flutikason Flutikason 5 % (v/v) Relenza, antiviralt läkemedel Zanamivir 3,3 mg/ml Tamiflu, antiviralt läkemedel Oseltamivir 1 µm Zicam, näsgel Luffa Opperculata, Galphimia glauca, histaminhydroklorid 5 % (v/v)

15 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 15 KOMPETITIV INTERFERENS Kompetitiv interferens studerades för att utvärdera effekterna av kliniskt relevanta saminfektioner med varje analyt som undersöktes med assayen. Med studien utvärderades om en hög koncentration av ett virus i provet potentiellt kunde påverka prestandan hos Simplexa assayen vad gäller andra mål som förekommer i låga nivåer i multiplex-assayen. Man blandade till ett lågt prov, Baslinjestam, på ungefär två till fyra gånger LoD för varje mål (influensa A, influensa B and ) och en baslinje för Ct fastställdes för varje prov. Varje potentiellt, samtidigt infekterande virus tillsattes till provet som hade låg nivå enligt tabellen nedan. I närvaro av två virus förekom ingen interferens mellan de höga nivåerna av eller influensa B med detektionen av influensa A. Höga nivåer av influensa A kan interferera med detektion av mycket låga koncentrationer av influensa B eller. Kompetitiv interferens - Simplexa Flu A/B & Direct Baslinjestam Influenza A/PR/8/34 H1N1 Baslinjekonce ntration [TCID 50/ml] 0,01 Kompetitiv interfererande stam Influenza B/GL/1739/54 Kompetitiv interfererande koncentration [TCID 50/ml] Resultat (# detekterade/# totalt) Flu A Flu B ,3 3/3 3/3 0/3 0,01 A /8 0/8 8/8 0,01 B Ch93-18(18) /8 0/8 8/8 Influenza B/GL/1739/54 8 Influenza A/PR/8/34 H1N1 0,174 3/3 3/3 0/3 8 A2 80,6 0/3 3/3 3/3 8 B Ch93-18(18) 1 065,9 0/3 3/3 3/3 A2 B Ch93-18(18) Influenza A/PR/8/34 H1N1 Influenza B/GL/1739/54 Influenza A/PR/8/34 H1N1 Influenza B/GL/1739/54 0,174 3/3 0/3 3/ ,3 0/3 3/3 3/3 0,174 3/3 0/3 3/ ,3 0/8 8/8 7/8 HÄMNING AV ANDRA MIKROORGANISMER Simplexa assayen utvärderades genom att testa förmågan att identifiera influensa A-virus, influensa B-virus och när potentiellt hämmande organismer är närvarande. En panel av trettiotvå (32) potentiellt hämmande organismer tillsattes individuellt i en pool med låg koncentration (ungefär två gånger LoD) av influensa A (Influenza A/PR/8/34 H1N1), influensa B (Influenza B/Malaysia/2506/2004) och (A2). Proverna testades i triplikat för att screena för hämning. Om signal inte detekterades i någon av detektionskanalerna (Flu A, Flu B, ) i något av de tre replikaten testades ytterligare fem replikat för att bekräfta et. För influensa A, influensa B och kunde inga hämningseffekter bekräftas för de testade koncentrationerna. Hämning av andra organismer - Simplexa Flu A/B & Direct Mikroorganism Mikroorganismens koncentration Koncentrationsenheter Flu A Flu B Adenovirus 1 1,1 x10 5 TCID 50/ml Adenovirus 7A 1,1 x10 5 TCID 50/ml Bordetella pertussis 1,1 x10 6 cfu/ml Chlamydia pneumoniae 1,1 x10 6 kopior/ml Cytomegalovirus (CMV) 1,1 x10 5 TCID 50/ml Coronavirus 229E 1,1 x10 5 TCID 50/ml + + +

16 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 16 Mikroorganism Mikroorganismens koncentration Koncentrationsenheter Flu A Flu B Coronavirus OC43 1 1,1 x10 5 TCID 50/ml Corynebacterium diphtheriae 1,1 x10 6 cfu/ml E. coli O157 1,1 x10 6 cfu/ml Epstein-Barr-virus (EBV) 1,1 x10 5 kopior/ml Enterovirus ,1 x10 5 TCID 50/ml Haemophilus influenzae 1,1 x10 6 cfu/ml Lactobacillus plantarum, ,1 x10 6 cfu/ml Legionella longbeachae 1,1 x10 6 cfu/ml Mässlingvirus 1,1 x10 5 TCID 50/ml Metapneumovirus 1,1 x10 5 TCID 50/ml Moraxella catarrhalis Ne11 1,1 x10 6 cfu/ml Påssjukevirus 1,1 x10 5 TCID 50/ml Mycobacterium tuberculosis 1,1 x10 6 cfu/ml Mycoplasma pneumoniae 1,1 x TCID M129 50/ml Neisseria elongata 1,1 x10 6 cfu/ml Neisseria meningitidis 1,1 x10 6 cfu/ml Parainfluensa typ 1 1,1 x10 5 TCID 50/ml Parainfluensa typ 2 1,1 x10 5 TCID 50/ml Parainfluensa typ 3 1,1 x10 5 TCID 50/ml Pseudomonas aeruginosa 1,1 x10 6 cfu/ml Rhinovirus 1A 1,1 x10 5 TCID 50/ml Staphylococcus aureus, KOL 1,1 x10 6 cfu/ml Staphylococcus epidermidis 1,1 x10 6 cfu/ml Streptococcus pneumoniae 1,1 x10 6 cfu/ml Streptococcus pyogenes 1,1 x10 6 cfu/ml Streptococcus salivarius 1,1 x10 6 cfu/ml ) Vid initiala tester verkade det som att det kanske fanns en hämning, men vid upprepade tester hittades inga bevis på hämning. Den använda C. pneumoniae hade en titer på 1,52 x 10 5 IFU/ml och en fortsatt kvantifiering gjordes med en realtids-qpcr-assay. 2) Återförsäljaren kvantifierade EBV med en realtids-qpcr-assay. ÖVERFÖRINGSKONTAMINERING Vid en intern studie av överföring söktes förekomst av kontamination i negativa prover. Studien var utformad så att starkt positiva och negativa prover placerades växelvis på varje disk. Överföringseffekten utvärderades genom att jämföra den observerade negativa förekomsten hos det negativa provet med den förekomst som förväntas under förhållanden för normal reproducibilitet. Ingen effekt i form av överföringskontaminering kunde ses i Flu A-, Flu B- eller -kanalerna. FÖRVÄNTADE VÄRDEN Prevalensen av influensa varierar årsvis med influensasäsongen som infaller under höst- och vintermånaderna i USA. Variablerna som påverkar förekomsten av positiva svar vid tester på andningsvägarna inkluderar: tidpunkt och effektivitet vid provinsamling, hantering och transport av proverna, tid på året, patientens ålder och lokal prevalens av sjukdomen. De prospektiva proverna som användes i vår kliniska studie samlades in i USA och Australien. Prevalensen av alla influensavirus i USA 4 under insamlingsperioden september 2010 till mars 2011 varierade mellan 2,1 och 35,5 %. Under säsongen var, bland de influensapositiva, 72,9 % positiva för influensa A och 27,1 % för influensa B. -epidemier uppkommer varje år och varar vanligen 3 4 månader under höst-, vinter- och/eller vårmånaderna. -säsongens tidsperiod varierar mellan olika regioner 4. Förekomsten av -positiva i USA under den period som inkluderade insamlingsperioden september 2010 till mars 2011 låg på 15,9 % 5. I Australien, under influensasäsongen 2010, var 9 % av proverna positiva för influensa 6 ; förekomsten av -positiva rapporterades inte. Prevalensen (positiva enligt referensmetoden) som observerades under vår prospektiva kliniska studie anges i tabellerna nedan.

17 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 17 Simplexa Flu A/B & Direct - stratifierade enligt insamlingsställen Australien (n=330) Analyt Total (prevalens) < 5 år (n=63) 5-21 år (n=106) år (n=147) > 60 år (n=14) Influensa A 2,7 % (9/330) Influensa B 2,9 % (7/330) Respiratoriskt syncytialvirus 0,7 % (1/330) Ohio (n=245) Analyt Total (prevalens) < 5 år (n=195) 5-21 år (n=48) år (n=2) > 60 år (n=0) Influensa A 11,4 % (28/245) Influensa B 1,2 % (3/245) Respiratoriskt syncytialvirus 29,8 % (73/245) Virginia (n=147) Analyt Total (prevalens) < 5 år (n=69) 5-21 år (n=69) år (n=9) > 60 år (n=0) Influensa A 21 % (31/147) Influensa B 7,5 % (11/147) Respiratoriskt syncytialvirus 7,5 % (11/147)

18 Simplexa Flu A/B & Direct Sida 18 REFERENSER US Department of Health and Human Services PHS/CDC/NIH. Biosafety in microbiology and biomedical laboratories, Washington DC: US Government Printing Office, MM3-A2 Molecular diagnostic methods for infectious disease; approved guideline, 2nd ed. Wayne, PA: Clinical Laboratory Standards Institute, Användningen av proberna Scorpions för human in vitro-diagnostik täcks av en licens till Focus Diagnostics, Inc. från Qiagen Manchester, Storbritannien. Scorpions är ett registrerat varumärke som tillhör Qiagen Manchester, Storbritannien. Färgämnena Black Hole Quencher, CAL Fluor, Quasar är varumärken som tillhör Biosearch Technologies, Inc. ( BTI ). Färgämnesteknologierna Black Hole Quencher, CAL Fluor and Quasar är licensierade i enlighet med ett avtal med BTI och dessa produkter säljs uteslutande för kliniska och diagnostiska syften eller i forsknings- och utvecklingssyften. AUKTORISERAD REPRESENTANT mdi Europa GmbH, Langenhagener Str , Langenhagen-Hannover, Tyskland BESTÄLLNINGSINFORMATION Telefon: Fax: TEKNISK HJÄLP (800) (endast USA) (714) (562) (internationellt) PI.MOL2650 Rev. F Skrivelsedatum: 15 september 2015 Telefon: Fax: (800) (endast USA) (562) (562) (internationellt) Besök vår webbplats på Cypress, California 90630, USA