QUANTA Lite CCP 3.1 IgG/IgA ELISA 704550 För in vitro diagnostiskt bruk CLIA-komplexitet: Hög

QUANTA Lite CCP 3.1 IgG/IgA ELISA 704550 För in vitro diagnostiskt bruk CLIA-komplexitet: Hög Användningsområde QUANTA Lite TM CCP3.1 IgG/IgA ELISA är en enzymlänkad immunosorbent analys (ELISA) för semikvantitativ detektering av IgG och IgA anti-ccp3 (cyklisk citrullinerad peptid 3) antikroppar i patientserum eller citrerat eller EDTA-plasma. Förekomsten av dessa antikroppar då de betraktas i samband med andra laboratorie- och kliniska rön utgör en hjälp vid diagnos av reumatoid artrit (RA), inbegripet RA som har diagnostiserats inom 2 år efter att symptomen uppträtt. Sammanfattning och förklaring av testet Reumatoid artrit (RA) är en av de vanligaste systemiska autoimmuna sjukdomarna som drabbar ca 0,5 % av världens befolkning. 1 Diagnosen beror i första hand på kliniska manifestationer av sjukdomen. Tills alldeles nyligen var bestämningen av förekomsten av den reumatoida faktorn (RF), som påträffats i ungefär 50-90 % av dessa patienter, den enda rutinmässigt använda serologiska analysen. 1,2 RF har även påträffats i människor med infektioner och andra autoimmuna sjukdomar, och i några friska individer. 1,2 För behandlingen av sjukdomen är det viktigt att patienter med RA diagnostiseras och får behandling i ett så tidigt skede som möjligt. 3 Det har under flera år varit känt att antiperinukleära autoantikroppar, som också kallas antikeratinautoantikropar, påträffas i människor med RA. Nyligen har man upptäckt att dessa antikroppar känner igen en epitop som innehåller den deimiderade formen av arinin som kallas citrullin. 4,5 En cirkulär peptid som innehåller citrullin, benämnd CCP (cyklisk citrullinerad peptid), konstaterades kunna bättre skilja RA-patienter från andra patienter än både det perinukleära antikropptestet och testerna för reumatoid faktor. 6,7 I en översikt av den publicerade litteraturen 8 är 68 % av patienterna med RA positiva för anti-ccp, medan i medeltal 5 % av försökspersonerna som inte ha RAS är positiva. En ELISA som gjorts med den ursprungligen beskrivna CCP-sekvensen 5 marknadsfördes främst inte på grund av låg sensitivitet. Den andra generationens anti-ccp test (av en del företag kallad CCP2) finns allmänt att tillgå och uppvisar en överlägsen prestation i jämförelse med den ursprungliga peptiden. 9 INOVA Diagnostics kallar sitt andra generationens test för CCP IgG ELISA. Det är betydelsefullt att anti- CCP påträffats i patienter med tidig RA 8, vilket ibland förutspår den framtida utvecklingen av RA bättre än RF. 4,7 Antikroppar från några RA patienter som är negativa för anti-ccp2 reagerar för andra citrullinerade proteiner, 6,7 vilket kan antyda att det finns ytterligare epitoper som inte förekommer i den andra generationens CCP-antigensekvens. Satser som använder en tredje generationens antigen (CCP3) blev tillgängliga år 2005. Dessa tredje generationens peptidsatser visade sig vara ungefär 5 % känsligare jämfört med de satser som använder CCP2-antigener och är lika specifika. 10 Antigenen som används i QUANTA Lite CCP 3.1-satsen innehåller den nyare tredje generationens CCP3-peptid. Denna sats använder även ett konjugat som förutom de vanliga IgG-antikropparna upptäcker IgAantikroppar. Känsligheten förhöjs över CCP3-satsen på grund av att visa RA-patienter har IgAantikroppar mot CCP3 då IgG inte förekommer. 11 Ytterligare förbättringar i CCP 3.1 ELISA inbegriper färgkodade brunnar som kan avskiljas och förmågan att använda antingen serum- eller plasmaprover från patienter. Metodens verksamhetsprinciper Antigenen som används i QUANTA Lite CCP 3.1 IgG/IgA ELISA-testet är en syntetisk, cyklisk citrullinerad peptid som befanns äga en hög känslighet och specificitet för att upptäcka antikroppar i patienter med RA. Antigenen är bunden till ytan på en mikrotiterbrunnsplatta. Färdigspädda kontroller och spädda patientprover läggs i skilda brunnar vilket gör att varje CCP IgG- och/eller IgA-antikropp som finns närvarande binds till den immobiliserade antigenen. Obundna prover sköljs bort och ett enzymmärkt antihumant IgG/IgA-konjugat tillförs varje brunn. En andra inkubation gör att det enzymmärkta anti-humana IgG och/eller IgA binds till de patientantikroppar som har bundits till mikrotiterbrunnarna. Efter att allt obundet enzymmärkt anti-humant IgG/IgA sköljts bort mäts den kvarvarande enzymaktiviteten genom att ett kromogent substrat tillför och intensiteten på den färg som utvecklas mäts. Analysen kan bedömas spektrofotometriskt genom att färgintensiteten som utvecklas i patientbrunnarna mäts och jämförs med färgen i kontrollbrunnarna. Reagenser 1. Polystyren mikrotiterbrunn ELISA-platta täckt med renad, syntetisk CCP3-antigen (12-1 x 8 brunnar) med hållare i folieförpackning som innehåller en desickant. 2. ELISA negativ kontroll, 1 flaska med buffert innehållande konserveringsmedel och humant serum utan några humana antikroppar mot CCP, färdigspädd, 1,2 ml 3. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA svagt positiv, 1 flaska med buffert innehållande konserveringsmedel och 4. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA starkt positiv/kalibrator A, 1 flaska med buffert innehållande konserveringsmedel och 5. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA kalibrator B, 1 flaska med buffert innehållande konserveringsmedel och 1

6. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA kalibrator C, 1 flaska med buffert innehållande konserveringsmedel och 7. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA kalibrator D, 1 flaska med buffert innehållande konserveringsmedel och 8. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA kalibrator E, 1 flaska med buffert innehållande konserveringsmedel och 9. HRP provspädningsvätska, 1 flaska ljusröd, innehållande Tris-buffrad saltlösning, Tween 20, proteinstabiliserare och konserveringsmedel, 50 ml 10. Tvättkoncentrat av hög specificitet, 1 flaska med 10x koncentrat rödfärgad innehållande Trisbuffrad saltlösning och Tween 20, 100 ml. Se avsnittet för Metoder för spädningsinstruktioner. 11. HRP CCP 3.1 IgG/IgA konjugat, (get) anti-humant IgG/IgA, 1 flaska ljusgult färgad innehållande buffert, proteinstabiliserare och konserveringsmedel, 10ml 12. TMB Chromogen, 1 flaska innehållande stabiliserare, 10 ml 13. HRP stopplösning, 0,344M svavelsyra, 1 flaska färglös, 10 ml Varningar 1. VARNING: Denna produkt innehåller ett kemiskt ämne (0,02 % kloramfenikol) i provlösningen, kontrollerna och konjugatet som för staten Kalifornien är känt att orsaka cancer. 2. Allt humant källmaterial som används vid framställningen av kontroller för denna produkt har testats och befunnits negativa gällande antikropp mot HIV, HBsAg och HCV med metoder som godkänts av FDA. Ingen testmetod kan emellertid garantera fullständig frånvaro av HIV,HBV, HCV eller annat smittämne. Därför bör CCP 3.1 IgG/IgA ELISA svagt positiv, CCP 3.1 IgG/IgA ELISA starkt positiv/kalibratorer och ELISA negativ kontroll hanteras på samma sätt som potentiellt smittsamt material. 12 3. Natriumazid används som konserveringsmedel. Natriumazid är ett gift och kan vara toxiskt om det förtärs eller absorberas genom hud eller ögon. Natriumazid kan reagera med bly- eller koppar i avloppsrör och bilda potentiellt explosiva metallazider. Om reagens hälls ut i vasker bör dessa spolas med stora mängder vatten för att förebygga anhopning av azid. 4. HRP-konjugatet innehåller ett utspätt giftigt/korroderande kemiskt ämne som kan vara toxiskt om det förtärs i stora mängder. För att förhindra eventuella kemiska brännskador bör kontakt med hud och ögon undvikas. 5. TMB Chromogen innehåller ett irriterande ämne som kan vara skadligt om det inhaleras, förtärs eller absorberas genom huden. För att undvika skada bör inhalering, förtäring eller kontakt med hud och ögon undvikas. 6. HRP-stopplösningen består av en spädd svavelsyrelösning. Undvik exponering för baser, metaller eller andra föreningar som kan reagera med syror. Svavelsyra är ett gift och ett korroderande ämne som kan vara toxiskt om det förtärs. För att förhindra kemiska brännskador bör kontakt med hud och ögon undvikas. 7. Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid arbete med dessa reagenser. 8. Spillda reagenser bör torkas upp omedelbart. Spill ska omhändertas i enlighet med vad federala, statliga och lokala miljöföreskrifter påbjuder. Försiktighetsåtgärder 1. Denna produkt är avsedd att användas för in vitro-diagnostik. 2. Ersättning av komponenter med andra än de som tillhandahålls i detta system kan leda till motsägelsefulla resultat. 3. Ofullständig eller ineffektiv tvättning och otillräckligt avlägsnande av vätska ur ELISA brunn strippar orsakar dålig precision och/eller hög bakgrund. 4. Anpassning av denna analys för användning med automatiska provprocessorer och andra vätskebehandlingsapparater, helt eller delvis, kan ge testresultat som avviker från dem som erhållits då den manuella metoden använts. Varje laboratorium ansvarar för att dess automatiska procedurer ger testresultat inom godkända gränser. 5. Flera olika faktorer inverkar på analysens förlopp. Till dessa hör reagensernas starttemperatur, rumstemperaturen, pipetteknikens noggrannhet och reproducerbarhet, noggrannheten i tvättning och avlägsnade av vätska från ELISA-stripparnas brunnar, fotometern som använts för att mäta resultaten och längden på inkubationstiderna under analysen. Noggrann uppmärksamhet på överensstämmelse krävs för att riktiga och reproducerbara resultat ska uppnås. 6. Det rekommenderas att metodbeskrivningen följs noga. 7. Ofullständig försegling av zip-låspåsen som innehåller mikrotiterbrunnstrippar och desickant leder till antigennedbrytning och försämrad noggrannhet. 8. Oacceptabelt låga absorptionsnivåer kan iakttas efter två eller fler användningar ur en enda flaska med HRP-konjugat under en viss tid. Det är viktigt att följa alla rekommenderade procedurer vid hanteringen av HRP-konjugat för att förhindra att detta sker. 9. Kemisk kontaminering av HRP-konjugatet kan orsakas av felaktig rengöring eller sköljning av utrustning eller instrument. Rester av vanliga laboratoriekemikalier såsom formalin, blekningsmedel, etanol eller detergenter kan med tiden orsaka nedbrytning av HRP-konjugatet. Skölj noga all utrustning efter användning av kemiska rengöringsmedel/desinficeringsmedel. 2

Förvaringsförhållanden 1. Förvara alla satsens reagenser i 2-8 C. Frys inte ner. Reagenserna är stabila fram till utgångsdatum då de förvaras och hanteras som anvisat. 2. Oanvända överdragna mikrotiterbrunnstrippar för antigener bör återförslutas tätt i foliepåsen med desickant och förvaras i 2-8 C. 3. Spädd tvättbuffert är stabil 1 vecka i 2-8 C. Tagning av prover Denna procedur ska utföras antingen med ett serumprov eller ett citrerad plasma- eller EDT-plasmaprov, då dessa prov gav identiska resultat. Litium- och heparinplasma ska inte användas då de kan ge resultat som avviker från serum. Tillsats av azid eller andra konserveringsmedel till testproven kan ha negativ inverkan på resultaten. Mikrobt kontaminerade, värmebehandlade eller prover som synligt innehåller partiklar får inte användas. Starkt hemolyserade eller lipemiska serum eller prover bör undvikas. Efter att serumet tagits bör det separeras från koaglet eller bör plasman förvaras såsom nedan beskrivs. NCCLS Dokument H18-A3 rekommenderar följande förvaringsförhållanden för prover: 1) Förvara inte proverna i rumstemperatur längre än 8 timmar. 2) Om analysen inte avslutas inom 8 timmar ska provet kylas ned till 2-8 C. 3) Om analysen inte avslutas inom 48 timmar eller om provet ska avsändas ska det frysas ned till -20 C eller lägre. Nedfrusna prover måste blandas väl efter upptining och före något test utförs. Metod Material som ingår 1 CCP 3.1 IgG/IgA ELISA mikrotiterbrunnplatta (12-1 x 8 brunnar), med hållare 1 1,2 ml färdigspädd ELISA negativ kontroll 1 1,2 ml färdigspädd CCP 3.1 IgG/IgA ELISA svagt positiv 1 1,2 ml färdigspädd CCP 3.1 IgG/IgA ELISA starkt positiv/kalibrator A 1 1,2 ml färdigspädd CCP 3.1 IgG/IgA ELISA kalibrator B 1 1,2 ml färdigspädd CCP 3.1 IgG/IgA ELISA kalibrator C 1 1,2 ml färdigspädd CCP 3.1 IgG/IgA ELISA kalibrator D 1 1,2 ml färdigspädd CCP 3.1 IgG/IgA ELISA kalibrator E 1 50 ml HRP provspädningsmedel 1 100 ml tvättkoncentrat av hög specificitet, 10x koncentrat 1 10 ml HRP CCP 3.1 IgG/IgA konjugat, (get) anti-humant IgG/IgA 1 10 ml TMB Chromogen 1 10 ml HRP stopplösning, 0,344M svavelsyra Ytterligare material som krävs men som inte medföljer Mikropipetter för 5, 100, 200-300 och 500 µl Mikropipettspetsar för engångsbruk Provrör för spädning av patientprover, 4ml volym Destillerat eller avjoniserat vatten 1 l behållare för utspätt tvättkoncentrat av hög specificitet Avläsare för mikrotiterbrunnplatta som kan mäta OD vid 450 nm (och 620 nm för tvåvåglängdsavläsningar) Metod Förberedande steg 1. Låt alla reagenser och prover nå rumstemperatur (20-26 o C) och blanda väl. 2. Späd ut tvättkoncentratet av hög specificitet till 1:10 genom att blanda innehållet i flaskan med tvättkoncentrat av hög specificitet i 900 ml destillerat eller avjoniserat vatten. Om inte hela plattan ska köras inom denna tid kan en mindre mängd beredas genom att blanda 10,0 ml av koncentratet i 90 ml destillerat eller avjoniserat vatten för var 16nde brunn som ska användas. Den spädda tvättbufferten är stabil under 1 vecka i 2-8 C. 3. Bered en 1:101 spädning av varje patientprov genom att blanda 5µl prov i 500µl HRPprovspädning. Spädda prov måste användas inom 8 timmar efter beredningen. SPÄD INTE CCP 3.1 IgG/IgA ELISA svagt positiv, CCP 3.1 IgG/IgA ELISA starkt positiv och ELISA negativ kontroll. 4. Då två godtyckligt valda enheter används krävs det två brunnar för var och en av de tre kontrollerna och en eller två brunnar för vart patientprov för bestämning av närvaro eller frånvaro av anti-ccp3.1 antikroppar. Det rekommenderas att proven körs i två exemplar. 5. Om så önskas kan resultaten kvantiteras genom att en 5-punkts standardkurva används. Använd de FÄRDIGSPÄDDA CCP 3.1 kalibratorerna A till E direkt från flaskan för punkterna A till E på 5- punkts standardkurva. Fempunkts standardkurvan har följande värden: Punkt Enheter A Färdigspädd CCP 3.1 IgG/IgA ELISA kalibrator A 250,0 B Färdigspädd CCP 3.1 IgG/IgA ELISA kalibrator B 125,0 C Färdigspädd CCP 3.1 IgG/IgA ELISA kalibrator C 62,5 D Färdigspädd CCP 3.1 IgG/IgA ELISA kalibrator D 31,25 E Färdigspädd CCP 3.1 IgG/IgA ELISA kalibrator E 15,62 3

Analysförfarande 1. ALLA REAGENSER MÅSTE UPPNÅ RUMSTEMPERATUR (20-26 C) FÖRE ANALYSEN KAN BÖRJA. Placera det nödvändiga antalet mikrotiterbrunnar/strippar i hållaren. Lägg omedelbart tillbaka oanvända strippar i påsen med desickanter och förslut noga för att minimera exponering för vattenångor. 2. Tillför 100 ml färdigspädd CCP 3.1 IgG/IgA ELISA svagt positiv, CCP 3.1 IgG/IgA ELISA starkt positiv, kalibratorer B till E om önskvärt, ELISA negativ kontroll och de spädda patientproven till brunnarna. Täck över brunnarna och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur på en plan yta. Inkubationstiden börjar då det sista provet har tillförts. 3. Tvättsteg: Sug noga ut innehållet ur varje brunn. Tillför 200-300 µl av den spädda HRPtvättbufferten till alla brunnar och sug sedan. Upprepa denna sekvens ytterligare två gånger för totalt tre tvättar. Vänd plattan uppochner och knacka på den på absorberande material så att all kvarbliven vätska efter sista tvättningen avlägsnas. Det är viktigt att helt tömma varje brunn efter varje tvättsteg. Behåll den samma sekvensen för sugning som användes för tillförseln av prov. 4. Tillför 100μl HRP CCP 3.1 IgG/IgA konjugat till varje brunn. Konjugatet bör avlägsnas från flaskorna under standard aseptiska förhållanden och enligt god laboratorieteknik. Ta endast den mängd konjugat ur flaskan som behövs för analysen. FÖR ATT UNDVIKA POTENTIELL MIKROBISK OCH/ELLER KEMISK KONTAMINATION FÅR OANVÄNT KONJUGAT ALDRIG HÄLLAS TILLBAKA I FLASKAN. Inkubera brunnarna i 30 minuter som i steg 2. 5. Tvättsteg: Upprepa steg 3. 6. Tillför 100 µl TMB Chromogen till varje brunn och inkubera i mörker i 30 minuter vid rumstemperatur. 7. Tillför 100 µl HRP-stopplösning till varje brunn. Bibehåll den samma sekvensen och tiden för tillförseln av HRP stopplösning som användes för TMB Chromogen. Knacka försiktigt på plattan med ett finger för att blanda brunnarna ordentligt. 8. Avläs absorbansen (OD) i varje brunn vid 450nm inom en timme efter att reaktionen har stoppats. Om bikromatiska mätningar önskas kan 620 nm användas som referensvåglängd. Kvalitetskontroll 1. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA svagt positiv, CCP 3.1 IgG/IgA ELISA starkt positiv och ELISA negativ kontroll bör köras med varje sats av prover för att garantera att alla reagenser och procedurer fungerar korrekt. 2. Observera att emedan CCP 3.1 IgG/IgA ELISA svagt positiv, CCP 3.1 IgG/IgA ELISA starkt positiv och ELISA negativ kontroll är färdigspädda kontrollerar de inte de procedurmässiga metoder som är förenade med spädningen av prover. 3. Ytterligare kontroller kan testas i enlighet med riktlinjer eller krav enligt lokala, statliga och/eller federala bestämmelser eller ackrediterande organisationer. Ytterligare lämpliga kontrollsera kan prepareras genom alikvotering av förenade prover av humant serum och förvaring vid < -20 C. 4. För att en analys ska anses vara godkänd måste alla nedan uppräknade kriterier uppfyllas. Om något av dessa kriterier inte uppfylls bör testet anses vara ogiltigt och analysen göras om. a. Absorbansen för den färdigspädda CCP 3.1 IgG/IgA ELISA starkt positiva måste vara större än absorbansen för CCP 3.1 IgG/IgA ELISA svagt positiva, som måste vara större än absorbansen för ELISA negativa kontrollen. b. Den färdigspädda CCP 3.1 IgG/IgA ELISA starkt positiva måste ha en OD större än 1,0 medan den färdigspädda ELISA negativa kontrollens absorbans inte kan vara större än 0,2. c. Absorbansen för CCP 3.1 IgG/IgA ELISA svagt positiv måste vara mer än två gånger den för ELISA negativ kontrollen eller över 0,25. d. ELISA negativ kontroll och CCP 3.1 IgG/IgA ELISA starkt positiv är avsedda att övervaka att inte väsentliga reagensförsämringar förekommer. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA starkt positiv säkrar inte precision vid analys cut-off. e. Användaren hänvisas till CLSI (NCCLS) Document C24-A3 för ytterligare vägledning i riktig kvalitetskontroll praxis. Beräkning av semi-kvantitativa resultat Ratiometoden Först bestäms medelvärdet för OD för varje set av dubbletter. Varje provs reaktivitet kan sedan beräknas genom att dividera provets OD-medelvärde med OD-medelvärdet för CCP 3.1 IgG/IgA ELISA svagt positiv. Resultatet multipliceras med antalet enheter som tilldelats CCP 3.1 IgG/IgA ELISA svagt positiv som finns på etiketten. Provets OD Provvärde = x CCP 3.1 IgG/IgA ELISA svagt positiv (enheter) CCP 3.1 IgG/IgA ELISA svagt positiv OD (enheter) Reaktiviteten står i relation till mängden närvarande antikroppar på ett icke-linjärt sätt. Medan ökningar och minskningar i patientens antikroppskoncentration kommer att reflekteras i en motsvarande ökning och minskning i reaktiviteten är förändringarna inte proportionella (dvs. en fördubbling av antikroppskoncentrationen kommer inte att fördubbla reaktiviteten). 4

En alternativ beräkningsmetod: Semi-kvantitativa resultat med användning av en standardkurva Beräkning av resultat med den alternativa standardkurvan 1. Bestäm medelvärdet för alla dubblettavläsningar. 2. Plotta provens medelabsorbanser (OD) på standardkurvan mot deras värden i enheter. Använd en linjär/linjär Cubic Spline (tredjegradspolynom) eller en punkt till punkt-linje som passar för att rita kurvan. 3. Bestäm den okända anti-ccp 3.1 koncentrationen i enheter från Y -axeln genom att avläsa den motsvarande absorbansen på X -axeln. Beräkna de okända enheterna. 4. Obs: Värdena som beräknats med ratiometoden kommer att vara olika dem som uträknats med standardkurvan. Höga värden kommer att avvika mer än låga värden. CCP 3.1 IgG/IgA ELISA starkt positiv kommer inte att ge ett värde på 250 enheter med ratiometoden. Tolkning av resultaten ELISA-analysen är mycket känslig för teknik och kan detektera även små skillnader i patientpopulationer. De värden som visas här nedan är endast indikativa värden. Varje laboratorium bör bestämma sitt eget normala område som grundar sig på sina egna tekniker, kontroller, utrustning och patientpopulation i enlighet med de egna etablerade procedurerna. Proven kan klassificeras som negativa, svagt positiva, moderat positiva eller starkt positiva enligt tabellen här nedan. Enheter Negativ <20 Svagt positiv 20 39 Moderat positiv 40 59 Starkt positiv 60 1. Ett positivt resultat indikerar en närvaro av IgG och/eller IgA anti-ccp 3 antikroppar och antyder en trolig RA. 2. Ett negativt resultat indikerar inga CCP3 antikroppar eller nivåer under analysens negativa cut-off. 3. Förslagsvis borde resultaten som rapporteras av laboratoriet inkludera meddelandet: Följande resultat uppnåddes med INOVA QUANTA Lite CCP 3.1 IgG/IgA ELISA. Anti-CCP-värden som uppnås med andra tillverkares analysmetoder ska inte användas utbytbart. Storleken av de rapporterade IgG eller IgA-nivåerna kan inte korreleras till en endpoint titer. Metodens begränsningar 1. Närvaron av immunkomplex eller andra immunglobulinaggregat i patientproverna kan ge upphov till en ökad nivå av icke-specifik bindning och ge falska positiva i denna analys 2. Alla RA patienter är inte anti-ccp-positiva. 3. Resultaten från denna analys bör användas tillsammans med kliniska resultat och andra serologiska tester. 4. Prestationskarakteristika för analysen har inte konstaterats för andra matriser än serum, EDTA plasma och citrerad plasma. 5. Det diagnostiska värdet av anti-ccp 3 hos unga reumatoida artritpatienter har inte fastställts. 6. Interfererande ämnen: Höga halter hemoglobin, bilirubin, kolesterol eller triglycerider ger inte falska negativa eller falska positiva resultat. Förväntade värden från kliniska prover QUANTA Lite CCP 3.1 IgG/IgA ELISA:s förmåga att påvisa IgG/IgA CCP3 antikroppar utvärderades genom att 942 prover jämfördes med en ELISA som mäter IgG anti-ccp2. 495 patienter med en klinisk diagnos på RA inkluderades från både interna (186) och externa (309) studier. Sera från 275 slumpmässigt valda blodgivare testades också. Av de 272 där ålder och kön fanns att tillgå, var 97 kvinnor och medelåldern var 42,4 år. Sjukdomskontrollerna inkluderade 74 personer med andra rheumatoid sjukdomar (ORD) såsom systemisk lupus erythematosus (34), Sjögrens Syndrom (16) och sklerodermi (24), liksom även ytterligare 98 prover med antikroppar mot infektionssjukdomar (ID) såsom hepatit C (58), herpes simplex-virus (15), cytomegalovirus (14), toxoplasmos (6) och rubella (5) i en stor intern studie. 5

Klinisk sensitivitet och specificitet Följande tabell summerar forskningsresultaten för alla våra kliniska studier. Prover N=942 CCP3.1 ELISA CCP ELISA + - + - RA (Totalt N=495) 348 147 320 175 RA inom 2 år (N=86) 55 31 47 39 Kontroller totalt (N=447) 10 437 8 439 Blodgivare (N=275) 2 273 3 272 ORD (N=74) 6 68 4 70 Infektionssjukdom (N=98) 2 96 1 97 Klinisk sensitivitet [95 % konfidensintervall (CI)] = CCP3.1 = 70,3 % (66-74 %) CCP = 64,6 % (60-69 %) I RA inom 2 år = CCP3.1 = 64,0 % (52-74 %) CCP = 54,7% (43-65%) Klinisk specificitet (95 % CI) = CCP3.1 = 97,8 % (96-99 %) CCP = 98,2 % (97-99 %) Metodjämförelse N=942 CCP3.1 IgG/IgA ELISA CCP IgG ELISA Totalt %-överensstämmelse (95 % CI) Positiv Negativ Positiv 320 38* 358 Pos. %-överensstämmelse=97,6 % (95,3-98,9 %) Negativ 8** 576 584 Neg. %-överensstämmelse=93,8 % (91,6-95,6%) Totalt 328 614 942 Tot. %-överensstämmelse=95,1 % *33 av dessa prover diagnostiseras som RA. **5 av dessa prover diagnostiseras som RA. Korsreaktivitet För att bedöma potentiell korsreaktivitet för CCP3.1 antigen med andra autoantikroppar, utvärderades QUANTA Lite CCP3.1 ELISA med 16 prover, som alla hade höga nivåer av olika andra autoantikroppar. I denna grupp inkluderades 2 prover var som reagerade med SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Ribo-P och dsdna. Alla prover var negativa för anti-ccp3.1. Studien ovan visar ingen signifikant korsreaktivitet för CCP3.1 antigen med en mångfald andra autoantikroppar. Precision och reproducerbarhet Between-run analysavvikelse mättes genom att köra duplikat av negativa, svagt positiva och starkt positiva prover i 6 separata analyser under 5 olika dagar. Within-run analysavvikelse mättes genom att köra 9 prover 9 eller 10 gånger var på samma ELISA platta. Representativa resultat visas här nedan. Between-run avvikelse Negativ 1 Svag 1 Svag 2 Stark 1 1 pt.* 5 pt.** 1 pt.* 5 pt. 1 pt.* 5 pt. 1 pt. 5 pt. Medeltal 6 U 4 U 22 U 23 U 28 U 30 U 69 U 85 U SD 0,4 0,5 0,7 0,6 0,8 1,2 1,7 1,2 CV % 8 % 11 % 3 % 3 % 3 % 4 % 2 % 1 % Within-run avvikelse Negativ 1 Svag 1 Svag 2 Stark 1 1 pt. 5 pt. 1 pt. 5 pt. 1 pt. 5 pt. 1 pt. 5 pt. Medeltal 4 U 2 U 22 U 24 U 26 U 30 U 68 U 81 U SD 0,2 0,2 0,9 1,1 0,9 1,0 1,9 3,2 CV % 4 % 13 % 4 % 5 % 3 % 3 % 3 % 4 % *Testresultat med ratiometoden **Testresultat med standardkurva QUANTA Lite är INOVA Diagnostics, Inc:s registrerade varumärke. Copyright 2011 alla rättigheter förbehålls 6

Referenser 1. Wener MH: Rheumatoid Factors. Manual of Clinical Laboratory Immunology, NR Rose et al., eds, American Society for Microbiology Press, 961-972 (2002). 2. Borretzen M et al.: Rheumatoid Factors. Autoantibodies, Peter JB and Shoenfeld Y, eds, Elsevier Science B.V., 706-715 (1996). 3. Kim JK and Weisman MH: When does rheumatoid arthritis begin and why do we need to know? Arthritis Rheum 43: 473-484 (2000). 4. Vossenaar ER and Van Venrooj WJ: Anti-CCP antibodies, a highly specific marker for (early) rheumatoid arthritis. Clin Applied Immunol Rev 4: 239-262 (2004). 5. Schellekens GA et al.: Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest. 101: 273-281 (1998). 6. Vittecoq O et al.: Autoantibodies recognizing citrullinated rat filaggrin in an ELISA using citrullinated and non-citrullinated recombinant proteins as antigens are highly diagnostic for rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol 135: 173-180 (2004). 7. Saraux A et al.: Value of antibodies to citrulline-containing peptides for diagnosing early rheumatoid arthritis. J Rheumatol 30: 2550-2539 (2003). 8. Avovac J et al: Diagnostic and predictive value of anti-cycllic citrullinated protien antibodies in rheumatiod arthritis: a systematic literature review. Ann Rheum Dis 65: 845-851 (2006). 9. van Gaalen FA et al.: A comparison of the diagnostic accuracy and prognostic value of the firstand second anti-cyclic citrullinated peptide autoantibody (CCP1 and CCP2) tests for rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 64: 1510-1512 (2005) 10. Mittermayer S et al.: A comparison of the frequency of autoantibodies to cyclic citrullinated peptides using a third generation CCP assay (CCP3) in systemic sclerosis, primary biliary cirrhosis and rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol June 15, e-pub ahead of print (2007). 11. Vieira LEA et al: Rheumatoid arthritis diagnosis: a comparative study of second and third generation anti-cyclic citrullinated peptide (CCP) ELISAs. Arthritis Rheum 56: S724 (2007). 12. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, Fifth Edition, 2007. 7

Tillverkad av: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 Förenta Staterna Teknisk service (Endast USA och Kanada): 877-829-4745 Teknisk service (utanför USA): 00+ 1 858-805-7950 support@inovadx.com Auktoriserad representant inom EU: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Tyskland Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 624550SWE Mars 2011 Revidering 0 8