SVERIGE (12) PATENTSKRIFT (13) C2 (11) 515 285 (19) SE (51) internationell klass A61K 39/108 (45) Patent meddelat 2001-07-09 (41) Ansökan allmänt tillgänglig 2000-06-19 (21) Patentansökningsnummer 9804415-9 PATENT- OCH REGISTRERINGSVERKET (22) Patentansökan inkom 1998-12-18 Ansökan inkommen som: (24) Löpdag 1998-12-18 (62) Stamansökans nummer y svensk patentansökan (86) Internationell ingivningsdag fullföljd (86) Ingivningsdag för ansökan om europeisk patent (83) Deposition av mikroorganism I internationell patentansökan med nummer omvandlad europeisk patentansökan med nummer (30) Prioritetsuppgifter (73)PATENTHAVARE SBL Vaccin AB, 105 21 Stockholm SE (72) UPPFINNARE Nils Carlin, Hässelby SE, Per Askelöf, Sollentuna SE, Ulf Bjare, Uppsala SE (74)OMBUD Stockholms Patentbyrå Zacco AB (54) BENÄMNING Oralt vaccin mot diarre (56)ANFÖRDA PUBLIKATIONER: - - - (57)SAMMANDRAG: En oral vaccinkomposition mot enterotoxigen E. coli förorsakad diarré hos människor beskrivs. Den omfattar en definierad mängd av åtminstone tre olika typer av kolonisationsfaktorantigener (CFAs), t ex 100 till 300 vig av varje typ, valda från den grupp som består av CFA I, CFA II (CS 1, CS2 och CS3) och CFA IV (CS4, CS5 och CS6), på avdödade E. coli bakterie som saknar den gren som kodar för värmelabilt enterotoxin (UTI tillsammans med en definierad mängd av B-subenheten av koleratoxin (CTB), t ex 0,5 2,0 mg, och en vehikel, såsom PBS, vilken vaccinkomposition är renad från eventuellt förekommande värmestabilt enterotoxin (ST). Siffrorna inom parentes anger internationell identifieringskod, INID-kod. Bokstav inom klammer anger internationell dokumentkod.
r- A r- r's h I./ Ps r 1 5 Föreliggande uppfinning hänför sig till ett oralt vaccin mot diarr6 Mera preciserat hänför den sig till en oral vaccinkomposition mot diarré som förorsakats av enterotoxigen E. coli hos människor. Bakgrund Bakterier och virus uttrycker ofta på eller inom sitt membran, proteiner vilka i en viss 10 omgivning fungerar som ett stöd för organismen att associera på ett specifikt sätt eller vidhäfta vid en yta. En sådan yta kan vara mag-tarmkanalens innervägg, matstrupen eller någon annan biologisk yta eller membran i en human eller djurkropp, där en organism kan finna en optimal omgivning för tillväxt. Mikrobiella membranproteiner av denna typ benämns ofta kolonisationsfaktor antigener (CFA) eller. I litteraturen används andra ord såsom 15 pili, hemagglutininer, filamentösa eller fibrillära proteiner för samma typ av substanser. Av bekvämlighetsskäl används här "CFA" för att täcka alla dessa typer av membranproteiner, som också kan ha en antigen karaktär. För de flesta organismer styrs produktionen av deras CFAs av olika faktorer i omgivningen, vilka i sin tur kan aktivera regulatoriska gener i plasmid-dna. 20 Ett antal bakterier som är av medicinskt intresse har visats producera CFAs som är associerade med deras membran. Bland dessa är de organismer som är av störts betydelse för människor de som koloniserar den humana mag-tarmkanalen och andningsluftvägarna. Exempel på organismer som koloniserar mag-tarmkanalen är enterotoxigena Escherichia coli, Vibrio cholerae, Helicobacter pylori, Campylobacter, Shigellae, Salmonellae och Yersinia. 25 Av särskilt medicinskt intresse är enterotoxigen Escherichia coli (ETEC), eftersom den är huvudorsaken till turistdiarréoch diarré bland barn i utvecklingsländerna, och den ansvarar för mer än 1 miljard diarr6.episoder och åtminstone en miljon dödsfall per år, huvudsakligen bland barn. Enterotoxigena E. coli kännetecknas av att de producerar värmelabilt enterotoxin 30 (LT) och/eller värmestabilt enterotoxin (ST). I WO 92/14487 har en metod för framställning och användning av ett oralt ETECvaccin beskrivits. ETEC-bakterierna med CFAs och deras subkomponenter (CS-antigener) odlas under specificerade betingelser. De därefter formalinavdödade bakterierna kan sedan T:\PATENT\29-\29663\svensktxt.doc
. r ZZ 1 11; r X a - J -t 1 %." användas som ett oralt vaccin mot ETEC-bakterier. CFA- och CS-antigenerna fungerar sålunda som antigener vid den immunologiska bearbetningen som sker i tarmarna. Det fanns problem vid uppskalning av produktionen av ETEC-bakterier med CFAs, och P" lösning nå pmblemen beskrevs i den internationella patent2n,hkningen Wo 95,R187 5 Formuleringar av ETEC-vacciner innehållande B-subenheten av koleratoxin, som antigeniskt liknar det värmelabila enterotoxinet hos ETEC, och kolonisationsfaktor antigener hos ETEC, visades stimulera relevanta slemhinneimmunresponser i svenska frivilliga personer. (Jertborn M., et al, Vaccine, 1997; 16:255-260). Av produktionssäkerhets- och effektivitetsskäl måste en vaccinkomposition vara 10 icke-infektiös och innehålla definierade mängder av aktiva ingredienser som är desamma från sats till sats. Beskrivning av uppfinningen Föreliggande uppfinning åstadkommer en ny vaccinkomposition som är baserad på LT-negativa avdödade enterotoxigena E. coli bakterier och som omfattar definierade mängder 15 av åtminstone tre olika typer av kolonisationsfaktor antigener, samt B-subenheten av koleratoxin (CTB) som antigeniskt liknar det värmelabila enterotoxinet hos ETEC. Därtill är vaccinkompositionen renad från eventuellt förekommande värmestabilt enterotoxin (ST). De LT-negativa ETEC-bakterierna är antingen laboratorieutvalda från naturligt genetiskt modifierade stammar eller framställda genom rekombinanta tekniker. 20 Eventuellt förekommande värmestabilt enterotoxin, som är ett jämförelsevis litet protein med 19 aminosyrarester, tvättas bort under vaccinkompositionsframställningen. Elimineringen av möjligheten för bakterierna att producera värmelabilt enterotoxin och avlägsnandet av eventuellt förekommande värmestabilt enterotoxin ökar produktsäkerheten. 25 Avdödningen av bakterierna bör utföras på sådant sätt att kolonisationsfaktorantigenerna huvudsakligen bibehålls, t ex genom mild formalininaktivering. Sålunda åstadkommer föreliggande uppfinning en oral vaccinkomposition mot diarr som förorsakas av enterotoxigen E. coli hos människor, vilken omfattar en definierad mängd av åtminstone tre olika typer av kolonisationsfaktorantigener (CFAs) valda från den grupp 30 som består av CFA I, CFA II (CS 1, CS2 och CS3) och CFA IV (CS4, CS5 och CS6), på avdödade E. coli bakterier som saknar den gen som kodar för värmelabilt (LT") enterotoxin, tillsammans med en definierad mängd av koleratoxinets B-subenhet (CTB), och en vehikel, vilken vaccinkomposition är renad från eventuellt förekommande värmestabilt enterotoxin (ST). TAPATEN1129-\29663\svensktxt.doc
r- r- h r r IN Z 0 1 S of 3 I en utföringsform av det orala vaccinet enligt uppfinningen är den definierade mängden av olika typer av CFAs för varje typ av CFA minst 100 gg, och den definierade mängden av CTB är minst 0,5 mg, och vehikeln är en fysiologiskt acceptabel buffertlösning. T,1,1 -,-1 ^1:1, +. nu A 1",-; 1 en iureuiaen n,,, gu un gbiur mi a ue n uuuieraue e mansue n av...a Lyper av ka...rks lur 5 varje typ av CFA 100 till 300 gg och den definierade mängden av CTB är 0,5 till 2,0 mg. I en mest föredragen utföringsform av uppfinningen är den definierade mängden av olika typer av CFAs 200 µg av CFA/I, 200 in av CS1, 150 gg av CS2, 200 gg av CS4 och 150 gg av CS5, och 1,0 mg av CTB, och den fysiologiskt acceptabla buffertlösningen är fosfatbuffrad saltlösning. 10 En dos av vaccinkompositionen kommer att innehålla ungefär 10 11 bakterier. Vaccinkompositionen administreras åt en person i form av en dryck i ett glas vatten som innehåller karbonatbuffert, såsom natriumvätekarbonat. Experiment Bestämning av mängderna av de olika kolonisationsfaktorantigenerna 15 E. coli fimbrie-antigener detekteras med användning av en inhibitions-elisa väsentligen såsom beskrivits av Lopez-Vidal Y., et al i the Journal of Clinical Microbiology, vol 26, 1967-1972 (1988). Kortfattat kan anges att bakterieprovet som skall analyseras inkuberas tillsammans med en fastställd mängd monoklonal antikropp som är riktad mot CFA. Efter inkubation överförs blandningen till en platta som tidigare belagts med CFA, där 20 kvarvarande monoklonal antikropp kan binda till CFA. Bunden antikropp visualiseras genom tillsättning av pepparrotsperoxidaskonjugerat anti-musimmunoglobulin. Som substrat användes o-fenylendiamindihydroklorid i en citratbuffert. Den optiska densiteten mäts vid 450 nm i en spektrofotometer som är ansluten till en dator vilken är utrustad med en datareduktionsmjukvara. Den observerade optiska densiteten är omvänt proportionell mot 25 koncentrationen av antikropp i provet. Formulering av vaccinkomposition Parti av formulerat oralt ETEC-vaccin härstammade från respektive monovalent bulk av formalinavdödade CFA/I SBL stam 101, CS1 SBL stam 106, CS2 SBL stam 107, CS4 SBL stam 104, samt CS5 SBL stam 105 och monovalent bulk av renat rctb. T:\PATENT\29-\29663\svensktxt.doc
-r-; 1 s i 8 4 Komposition Ingrediensernas namn Enhet Funktion Aktive substans: 1. Monovalent Bulk: E.coli, CFAJI SBL-101, 2. Monovalent Bulk: E.coli, CS1 SBL-1 06, 3. MonovalentBulk:E.coli,CS2 SBL-107, 4. Monovalent Bulk: E.coli, CS4 SBL- 104, 5. Monovalent Bulk: E.coli, CS5 SBL-105, 2,0 x 10 2 gg 2,0 x 10 2 lig 1,5 x 10 2 gg 2,0 x 10 2 gg 1,5 x 10 2 µg För att framkalla immunrespons mot ETEC bakterier 6. Monovalent Bulk: rctb, Renat 1,0 mg Vehikel: q.s. ad 6,0 ml Buffert 7. PBS(WHO) Buffert, ph 7.2-7.4 5 Stammarna SBL-104 och SBL-105 producerade också CS 6, men mängden därav fastställdes inte. Stammen SBL-107 producerade också CS3, men mängden därav fastställdes inte. Pilotstudie som evaluerar effektiviteten och reaktogeniciteten hos oralt ETEC B-subenhetsavdödat helcellsvaccin enligt uppfinningen mot turistdiarré I en dubbel blind, randomiserad, placebokontroll pilotstudie undersöktes tre 10 grupper av österrikiska resenärer. Förutom ETEC-vaccinet inkluderades också ett oralt B- subenhetshelcellskoleravaccin, eftersom det tidigare hade visats i både bangladeshiska (Clemens J., et al, J Infect Dis, 1988, 158:372-377) och i finska resenärer till Marocko (Peltola H., et al Lancet, 1991, 338:1285-89) ge signifikant skydd mot E.coli LT-diarr6 Totalt 250 frivilliga personer, fullvuxna och barn, som hade beställt en resa till 15 tropiska eller subtropiska destinationer (44 olika länder i Afrika, Asien och Latinamerika) med en längd på vistelsen som var avsedd att vara 7 till 23 dagar, inkluderades. Tolv av dessa borttogs på grund av brott mot protokollet, så att avsikt att behandla-populationen omfattade 238 personer och per protokoll-populationen, som perfekt fullföljde alla krav, omfattade 187 resenären. Två på varandra följande doser av vaccin eller placebo gavs, vid ett intervall av TAPATENT\29-\29663\svensktxt.doc
rar I n n n n r G J 7-21 dagar, inte mindre än 7 dagar och inte mer än 30 dagar före avfärd. Eftervaccinationssymptom och negativa händelser rapporterades efter båda doserna. Alla frivilliga personer som rekryterats till studien var utrustade med en daglig anteckningsdagbok för att övervaka episoder av turistdiarré under deras vistelse utomlands och med 5 transportmedia (Portagerm och Cary Blair rör) för uppsamling av avföringsprover i fall av diarre. Resenärerna instruerades att överlämna sina resedagböcker, och transportmediarör omedelbart efter återkomsten. Blodprover för testning av immunogenicitet togs från en undergrupp av 73 frivilliga personer före och efter den första och den andra dosen av vaccinerna eller placebo. Provet efter första dosen uppsamlades omedelbart före intag av den 10 andra dosen, och blodprovet efter andra dosen togs efter återkomsten. Formuleringarna som gavs åt de tre randomiserade grupperna av resenärer var: ETEC-vaccin, som innehöll 1 mg av rekombinant B-subenhet av koleratoxin plus 10 11 formalinavdödade ETEC-bakterier av fem ETEC-stammar som uttryckte de vanligaste kolonisationsfaktorantigenerna (CFA's) såsom CFA I, CFA II (CS 1, CS2 och CS3) och CFA 15 IV (CS4, CS5 och CS6); ett B-subenhets-kolerahelcellsvaccin (registrerat i Sverige sedan 1992), som innehöll 1 mg rekombinant subenhet B koleratoxin och 10" avdödade hela celler (Inaba, Ogawa, classical och El Tor); placebo som innehöll 10 11 avdödade E. coli K12. Formuleringarna suspenderades i 4 ml buffert och varje dos av vaccinet eller placebon gavs i en dryck i 150 cc av en natriumvätekarbonatlösning. Isolering och karakterisering av ETEC- 20 bakterier och anti-ctb IgA ELISA utfördes såsom beskrivits (Jertborn M., et al ibid). 250 frivilliga personer erhöll en dos av vaccin eller placebo, varvid 246 av dem också erhöll den andra dosen. Studieprotokollet godkändes av den lokala Etiska Kommittén innan studien påbörjades. Skrivna informerade medgivanden erhölls från de frivilliga personerna före randomiseringen. 25 Reaktogenicitetsresultaten är som följer: Totalt 43 frivilliga personer (17%) hade milda till måttliga mag-tarmsymptom eller generella symptom efter den första dosen; 13 (16%) i placebo, 13 (16%) i koleravaccingruppen och 17 (20%) i ETEC-vaccingruppen. Efter den andra dosen hade 20 (8%) symptom; 6 (7%) i placebo, 7 (9%) i koleravaccingruppen och 7 (8%) i ETEC-vaccingruppen. Statistiskt var det inte några skillnader mellan studiegrupperna 30 i andelen av frivilliga personer som rapporterade symptom. Vid evaluering av vaccinernas effektivitet definierades ett fall av ETEC-diarr som förekomst av tre eller flera flytande avföringar, och ETEC, men inga andra patogener, detekterade i förbehandlingsavföringar. I per protokoll populationen var förekomsten av ETEC 8% (5 fall) i placebogruppen, 10% (6 fall) i koleravaccingruppen och 2% (1 fall) i TAPATENT\29-\29663\svensktxt.doc
1- A e IN I <V 1 '40 n r L0 3 6 ETEC-vaccingruppen. Vaccineffektiviteten när det gäller ETEC-vaccin mot placebo var 79% (p=0,119) och mot koleravaccin 84% (p=0,0496). Jämförelse mellan ETEC-diarr6. frekvenserna gjordes med ensidigt Fishers exakta test. Alla ETEC-isolat i per protokoll populationen uttryckte kolonisationsfaktorer 5 som inkluderats i vaccinet. Koleravaccinet gav inget detekterbart skydd mot ETEC jämfört med placebogruppen, men det är värt att notera att endast två av ETEC-fallen i koleravaccingruppen förorsakades av bakterier som producerade enbart värmelabilt enterotoxin (LT) mot vilket koleravaccinet (genom dess B-subenhet) teoretiskt kan fungera. 10 Sålunda, på grund av det faktum att det fanns nästan enbart LT-negativa stammar närvarande i denna grupp, borde koleravaccinet inte ha någon effekt. Trots dessa resultat måste man hålla i minnet att avföringsprovhanteringen som beskrivits eventuellt kan vara en felkälla. När transportmedier används finns det risk att förlora känsliga patogener, medan mindre känsliga sådana, såsom E. coli bakterier överlever, 15 vilket resulterar i falska positiva fall av ETEC-diarr (se definition av ETEC-diarr4 Följaktligen kan andelen av ETEC-diarri ha blivit överskattad. Det är emellertid osannolikt att eventuellt falska positiva fall är ojämnt fördelade över studiegrupperna. Beträffande immunogenicitet kunde en signifikant ökning av antikroppar mot B- subenheten av koleratoxin (CTB) visas med hjälp av anti-ctb IgA ELISA i gruppen som 20 erhöll ETEC-vaccin (geometriskt medeltal av titrar pre- mot post-vaccination: 7,8 mot 58,7 efter den första och 62,6 efter den andra dosen; seroomvandling efter den andra dosen: 91%) och i gruppen som erhöll koleravaccinet (7,6 mot 54,6 efter den första och 60,1 efter den andra dosen; seroomvandling 100%). Placebogruppen uppvisade inte någon signifikant ökning av anti-ctb responsen (7,9 mot 8,3 efter den första och 11,8 efter den andra dosen; 25 seroomvandling 29%). Sålunda ehuru CTB-kolera WC-vaccin inducerar en mycket god respons mot B-subenheten observerades inte en signifikant påverkan av detta vaccin på ETEC-diarr6 Detta kunde framförallt tillskrivas det faktum att majoriteten av ETEC-stammarna som isolerats från dessa frivilliga personer endast producerade ST (9 av 12) och därför kunde de 30 inte förhindras av koleravaccinet. Synbarligen är anti-cfa antikroppar synnerligen viktiga för skydd mot framförallt diarréförorsakad av ST-enbart ETEC. Föreliggande resultat är de första som ger stöd i människor för arbetshypotesen att oralt ETEC-vaccin-inducerad anti-cfa/cs immunitet kan skydda mot diani förorsakad av ST-enbart producerande ETEC. T:kPATENT\29-\296631svensktxt.doc
" n r on 7 Patentkrav 5 1. Oral vaccinkomposition mot enterotoxigen E. coli förorsakad diarréhos människor, vilken omfattar en definierad mängd av åtminstone tre olika typer av kolonisationsfaktor antigener (CFAs) valda från den grupp som består av CFA I, CFA II (CS 1, CS2 och CS3) och CFA IV (CS4, CS5 och CS6), på avdödade E. coli bakterier som saknar den gen som kodar för värmelabilt (LT) enterotoxin, tillsammans med en definierad mängd 10 av B-subenheten av koleratoxin (CTB), och en vehikel, vilken vaccinkomposition renats från eventuellt förekommande värmestabilt enterotoxin (ST). 2. Oralt vaccin enligt kravet 1, vari den definierade mängden av olika typer av CFAs är för varje typ av CFA åtminstone 100 gg, och den definierade mängden av CTB är åtminstone 0,5 mg och vehikeln är en fysiologiskt acceptabel buffertlösning. 15 3. Oralt vaccin enligt kravet 2, vari den definierade mängden av olika typer av CFAs är för varje typ av CFA 100 till 300 gg, och den definierade mängden av CTB är 0,5 till 2,0 mg. 4. Oralt vaccin enligt kravet 3, vari den definierade mängden av olika typer av CFAs är 200 gg av CFA/I, 200 in av CS1, 150 gg av CS2, 200 gg av CS4 och 150 gg of 20 CS5, och 1,0 mg av CTB, och den fysiologiskt acceptabla buffertlösningen är fosfatbuffrad saltlösning. T: TATENT129-\29663 lsvensktxtdoc