COMPARATIVE STUDY OF HYDROLYSIS PERFORMED WITH MODERN MICROWAVE TECHNIQUE AND THE TRADITIONAL METHOD

Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete, 15 hp COMPARATIVE STUDY OF HYDROLYSIS PERFORMED WITH MODERN MICROWAVE TECHNIQUE AND THE TRADITIONAL METHOD Seid Hosen Seid Tahir Ethos1 Gallenkamp Handledare: Bo Ek Institutionen för biokemi och organisk kemi 1

ABSTRACT Proteins are vital to all cells in the body. They consist of long chains of amino acids. To be able to study the amino acid composition of a protein it is necessary to hydrolyse it, followed by separation and quantification. When the protein is hydrolysed, in this case ß-lactoglobulin, the protein is divided into individual amino acids. The method that traditionally has been used to hydrolyse proteins takes 24-72 hours to complete. Recently a new microwave heating technique was introduced. With the Ethos1 microwave oven it takes less than one hour to hydrolyse proteins. The objective of this study was to see if the result of the hydrolysis with the new microwave oven technique had the same quality as the previously used method. If the microwave technique can hydrolyse proteins with as good results as the old oven, then it will significantly reduce test turnaround times. The result of this study indicates that the microwave technique is just as reliable as the older method, and thus a good and time saving alternative. KEYWORDS: Hydrolysis; Amino acids; Protein; Microwave 2

1. INTRODUKTION Proteiner utgör, efter vatten, största delen av cellens innehåll. Namnet protein kommer från grekiskans proteios som betyder det första eller förnämsta (Nylander, 1997). Proteiner ingår i kroppens alla celler. Ofta beskrivs protein därför som en av kroppens byggstenar. De behövs för tillväxt och underhåll av kroppen. Proteiner är viktiga beståndsdelar i muskler, men har även andra viktiga funktioner. Nästan alla hormoner och alla enzymer är proteiner, vilka spelar roll i en mängd olika processer i kroppen. Flera ämnen måste vara bundna till proteiner för att kunna transporteras i blodet. Exempel på det är hemoglobin som transporterar syre och lipoproteiner som bär med sig fett. Protein har således nödvändiga uppgifter i kroppen som inte kan ersättas av andra ämnen. De kan också vara en energikälla, vid sidan av kalorier (energi) från kolhydrater och fett. Proteiner har alltså många uppgifter i kroppen och finns i nästan alla livsmedel. Kroppen behöver under en dag tillföras alla aminosyror den inte kan göra själv. Detta är de så kallade essentiella aminosyrorna och de är totalt åtta stycken. Resten kan kroppen göra själv efter behov och de kallas därför icke-essentiella. Proteiner är uppbyggda av långa aminosyrekedjor. Aminosyror är karboxylsyror innehållande minst en aminogrupp samt en R-grupp som ger aminosyran dess identitet. Aminosyror kopplas samman och bildar polypeptider. Ändarna på peptider kallas N-terminal (aminogrupp) och C-terminal (karboxylgrupp). Varje aminosyra är sammanfogad med nästa genom en peptidbindning. Peptidbindningen uppstår då karboxylgruppen på en aminosyra reagerar med aminogruppen på en annan aminosyra. På så vis utgörs polypeptidkedjan, proteinets ryggrad, av en α-kol bundet till en amidgrupp bundet till nästa α-kol etc. Ett protein består av en eller flera sådana polypeptidkedjor. För varje protein är sammansättningen av aminosyror och ordningsföljden av dessa unik. Proteiner delas in i fiberproteiner och 3

globulära proteiner. Fiberproteinerna har en trådig form och de globulära proteinerna har en rundare form. Aminosyraanalys betraktas som det säkraste sättet att koncentrationsbestämma proteiner och peptider. Det finns flera metoder t.ex. absorbansmätning inom UV-området, men metoden kräver ett relativt rent material eftersom t.ex. även nukleinsyror absorberar UVljus. Proteinets sammansättning kan också påverka vilken våglängd som måste användas. Lowry och BCA (Bicinchoninic acid) använder sig av kopparjoner och är beroende av mängden peptidbindningar och aromatiska aminosyror. Bradfordmetoden baseras på proteinbindning av Coomassie Brilliant Blue till främst arginin och lysin varvid absorbtionsmaximum ändras. För båda metoderna gäller att resultatet blir olika för varje protein, då de innehåller olika antal av nämnda aminosyror. En standardkurva med det protein man mäter och ett rent protein är nödvändiga för att få tillförlitliga resultat med de metoderna. Vid aminosyraanalys degraderas provet till aminosyror och mängden av varje komponent bestäms m.h.a. kromatografi. Den metoden har inte de begränsningar som ovanstående metoder har och är därför den mest noggranna metoden. Aminosyraanalys består av tre delar, hydrolysering av proteinet man vill studera, kromatografisk separation, samt detektion och kvantifiering av de fria aminosyrorna. Hydrolys är en nedbrytningsprocess där proteinet bryts ner när vattenmolekyler adderas. Den kan, när det gäller proteiner, antingen vara katalyserad av hydroxoniumjoner (syra) eller hydroxidjoner (bas). I den här studien användes syrakatalyserad hydrolys. För att en analys ska bli korrekt måste hydrolysen vara väl genomförd (Fountoulakis och Lahm, 1998), d.v.s. för att kunna lita på den påföljande aminosyraanalysen måste man veta att proteinet verkligen har hydrolyserats fullständigt eller att utbytet av de frisatta enskilda aminosyrorna är känt. Man vet t.ex. att utbytet av serin är 90% under standardbetingelser och kan då kompensera mätvärdet i motsvarande grad. 4

Ett viktigt område för aminosyraanalyser är halt- och renhetsbestämning av utgångsmaterial för peptidsyntes inom t. ex läkemedelsindustrin. Detta krävs i vissa fall av FDA (Federal Drug Agency) i USA, för att godkänna en produkt baserad på aminosyraderivat (Bo Ek, muntlig kommunikation, 2011). Ett annat användningsområde är möjligheten att mäta andelen bindningsmedel i kött- och charkuteriprodukter. Många europeiska länder har en gräns för hur mycket bindningsmedel kött- och charkuteriprodukter får innehålla. Proteinet kollagen utgör en stor del i de bindningsmedel som används och kollagen innehåller en hög halt av aminosyran hydroxyprolin. Andra muskelproteiner innehåller så gott som inget hydroxyprolin, vilket gör att man kan bestämma andelen bindningsmedel genom att analysera produkten för hydroxyprolin (Engelhart, 1990). Olika hydrolysmetoder används även för att ta hand om slam på ett så effektivt sätt som möjligt. Davidsson et al. (2008) har utvärderat olika hydrolysmetoder för ändamålet, men kunde inte utse en enskild metod som bättre än någon annan då det fanns flera variabler som påverkade resultatet. Olika hydrolysmetoder lämpade sig därför bäst vid olika förhållanden. Enzymatisk hydrolys av mjölkprotein har länge använts för att framställa t.ex. produkter för spädbarn med mjölkproteinsallergi eller medfödda metabola funktionsnedsättningar (Abu-Tarbush och Ahmed, 2005) t. ex. fenylketonuri (PKU), som är en medfödd metabol sjukdom orsakad av att enzymet fenylalaninhydroxylas inte fungerar. Som ett resultat av detta kan den essentiella aminosyran fenylalanin inte konverteras till tyrosin utan ackumuleras istället i kroppen (ten Hoedt et al., 2011). Enzymatisk hydrolys är vanlig inom livsmedelsindustrin för att spjälka ut protein ur växter, fördelen med enzymatisk hydrolys när det handlar om livsmedel är att det går att använda sig av enzymer som bryter peptidkedjorna på specifika ställen. På så vis förhindrar man att peptidkedjorna bryts ner i alltför små enheter eller blir till fria aminosyror. Små peptider kan nämligen ge en bitter smak som inte är önskvärd för livsmedel (Hrcková, 2002). Enzym kan inte användas när man vill 5

bryta alla peptidbindningar, varför syrakatalyserad hydrolys som ger större andel fria aminosyror användes i det beskrivna arbetet. På Aminosyraanalyscentralen vid Uppsala Universitet görs bestämningar av mängden eller halten av olika aminosyror i olika typer av proteinhaltiga prover. För att frigöra aminosyrorna så att de kan analyseras hydrolyseras först provet. Hydrolys sker traditionellt enligt en beprövad metod, i 6M HCl under 24 timmar i luftevakuerade rör för att minimera risken för oxidation av aminosyrorna. Det gamla klassiska sättet, på vilket man utfört proteinhydrolys under de senaste 50 åren, innebär att proverna upphettas till 110 o C under 24-72 timmar i närvaro av saltsyra (HCl), som är den vanligaste metoden. Hydrolys kan dock även utföras i närvaro av en basisk lösning (vanligast NaOH eller KOH) eller med en enzymatisk nedbrytningsmetod (Fountoulakis och Lahm, 1998). Efter analysens slutförande kan man jämföra mängden faktiska aminosyror i provet med den kända sammansättningen av aminosyror och således kan man räkna fram mängden av exempelvis ett protein eller en peptid i utgångsprovet, vilket är det tillvägagångssätt som vi valt i den här studien. 24-timmars hydrolys är en mycket tidskrävande process och proverna hanteras manuellt ett och ett. Därför vore en alternativ, effektivare, metod mycket värdefull. Genom att använda sig av mikrovågor vid upphettningen av provet och dessutom hetta upp till en högre temperatur kan man förkorta hydrolystiden från 24 timmar till under en timme, vilket skulle spara mycket arbetstid. Proteinhydrolys för aminosyreanalys med hjälp av mikrovågsteknik rapporterades för första gången 1987 och har utvecklats sedan dess. Mikrovågstekniken har i tidigare studier visat sig vara jämförbar eller överlägsen den traditionella 24-timmars hydrolystekniken (Engelhart, 1990 och Margolis et al., 1991). Andra studier visar att mikrovågstekniken inte håller samma standard som den traditionella metoden (Weiss et al., 6

1998). Syftet med denna studie var att undersöka om man får samma resultat med mikrovågsteknik som med den traditionella 24-timmars proteinhydrolysen som hittills använts vid Aminosyraanalyscentralen vid Uppsala Universitet. För den nya mikrovågsbaserade analysen användes ett kommersiellt instrument kallat Ethos1 som är relativt nytt på marknaden. Proteinet som valdes till analys i den jämförande metodanalysen var ß-lactoglobulin. ß-Laktoglobulin är det vanligast förekommande vassleproteinet i komjölk. Det tillhör lipocalin-proteinfamiljen och är en av de huvudsakliga allergenerna i mjölk (Rytkönen et al., 2006) samtidigt som det har ett högt näringsvärde jämfört med andra protein, eftersom det har ett högt innehåll av essentiella aminosyror och är relativt lättsmält (Sindayikengera and Xia, 2006). ß-Laktoglobulin är dock inte helt lätt att hydrolysera (Rytkönen et al., 2006), anledningen till valet var att dess sammansättning av aminosyror är välkänd och man vet hur utbytet av respektive aminosyra ser ut. 7

2. MATERIAL OCH METODER 2.1 Hydrolys med den äldre metoden. Vid analys enligt den äldre metoden började man med att rista namn på glasrören med en tandläkarborr. Sedan vägdes 5,0 mg ß-laktoglobulin upp och fördes försiktigt över till röret och den exakta vikten antecknades. Proteinet blandades med 2 ml 6M HCl och 1000 nmol norleucin. Proven vortexades tills de blev grumliga, då var proven riktigt blandade med saltsyran. En gasolbrännare användes för att smälta provrörshalsarna som sedan drogs ut som i figur 1. Figur 1 Figuren illustrerar hur man drar ut en provrörshals med svetslåga. Proverna frystes till is med hjälp av kolsyreis vid - 78,5 C, därefter inkuberades provrören i vakuum i 10 minuter. När alla provrören var luftevakuerade slutsvetsades de utan att luft släpptes in (figur 2). 8

Figur 2 Ett slutsvetsat provrör. Till slut placerades de slutsvetsade provrören i ugnen för hydrolys i 24 timmar vid 110 o C. Efter exakt 24 timmar öppnades rören genom att en skåra ristades ca 1 cm från toppen (se figur 3). En glasstav värmdes och sattes mot skåran så att röret sprack. Figur 3 Illustrerar hur man ristar en skåra runt ett provrör efter hydrolys. 9

När provröret öppnats smältes den vassa kanten på den översta delen av röret så att den blev rund. När alla dessa moment var klara så var hydrolysen klar, men för att veta vad man har i provröret så måste man utföra en analys i en aminosyraanalysator. Innan man kan göra den analysen måste proverna vara totalt fria från saltsyra (HCl), och därför genomfördes en evakuering (indunstning) av saltsyra. 2.1.1 Indunstning av saltsyra med Rotavapor RE 111 Vid indunstning av saltsyra kontrollerades att vattenbehållaren var fylld med vatten, inställd på 55 o C samt att det fanns is i isbehållaren. Provrören monterades i munstycket med sex provrörsplatser (se figur 4). Figur 4 Evakuering av saltsyra. Sedan öppnades tryckluftkranen helt, vattenpumpen startades och därefter stängdes luften långsamt så att proverna inte stötkokade. Proverna indunstades till torrhet. Nästa steg innefattade att lösa proverna i buffert för analys i aminosyraanalysatorn. 10

2.1.2 Upplösning av proven Proverna löses i en lämplig volym provbuffert. Provbufferten utgjordes av 0,2M natriumcitratbuffert, ph 2,2. I de presenterade analyserna löstes proverna i 2ml buffert och centrifugerades i 2 minuter vid 450g. Proverna överfördes till vialer och centrifugerades i 4 minuter på 16000g. Därefter laddades aminosyraanalysatorn Biochrom med prov, och det efterföljande analyssteget tog ca 1 timme per separation. 2.2 Hydrolys med Ethos1 Ett hydrolysprotokoll för prover som är rena proteiner enligt MODDE experimentdesign användes (se tabell 1). Programmet MODDE experimentdesign används dels för att få en optimal körningslista och dels för att analysera resultat så att optimala betingelser kan utvärderas och reproducerbarhet kontrolleras. De fyra viktiga faktorerna vid aminosyraanalys är vikt (mg), temperatur ( o C), volym (ml) och tid (minuter). Jag genomförde elva analyser (N1 till N11) där värdena för volym, tid och temperatur varierades (se körningslistan i Tabell 1). Tre av körningarna är dubbletter: N9, N10 och N11. Dubblett görs för att se reproducerbarhet d.v.s. om ett prov som körs under samma betingelser genererar samma resultat vid flera tillfällen har metoden hög reliabilitet. 11

Tabell 1 Schema från MODDE experimentdesign. Numme r Namn Analysordning Vikt (mg) Temper atur ( o C) Tid (mi n) Volym (ml) 1 N1 10 0,2 140 20 0,2 2 N2 4 5 140 20 2 3 N3 6 0,2 180 20 2 4 N4 11 5 180 20 0,2 5 N5 2 0,2 140 45 2 6 N6 9 5 140 45 0,2 7 N7 5 0,2 180 45 0,2 8 N8 8 5 180 45 2 9 N9 7 2,6 160 10 N10 3 2,6 160 11 N11 1 2,6 160 32, 5 32, 5 32, 5 1,1 1,1 1,1 Vakuumpumpen förbereddes genom att kolsyreis tillsattes behållaren med alkohol. Ett provrör i taget preparerades enligt schemat i tabell 1. Proteinet blandades med 2ml 6M HCl och 1000 nmol norleucinbuffert. Proverna vortexades tills de blandats med saltsyra. Vid användning av mikrovågsugnen Ethos1 behövde glasrören inte smältas ihop, utan korkades bara igen. Därefter förbereddes behållare A med 3ml 6M HCl. Provrören placerades i behållare B som har 8 platser. Därefter placerades behållare B i behållare A och monterades i 12

sin tur i behållare C (se figur 5). Sedan skruvades locket på ordentligt och termostaten monterades på plats. Figur 5 Ethos1s olika behållare. A är behållaren där man häller i saltsyra och sedan placeras den i behållare B. B är behållaren för proverna och slutligen placeras behållare A+B i behållare C där själva hydrolysen sedan äger rum. Ethos1 har en touch screen där man kan programmera körningar efter tid och temperatur. Vid programmering av Ethos1 ställdes starttiden in på 10 minuter och temperaturen på 180 o C vilket innebar att temperaturen gick från rumstemperatur till 180 o C på 10 minuter. Körningstiden programmerades till 45 minuter i 180 o C. Innan hydrolysen startades evakuerades luften. Vakuumpumpen startades och när all luft evakuerats startades programmet. Under hydrolysens gång kunde körningen följas genom att temperaturen och hur lång tid som var kvar av hydrolystiden visades på displayen (se figur 14). När hydrolysen var klar kyldes proverna snabbt ner genom att vattenkranen som fanns monterad till Ethos1 öppnades. När 13

temperaturen visade under 70 o C var det klart att öppna och ta ut proverna. Hydrolysen var därmed klar och nästa steg var att evakuera saltsyran. Enligt tillverkaren skall man kunna torka proverna till torrhet i Ethos1 genom att programmera ett tredje steg för torkning. I denna studie torkades dock inte proverna i Ethos1, utan alla prover indunstades som beskrivs i stycke 2.1.1. 2.3 Separation av aminosyror i Biochrom Biochrom 3a användes för att analysera samtliga prov, både de som hydrolyserats med den äldre metoden och de som hydrolyserats med mikrovågstekniken. Aminosyranalysen utfördes med postkolumnderivering av aminosyrorna med hjälp av ninhydrin, vilket är en pålitlig metod (Klotz och Higgins, 1991). Metoden bygger på katjonbyteskromatografi och absorbansen mättes vid två våglängder, 440 nm och 570 nm då prolin detekteras bäst vid 440 nm medan övriga aminosyror detekterades vid 570 nm. Jonbytaren i aminosyraanalysatorn regenerererades genom att 0,4 molar NaOH i 90 C pumpades igenom så att hela systemet tvättades rent. Steg två kallas för jämviktning då buffert 1 (startbuffert) fylldes på i alla buffertbehållare och analysatorn kördes med bara buffert, så att systemet nollställdes. Här blandas nivåerna. 0,4M NaOH körs vid varje kromatografi för att säkerställa att kolonnen är ren. Varje set av analyser innehåller en blankkörning, en standard och sedan prover. Vid steg tre kördes analysatorn med en standard för att kalibrera systemet. I standarden ingår en känd koncentration av alla aminosyror. Slutligen analyserades β- laktoglobulinproverna från de båda olika hydrolysmetoderna. 14

mvolts mvolts 3. RESULTAT Vid jämförelsen mellan mikrovågstekniken och den äldre metoden för bestämning av aminosyrakonposition i β-laktoglobulin visade den äldre hydrolysmetoden förväntade resultat, vilket ses i Tabell 2, där aminosyrorna som detekterades i provet presenteras, samt jämförs med mängden av respektive aminosyra som angetts av tillverkaren som ska leda till/bli en databas typ SwissProt. Aspargin hydrolyserades totalt till asparaginsyra och glutamin till glutaminsyra men aminosyrorna isoleucin, valin och några till blev inte hydrolyserade till 100%. Dessa kräver upp till 72 timmar när man använder den äldre 24-timmars metoden (Irvine, 1994) (se även figurerna 6-8). 800 800 700 700 600 600 500 500 400 400 300 300 200 200 Cys A 3.866 Nle NH3 33.098 54.597 10.066 (Mes02) Pro 19.032 Gly Cys 29.898 Met Thr Ser 24.132 26.998 Ala 29.331 Ile 36.631 Glukosamin/B-ala Tyr 37.998 Phe Galaktosamin 41.197 42.331 S-Bzl-Cys 44.031 Hy-Lys 44.864 Trp 46.364 47.230 48.730 His 48.197 51.397 52.363 Arg 61.863 13.432 14.432 30.865 25.665 Val 43.231 41.864 Asp 27.632 Lys 11.299 Glu 17.499 Leu 49.930 31.898 570 nm N5 B-lac Seid Name Retention Time 100 100 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Minutes Figur 6 Ett kromatogram av hydrolyserat β-laktoglobulin med 570nm detektion, 24 timmars hydrolys med äldre metod.

mvolts mvolts Gly Ala NH3 Thr Ser Ile Leu Nle Tyr Phe Arg Cys A Asp MeSO2 Glu Pro Val Met mvolts mvolts His Lys Cys 50 440 nm std Name 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Figur 7 Ett kromatogram av hydrolyserat β-laktoglobulin med 440nm detektion, 24-timmars hydrolys med äldre metod. Minutes 120 120 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 Cys A 3.866 Mes02 12.333 Val 27.532 Pro 18.932 (Glukosamin/B-ala) (Galaktosamin) (S-Bzl-Cys) (Hy-Lys) (Trp) NH3 54.330 Arg Ala Glu Gly 25.565 Tyr Phe 61.663 17.399 24.132 Nle 36.564 37.898 Thr 31.765 Ile 32.965 Leu Asp 13.399 Ser 11.166 14.432 Cys 30.731 Lys 26.898 Met 49.797 29.198 His 48.130 570 nm std1 Name Retention Time 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Minutes Figur 8 Ett kromatogram av standardblandning av aminosyror, 24-timmars hydrolys med äldre metod.

Tabell 2 Analysresultatet från Biochrom för β-laktoglobulin, 24-timmars hydrolys med äldre metod β-laktoglobulin Norleucin Tillverkarens Analyserade 5 mg Normaliserat värde Avvikelse aminosyror Värde (mg) (mg) (mg) Aspargin 9,51 15,64 15 0,64 Treornin 4,90 8,06 8 0,06 Serin 4,12 6,77 7-0,23 Glutamin 16,40 26,98 25 1,98 Glycin 2,54 4,17 4 0,17 Alanin 9,73 16,00 15 1,00 Cystein 0,15 0,25 5 4,75 Valin 5,55 9,12 9 0,12 Metionin 2,43 4,00 4 0,00 Isoleucin 5,41 8,89 10-1,11 Leucin 14,20 23,35 22 1,35 Tyrosin 2,47 4,07 4 0,07 Fenylalanin 2,55 4,20 4 0,20 Histidin 1,20 1,98 2-0,02 Lysin 9,43 15,50 15 0,50 Arginin 1,82 3,00 3 0,00 Antal aminosyror i nmol, korrekt värde enligt proteinets tillverkare och, i de två sista kolumnerna, den uträknade skillnaden mellan analysvärdet och tillverkarens uppgivna värde.

mvolts mvolts Ethos1 mikrovågsmetod gav likvärdiga resultat, vilket visas i Tabell 3. Där kan man se vilka aminosyror som finns och hur mycket av dem man har. Figur 9 visar topparna på de flesta av aminosyrorna vid 570 nm och figur 10 visar topparna på prolin vid 440 nm. Figur 11 visar standarden. Ju högre toppar det blev desto större andel av den aminosyran fanns i proteinet som hydrolyserats. 1000 1000 800 800 600 600 400 400 Cys A 3.733 NH3 Pro 53.430 Gly Thr 14.266 Ser 18.565 Cys Nle Met Asp 13.266 23.965 Ile Glu 25.365 Ala 26.332 27.098 Val 28.831 30.298 32.431 35.431 Leu Tyr 36.798 Glukosamin/B-Ala Phe 38.898 39.564 Galactosamin 40.131 40.531 45.297 46.730 47.464 His 51.263 Trp Arg 50.397 60.129 63.529 64.563 42.097 Lys 10.933 16.932 31.365 41.131 48.364 570nm N6 B-lac2 Seid d871.dat Name Retention Time 570nm buffert D494.dat 200 200 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Minutes Figur 9 Kromatogram av β-laktoglobulin med 570 nm detektion, efter hydrolys med Ethos1.

mvolts mvolts Minutes Figur 10 Ett kromatogram av hydrolyserat β-laktoglobulin med 440nm detektion, med Ethos1. 120 120 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 Cys A 3.866 Mes02 12.333 Val 27.532 Pro 18.932 (Glukosamin/B-ala) (Galaktosamin) (S-Bzl-Cys) (Hy-Lys) (Trp) NH3 54.330 Arg Ala Glu Gly 25.565 Tyr Phe 61.663 17.399 24.132 Nle 36.564 37.898 Thr 31.765 Ile 32.965 Leu Asp 13.399 Ser 11.166 14.432 Cys 30.731 Lys 26.898 Met 49.797 29.198 His 48.130 NH3 Cys A (MeSO2) Gly Thr Ser Pro Ala Met Ile Nle Cys Val mvolts Asp Leu mvolts Glu (Glukosamin/B-Ala) Tyr Phe (Galactosamin) (S-Bzl-Cys) (Hy-Lys) His (Trp) Arg Lys 300 440nm N6 B-lac2 Seid d871.dat Name 300 200 200 100 100 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 570 nm std1 Name Retention Time 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Minutes Figur 11 Ett kromatogram av standardblandning av aminosyror, med Ethos1.

Tabell 3 Analysresultatet från Biochrom för hydrolys av β-laktoglobulin med mikrovågsteknik β-laktoglobulin Norleucin Tillverkar Analyserade 5 mg Normaliserat ens värde Avvikelse aminosyror Värde (mg) (mg) (mg) Aspargin 9,55 15,92 15 0,92 Treonin 4,42 7,37 8-0,63 Serin 3,51 5,86 7-1,14 Glutamin 15,34 25,57 25 0,57 Glycin 1,78 2,97 4-1,03 Alanin 8,51 14,18 15-0,82 Cystein 1,75 2,91 5-2,09 Valin 5,44 9,06 9 0,06 Metionin 2,40 4,00 4 0,00 Isoleucin 4,81 8,03 10-1,97 Leucin 13,18 21,97 22-0,03 Tyrosin 2,28 3,80 4-0,2 Fenylalanin 2,34 3,90 4-0,1 Histidin 1,08 1,79 2-0,21 Lysin 8,80 14,67 15-0,33 Arginin 1,62 2,71 3-0,29 Antal aminosyror i nmol, korrekt värde enligt proteinets tillverkare och, i de två sista kolumnerna den uträknade skillnaden mellan analysvärdet och tillverkarens uppgivna värde.

Stapeldiagrammet i figur 12 visar en jämförelse mellan värdena från respektive hydrolysmetod; den äldre metoden och den nya mikrovågstekniken, samt de värden som enligt tillverkaren är korrekta. De olika metoderna visar att mikrovågsugnen Ethos1 har hydrolyserat proteinet lika bra eller bättre än den äldre 24-timmarsmetoden. Figur 12 Stapeldiagrammet som visar resultatet efter hydrolys av β-laktoglobulin med rutinmetoden (blå), Ethos1 (röd) och tillverkarens angivna värde (grön).

4. DISKUSSION Under de senaste 50 åren har aminosyraanalys varit en tidskrävande process med många manuella moment samt en lång hydrolys om 24 timmar. Med mikrovågstekniken kan processen förenklas betydligt, både genom att vissa av de manuella momenten inte behöver genomföras samt att hydrolysen endast tar en timme med mikrovågsteknik. Målet med studien var att utvärdera effektivitet för mikrovågsugnen Ethos1 jämfört med den äldre 24-timmarsmetoden. Bedömningskriterierna var om Ethos1 uppfyller kvalitetskraven för hydrolysen och om tidsvinsten var tillräckligt stor. Resultatet från aminosyraanalys efter hydrolys med den äldre metoden, se tabell 2, visade låg variation mellan korrekt värde enligt proteintillverkaren och norleucin-normaliserat värde för de flesta aminosyrorna. Hydrolys med Ethos1 visade lika bra resultat som med den äldre metoden, se figur 12, och uppvisade också god överensstämmelse med värdet som proteinets tillverkare angivit. Mikrovågsmetoden resulterade dock i betydligt högre värden av cystein än den äldre 24-timmars metoden (figur 12). Cystein har ansetts vara alltför instabil under syrahydrolys för att kunna haltbestämmas genom automatisk aminosyraanalys (Inglis och Teh-Yung Liu, 1970). Den kortare hydrolystiden med mikrovågstekniken förhindrar att cystein sönderfaller i samma utsträckning som när hydrolysen tar 24 timmar, med den äldre metodiken, sannolikt är cystein känsligt för värme under en längre tid vilket kan förklara skillnaden i resultat mellan de olika metoderna. Så här långt är resultatet alltså positivt, särskilt med tanke på att man kör hydrolys med Ethos1 på 45 minuter medan samma hydrolys tar 24 timmar med den äldre metoden. Utöver hydrolystidsvinsten så är det en hel del tidskrävande och riskfyllda arbetsmoment som inte behövs när man använder sig av Ethos1, som dem illustrerade i figur 1-4.

En annan fördel med Ethos1 är att man kan följa hydrolysen under processens gång (figur 13), en funktion som saknas vid användande av den äldre metoden. Figur 13 Skärmdump från displayen på Ethos1, där man kan följa hydrolysen. Det fanns flera moment som jag kunde ha utfört för att få ett exaktare resultat enligt tillverkaren av Ethos1 rekommendationer, men tid saknades. Trots detta producerade hydrolys med Ethos1 resultat som var lika bra som de vi fick med den äldre hydrolysmetoden. Allt talar för att Ethos1 är en klart användbar metod för hydrolys - snabb, enkel och säker.

5. REFERENSER Abu-Tarbush, H.M. och Ahmed, S.B. (2005). Characterization of hydrolysates produced by enzymatic hydrolysis of camel casein and protein isolates of Al-Ban (Moringa peregrina) and Karkade (Hibiscus sabderiffa) Seeds. Journal of Saudi Society for Agricultural Science, Vol. 4(2), pp 61-82. Davidsson, Å., Jönsson, K., la Cour Jansen, J. och Särner, E. (2008) Metoder för slamhydrolys, Svenskt Vatten Utveckling Rapport, Vol. 09, pp 1-39. Engelhart, W. G. (1990). Microwave hydrolysis of peptides and proteins for amino acid analysis. American Biotechnology Laboratory, Vol. 8(15), pp 30-34. Fountoulakis, M. och Lahm, H-W, (1998). Hydrolysis and amino acid composition analysis of proteins. Journal of Chromatography A, Vol. 826, pp 109-134. Hrcková, M., Rusnáková, M. och Zemanovic, J. (2002) Enzymatic hydrolysis of defatted soy flour by three different proteases and their effect on the functional properties of resulting protein hydrolysates. Czech Journal of Food Science, Vol. 20, pp 7 14. Inglis, A. S. och Teh-Yung Liu. (1970). The stability of cysteine and cystine during acid hydrolysis of proteins and peptides. Journal of Biological Chemistry, Vol. 245(1), pp 112-116. Klotz, A.V. och Higgins, B.M. (1991). Deamidation and succinimide formation by gamma-nmethylasparagine: potential pitfalls of amino acid analysis. Archives of Biochemistry Biophysics, Vol. 291(1), pp 113-20. Margolis, S. A., Jassie, L. och Kingston, H. M. (1991). The hydrolysis of proteins by microwave technology, Journal of Automatic Chemistry, Vol. 13(3), pp 93-95. Rytkönen J, Valkonen K, Virtanen V, Foxwell RA, Kyd JM, Cripps AW och Karttunen TJ. (2006) Enterocyte and M-cell transport of native and heat-denatured bovine β-lactoglobulin: Significance of heat denaturation, Journal of Agricultural and Food

Chemistry, Vol. 54, pp 1500-1507. Sindayikengera, S. och Xia, W-S. (2006). Nutritional evaluation of caseins and whey proteins and their hydrolysates from Protamex, Journal of Zhejiang University SCIENCE B, Vol. 7(2), pp 90-98. ten Hoedt, A. E., Maurice-Stam, H., Boelen, C. C. A., Rubio-Gozalbo, M. E., van Spronsen, F. J., Wijburg, F. A., Bosch, A. M. och Grootenhuis, M. A. (2011) Parenting a child with phenylketonuria or galactosemia: implications for health-related quality of life, Journal of Inherited Metabolic Disease, Vol. 34 (2), pp 391-398. Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J-F, Lahm, H-W och Fountoulakis, M. (1998). Effect of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of proteins, Journal of Chromatography A, Vol. 795(2), pp 263-275.