Bruksanvisning revision 6 (December 2008) ChromoQuant In vitro diagnostiskt test kit för analys av vanligen förekommande aneuploidier i kromosomerna 13, 18 och 21 samt i X och Y. Se förpackning Se förpackning 48-18 C -25 C 311.002.1-48u, 412.001-48u samt extramarkörer 313.002-24, 318.002-24, 321.002-24, 330.001-24 Användningsområde för produkten Den avsedda användningen av produkten ChromoQuant är för bestämning av de vanligaste förekommande kromosomala avvikelserna, s k trisomier i kromosomerna 13, 18 och 21 samt för aneuploidier i könskromosomerna. Produkterna kompletterar traditonell karyotypning. ChromoQuant 311 och 412 kan även användas som fristående produkt. Extramarkörerna kan inte användas som fristående produkter utan utgör komplement till 311.002.1 och 412.001. Principer bakom metoden QF-PCR ChromoQuant är baserat på QF-PCR tekniken (Quantitative Fluorescent PCR). För att avgöra om en trisomi föreligger, användes amplifiering av STR (Short Tandem Repeats). I detta fall är alla markörer tetra-nukleotid repeats utom markör X22 som är ett penta-nukleotid repeat (X/Y). STR har en specifik placering på en given kromosom. I ChromoQuant QF- PCR amplifieras flera STR parallellt, s k multiplex PCR. Fluorescensmärkta PCR primers genererar fluorescens för detektion av de unika PCR fragmenten. Tre olika färger har använts för inmärkning. Varje STR på en given kromosom har en unik längd som är avhängig hur många repeterande enheter den innehåller. På så sätt skiljer man en homolog kromosom från en annan. I det ideala normalfallet, di-allelisk individ, skulle två separata toppar genereras vid gel-separation av en STR. En ideal tri-allelisk individ skulle generera tre separata toppar. Emellertid förekommer även situationer där homozygoti inträffar med en (icke informativ) topp, alternativt två toppar med ett ett:två förhållande vid trisomi. I fall av trisomi inträffar detta särskilt om celldelningen har varit icke disjunct vid den andra meiotiska delningen. Egenskaper och begränsningar i metoden Varje kromosom analyseras med fyra-sex separata STR locus i huvudkiten (311.002.1-48u, 412.001-48u). Minst 2 av dessa markörer måste vara informativa för att resultatet skall kunna användas för tolkning. Kit med extramarkörer finns tillgängliga (313.002-24, 318.002-24, 321.002-24 samt 330.001-24) ChromoQuant kan inte användas för att avgöra om translokationer eller mosaicism förekommer. ChromoQuant ger endast indikation på Turner syndrom. Vid misstanke måste andra metoder användas för definitivt besked. För vidare information om ChromoQuant refererar vi till ChromoQuant User s Guide som kan hämtas via www.cybergene.se/chromoquantqfpcr.htm CyberGene AB Box 30057 ChromoQuant är ett registrerat varumärke som tillhör CyberGene AB, Sweden 104 25 Stockholm Sweden www.cybergene.se Q07-103-S06 Bruksanvisning ChromoQuant.doc 1(6)
Viktig information angående användning av ChromoQuant ChromoQuant QF-PCR kit är avsett att användas för analys med filter-set D i utrusting från Applied Biosystems (ABI Prism 3100, 310 and 3130 Genetic Analyzers), och med filter-set 2 i utrustning från Amersham Biosciences (MegaBACE 500/1000). Försäkra dig om att din sekvensutrustning har filter-set för tolkning av färgerna 6-FAM, HEX och NED. ChromoQuant rekommenderas för analys av DNA extraherat från fostervatten men fungerar även för saliv, munskrap, blod etc. Innehåll Funktionen av ChromoQuant kan inte garanteras för andra Taq polymerase än de som rekommenderas i denna instruktion. Taq polymeras är INTE inkluderat i ChromoQuant. För bästa analysresultat skall mängden DNA som används vara > 15 ng - < 150 ng per PCR 1 reaktion. Mängden DNA som används kan behöva korrigeras beroende på vald reningsmetod och dess effektivitet. Fostervattensprover innehållande spår av blod skall inte analyseras med detta kit. Salter kan komma att störa fragmentseparationen under gel-elektrofores. Vid behov skall provet därför avsaltas före eletroinjektion (gäller särskilt kunder som använder MegaBACE utrustning). För att undvika korskontamination under arbetet innan PCR skall pipettspets bytas innan varje pipetteringssteg. Om formamid används vid elektroinjektionen skall högsta kvalitet användas, då denna påverkar känsligheten i tolkningen (gäller särskilt användare med ABI instrument). Reagens för rening av genomiskt DNA ingår ej i detta kit. Användare måste inneha licens för användande av PCR tekniken från Hoffman La-Roche. Tolv (12) 8-rörs strips (311), Sex (6) 8-rör strips (412) Tre (3) 8-rörs strips (extramarkörkits; 313, 318, 321 och 330) Lock för PCR strips. 1X Enzyme Dilution Buffer 300 µl (vitt lock) (Tris-buffert, EDTA) 1X QF-PCR buffert 1,7 ml (gult lock) (extramarkörkits 0,45 ml) (MgCl 2, (NH 4) 2SO 4, dntps, β-mercaptoetanol, Bovint Serum Albumin) Sammansättning Varje PCR rör innehåller en torkad mix, klar att använda. Vilka kromosomer som analyseras samt färgerna på rören för respektive analys framgår av tabellen nedan. Prod. Nr. Färg på PCR rör Markörer för kromosom 311.002.1-48u Bärnstensgul kromosom 13, 18, X/Y - - Blå kromosom 21, X/Y 313.002-24 Röd kromosom 13 318.002-24 Lila kromosom 18 321.002-24 Gul kromosom 21 330.001-24 Grön kromsom X/Y 412.001-48u Blå Kromosom 13, 18, 21 En 8-rörs strip räcker till att analysera åtta (8) patientprover i aktuell(a) kromosom(er). För att analysera könskromosomerna med kit 311 måste man använda två rör; ett blått och ett bärnstensgult. Det är inte tillräckligt att bara använda ett rör. Kit 412 innehåller inga markörer för könskromosomer. 1 The PCR process is covered by USA patents 4,683,195 and 4,683,202 and foreign equivalents owned by Hoffman-La Roche AG Q07-103-S06 Bruksanvisning ChromoQuant.doc 2(6)
Lagringsinstruktioner och hållbarhet efter öppnande Lagring Oanvända PCR rör, innehållande torkade lösningar samt QF-PCR buffert lagras mörkt i < -18 C. Enzyme dilution buffer kan lagras vid -20 C - +8 C Använd aluminium folie för att skydda rören från ljus vid arbete på labbänk innan PCR. Vi rekommenderar att oanvänt material förvaras i sin originalförpackning. Hållbarhhet Se Expiry date på förpackningen. Reagens tillhandahållna av användaren Taq polymerase; HotStar Taq polymerase, Qiagen #203203, 250U [5 U µl -1 ] alternativt GoTaq, Promega Inc.; # M M8301/M3171, 100U [5U µl -1 ] Gel-elektrofores fluorescent storleks standard, t ex ABI GeneScan -500 [ROX] produkt # 401734 eller Amersham Biosciences ET-ROX 550 produkt #25-6550-01. Storleksstandad sätts till provet efter PCR men före gel-elektrofores. Kolonner för avsaltning av PCR produkt innan gel-elektrofores (vid behov) Reagens för rening av genomiskt DNA. Metodbeskrivning Rening och preparering av DNA före PCR Reagenser för rening av DNA från humant material är INTE inkluderat i ChromoQuant. Vi rekommenderar användning av kommersiellt tillgängligt kit som ger hög renhet av genomiskt DNA. Rent DNA skall spädas med destillerat och autoklaverat vatten till en slutkoncentration av 1,5-15 ng µl -1 Multiplex PCR amplifiering av genomiskt DNA 1. Tina QF-PCR buffert och Enzyme dilution buffert och placera på is. 2. Plocka fram antal PCR rör av respektive färg (se sid 2) som skall användas vid analys (n). 3. Blanda i ett separat polypropylene rör (t ex 1,5 ml Eppendorf -rör) en master mix bestående av; - 1,6 µl Enzyme dilution buffer - 0,4 µl Taq Polymerase multiplicerat med n - 13 µl QF-PCR buffert Blanda alltid några extra för att lösningen skall räcka till samtliga rör. PCR rören i ChromoQuant är arrangerade i strips om 8. Ett rör av vardera färg skall användas för komplett analys av en patient. För bästa resultat utför arbetet på is om du arbetar med GoTaq polymerase. Observera att det torkade innehållet i röret kan vara statiskt. Öppna locket försiktigt! 4. Sätt 15 µl master-mix från steg 4 till varje PCR rör. Kontrollera att pelleten löses i master-mixen. Pelleten kan ibland sitta högt upp i röret. 5. Tillsätt 10 µl DNA till varje rör (1,5-15 ng µl -1 ). Mixa genom att pumpa med pipetten 5X. Slutvolym 25 µl. 6. Kontrollera att all vätska har samlats i botten av röret. Centrifugera ned lösningen vid behov. 7. Utför genast PCR reaktionen enligt följande protokoll: Q07-103-S06 Bruksanvisning ChromoQuant.doc 3(6)
PCR protokoll: PCR protocol: Välj steg 1 beroende på vilket enzyme som används. Steg 2-4 repeteras 26 cykler. Steg Antal cykler Temp. Tid 1.GoTaq 1 94 o C 3 min 1. HotStar 1 95 o C 15 min Taq 2 Repeat 26 94 o C 30 sek 3 " 57 o C 1 min 4 " 71 o C 2 min 5 1 71 o C 5 min 6 1 60 o C 60 min 7 HOLD 4 o C Gel-elektrofores av amplifierat DNA 1. Utför gel-elektrofores enligt instrumentmanual eller best-practice. Förväntad fragmentlängd är 93 500 nukleotider. 2. Avsalta vid behov PCR proverna individuellt innan elektrokinetisk injektion på kapillär. Marköridentiteter i respektive kit 311.002.1-48u Kromosom 13/18- bärnstensgula PCR rör AMEL Xp22.1-22.31 X/Y (AMEL) x: 103-108 Grön HEX y: 109-114 D18S391 18pter-18p11.22 18 135-185 Grön HEX D18S976 18p11.2-18p11.3 18 171-201 Blå 6-FAM XHPRT Xq26.1 X 260-304 Blå 6-FAM D13S742 13q11-q12.1 13 230-326 Grön HEX D18S386 18q22.1-q22.2 18 330-405 Grön HEX D13S634 13q14.3-q22 13 380-445 Blå 6-FAM D13S628 13q31-q32 13 420-475 Gul NED D13S305 13q12.1-13q14.1 13 425-470 Grön HEX D18S535 18q12.2-q12.3 18 450-505 Blå 6-FAM Markör A: En topp vid (103-108) bp indikerar XX. En topp i vardera intervallet (103-108)resp. (109-114) bp indikerar XY. Markör A är inte polymorf. Kromosom 21 blå PCR rör DXS6854 Xq26 X 93-119 Blå 6-FAM DXS6803 Xq21.31 X 101-139 Grön HEX D21S1409 21q21.2 21 193-219 Gul NED SRY Yp11.3 Y 202-207 Blå 6-FAM X22 (PAR 2) Xq/Yq X/Y 190-250 Grön HEX D21S11 21q21 21 220-285 Gul NED D21S1246 21q22.2-21qter 21 282-336 Grön HEX D21S1411 21q22.3 21 292-340 Gul NED D21S1444 21q21-21q22 21 304-345 Blå 6-FAM D21S1435 21q21.3 21 350-410 Grön HEX Markör R representeras som en topp i intervallet (205-207) bp endast om provet är XY. Markör R är inte polymorf och skall endast generera en topp. Kriteria för XY är en Q och en R topp. Kriteria för XX är en eller två (heterozygot) toppar i markör Q samt avsaknad av topp i markör R. 313.002-24 Kromosom 13- röda PCR rör D13S762 13q31.3 13 270-326 Grön HEX D13S252 13q12.2 13 330-390 Blå 6-FAM Q07-103-S06 Bruksanvisning ChromoQuant.doc 4(6)
318.002-24 Kromosom 18 lila PCR rör D18S878 18q22.1 18 158-192 Grön HEX D18S1002 18p11.1 18 280-370 Blå 6-FAM 321.002-24 Kromosom 21- gula PCR rör D21S1409 21q21.2 21 193-219 Grön HEX D21S1411 21q22.3 21 292-340 Blå 6-FAM D21S1280 21q22.11 21 316-386 Grön HEX 330.001-24 Kromosom X och Y gröna PCR rör DXS6803 Xq21.31 X 101-139 Grön HEX DXS8377 Xq28 X 198-280 Grön HEX DXS6809 Xq21.33 X 230-285 Blå 6-FAM G10_STS47 Yq11.222 Y 338-343 Grön HEX 412.001-48u Kromosom 13, 18 och 21- blå PCR rör D13S742 13q12.13 13 230-326 Grön HEX D13S634 13q21.33 13 380-445 Blå 6-FAM D13S628 13q31.1 13 420-475 Gul NED D13S305 13q13.3 13 425-470 Grön HEX D18S391 18p11.31 18 135-185 Grön HEX D18S976 18p11.31 18 171-201 Blå 6-FAM D18S386 18q22.1 18 330-405 Grön HEX D18S535 18q12.3 18 450-505 Blå 6-FAM D21S11 21q21.1 21 220-285 Gul NED D21S1246 21q22.2 21 282-336 Blå 6-FAM D21S1444 21q22.13 21 226-267 Blå 6-FAM D21S1435 21q21.3 21 150-210 Gul NED Q07-103-S06 Bruksanvisning ChromoQuant.doc 5(6)
Tolkning av data Vi rekommenderar användande av Visualizer Software (CyberGene AB) för beslutsstöd och tolkning av data. Varje markör genererar ett specifikt mönster i ett väl definierat område, i en förutbestämd färg. Normala mönster De mönster som avbildas nedan är exempel på mönster för normala patienter. Normal Heterozygot informativ 1:1 Homozygot icke informativ Trisomi mönster Ett patientprov som indikerar en trisomi genererar antingen tre toppar av samma höjd (1:1:1) alternativt två toppar med ett 1:2 (eller 2:1) förhållande. Endast heterozygota mönster kan användas för tolkning av eventuella trisomier. Homozygota trisomi patienter kan generera en topp. Denna topp kan ej användas för tolkning, den är icke informativ då den lika gärna skulle kunna vara en homozygot normal. Trisomiskt 2:1 (1:2) förhållande genererar normalt inte ett exakt 2:1 (1:2) förhållande. En kvot om 0,8-1,4 tolkas som ett normalt prov. En kvot överstigande 1,8 eller mindre än 0,65 indikerar en trisomi. Värden utanför dessa gränser betraktas som ej informativa. Vi rekommenderar att sådana prover analyseras om, vid behov med justering av DNA-koncentration. Trisomi 1:1:1 Trisomi 2:1 Friskrivning ChromoQuant QF-PCR kit skall endast användas och hanteras av personal med relevant utbildning för molekylärbiologiskt arbete. Resultat som uppnås med ChromoQuant skall endast användas och tolkas inom den normala kliniska beslutsprocessen. CyberGene AB kan inte hållas ansvarig för kliniska beslut. Q07-103-S06 Bruksanvisning ChromoQuant.doc 6(6)