MPCR Multiplex Polymerase Chain Reaktion JANINA WARENHOLT Molekylär patologi LUND
Vad är multiplex PCR Variant av PCR Möjliggör samtidigt att amplifiera (masskopiera) många målsekvenser i en enda reaktion. MPCR detekterar flera specifika gener i ett enda rör.
Analysgång Extraktion av DNA från färska, fixerade vävnader, celler, CSF, blod, buffycoat. Amplifiering MPCR molekylärbiologisk metod som används för att producera ett stor antal flera specifika DNA sekvenser Detektion- visualisering av MPCR-produkter med kapillärelektrofores
Hur extraherar man DNA Mekanisk Cellysering,, 55-65 C, buffert (anjonisk detergent), DNA stabiliseringssubstans, proteinas K RNA borttagande (RNase) Protein utfällning (organisk saltlösning amoniumacetat) DNA utfällning (isopropanol)
FTA microcard FTA technology Korten är impregnera- de med lösning som denaturerar proteiner, löser upp cellmembran, skyddar DNA från nukleaser Imprint eller punktat a) 1timme torkning b) 2-3 stansar c) 2 olika buffertar under 30 min MPCR
Vad innehåller en MPCR reaktion Templat DNA (cellers DNA) Oligonukleotider (primers minst 4 st) Primers - smält temperatur (Tm), komplementära till var sin DNA sträng. Inmärkta med fluorokromer. dntp deoxyribonukleotider (datp, dctp, dgtp, dttp) reaktionens byggstenar i syntesen DNA-polymeras - värmetåligt och katalyserar syntesen Buffert Tris-HCL, ph 8,3 MgCL 2 (katjon Mg + 2 fungerar som cofaktor för enzym aktivitet)
Profil av Termalcykling MPCR PCR-maskin - som är termoblock för temperatur-cyklar cyklar. MPCR reaktion består av 35-40 cyklar En cykel består av 3 steg DNA denaturering 92-95 95 C (separering av strängar) Primer annealings 53-65 C biokemikal process, binder specifikt till DNA strängar beroende på Tm- smält temperatur Syntetiserings temperatur där polymeraset syntetiserar en komplementär sträng
Detektion - visualisering av MPCR- produkter med kapillärelektrofores ABI PRISM 3700 DNA Analyzer separerar DNA-fragment Innehåller 16 kapillärer POP 6 polymer separationsmedium MPCR-produkter denatureras Enkelsträngade DNA vandrar från anoden mot katoden och separeras efter sin storlek Laser exciterar fluorokromer i MPCR-produkterna som avger olika våglängder
GeneMapper - bearbetar våglängderna, omvandlar de till kromatogram baspar Fluorokrom 6-FAM (blå färg) Fluorokrom - HEX (grön färg) Fluorokrom NED (svart färg)
MPCR för B- och T-cellslymfom Metoden baserar på att detektera klonala rearrangemang av B-celler och T-cellernas antigenreceptorgener 24 primers för B- och T-cellslymfom, 2 primer ß-Globin vissa inmärkta med fluoroforer IgH-V-J, (immunoglobulin tunga kedjan) FR1, FR3 BCL1/IgH (cyclin D1-gen på 11 kromosom/join-gen på kromosom 14) BCL2/IgH t (14:18) TCRY (T-cellsreceptor gamma) ß-GLOBIN
Ett enda rör multiplex PCR TCRG for T-cells IGH V-J for B-cells IGH V-J for B-cells Fluorescence intensity β-globin-kontroll
IgH-VJ FR3, FR1 för B-cellslymfom FR3 ß-GLOBIN FR1
Follikulärt lymfom BCL-2/ IgH ß-GLOBIN
Mantelcellslymfom-BCL1/IgH FR3 BCL1/IGH ß-GLOBIN
T-cellslymfom TCR-y
Sammanfattning MPCR - nya möjligheter för snabb och korrekt diagnostik MPCR - kostnadseffektiv En enda reaktion identifierar olika mutationer i gener - klonala rearrangemang, kromosomala translokationer. Sparar tid
Molekylär patologi i Lund Grundare Mike Dictor Konstruerar primer viktigaste komponent i MPCR 6 6 år 6 publikationer 4 4 kandidat examensarbetet - 1 magister examen 12 MPCR metoder, 2 PCR metoder
Molekylär patologi i Lund MPCR IgH-VJ+BCL2/IgH+BCL1/IgH+TCRG IgK VJ IgK V/intron-Kde IgH-DJ TCRBeta-VJ TCRBeta-DJ TCRD
Molekylär patologi i Lund MPCR Mycobacterium tuberculosis grupp Kvalitets kontroll av paraffin material Mikrosatellit- markörer- Short tandem repeat sekvens (STR) JAK2V617 mutation HPV virus (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82, B- globin) PCR HHV8, ORF26 gen, Toxoplasma