KORTSVARSFRÅGOR 1. Restriktionsenzymet HindIII klyver sekvensen 5 -AAGCTT-3 och lämnar ett fyra basers 5 -överhäng. Rita ut hur DNA-ändarna ser ut på ett fragment som klyvts med HindIII. (2p) SV: 5 -A 3 -TTCGA 5 5 -AGCTT-3 A-5 2. Vilken enzymatisk aktivitet har Ribonuclease A (RNaseA) och vad är dess vanligaste användningsområdet? (2p) SV: Klyver RNA efter pyrimidiner (C och U) och det används ofta för att bryta ned RNA vid rening av plasmid-dna. 3. Varför har en PCR-primer med högt GC-innehåll högre smältpunkt än en lika lång primer med lägre GC-innehåll. (1p) SV: Guanine och cytosine basparar med tre väte-bindningar medan adenine och thymine endast med två. Därför binder en primer med högt GC-innhåll starkare till templatet vilket ger en högre smältpunkt. 4. Why is it important to use an internal control in real time PCR (qpcr) (2p). För att kunna normalisera olika prover. 5. Ge exempel på två olika reportervektorer, rita gärna figur. (3p) SV: Promotorlös reportervektor för test av promotorfunktion, reportervektor med promotor för test av regulatoriskt element eller enhancers. 1
6. Vilken är den vanligaste transfektionsmetoden? (1p) Katjoniska lipider 7. Name 2 ways of detecting gene expression in tissue? (1p) Either - Northern blotting - RT-PCR - Real time PCR - Microarray/Affymetrix/cDNA arrays 8. (a) Vad innebär positiv och negativ kontroll av genreglering? (b) Vilken av dessa är vanligast i eukaryoter respektive prokaryoter? (3p). SV: (a) positiv kontroll är att specifikt stimulera RNA syntes via en aktivator och negativ kontroll är att specifikt inhibera RNA syntes via en repressor (b) positiv kontroll är vanligast i eukaryoter och negativ kontroll i prokaryoter. 9. Hur påverkar co-repressorer med associerande proteiner kromatinstrukturen (1p). SV: Deacetylerar histoner. 10. Det finns fyra typer av icke-kovalenta interaktioner som är involverade i proteinprotein bindning i celler. Vilka? (2p). Answer: Hydrogen bonds/interactions Electrostatic bonds/ Ionic bonds Van der Waals attractions Hydrophobic Interactions (force) 2
11. In which drug development phase is the drug candidate tested in humans for the first time? (1p) Answer: Phase I 12. Beskriv kortfattat hur Cre/loxP systemet fungerar. (3p) SV. Cre/loxP systemet är utvecklat från bakteriofag P1 och används ofta för att göra konditionella knockouter. Cre är ett enzym, ett recombinase, som orsakar rekombintion mellan två loxp sites (en 34 bp lång sekvens). Detta resulterar i att sekvensen mellan två loxp sites avlägsnas och endast ett loxp site blir kvar. 13. Why do you get footprints after digestion with DNAse I when proteins are bound to the DNA. (3p) Because the proteins protect the DNA from the digestion which results in holes in the fragment ladder. 3
BERÄTTARFRÅGOR 14. You have cloned a promoter and identified some protein binding sites using footprinting. You want to know now which proteins bind to these sites. How do you proceed? (6p) SV: Comparison of the binding sites with a database for transcription factor binding sites. EMSA with the identified labelled binding sites and either cell extracts or purified suspected proteins. In case of cell extract, the suspected proteins have to be identified by supershift with specific antibodies. Specificity can be shown by competition with unlabelled nucleotides and the use of labelled scrambled sequences. And/or ChIP assay with antibodies against the suspected protein and primers to amplify the binding region. 4
15. Du ska klona in sekvensen angiven nedan, i EcoRI sitet på plasmiden pbs. Du har tillgång till cdna från celler som uttrycker denna sekvens som kan användas som templat i PCR-reaktioner (både sense och antisense strand ges nedan). EcoRI klyver sekvensen GAATTC. Sekvensen som ska klonas: 5 CGCGAATGCGCGAATATGCGCGTATATGCGCGCTATGGGCCCCGTATATTGTGTGAGAGA 3 GCGCTTACGCGCTTATACGCGCATATACGCGCGATACCCGGGGCATATAACACACTCTCT GGGGAGAGAGGGAGAGAGGGCGCGCGAGAGAGTTTTAGGATGATTAGATAGATGATATGAGA CCCCTCTCTCCCTCTCTCCCGCGCGCTCTCTCAAAATCCTACTAATCTATCTACTATACTCT TGTATATTATATATTGGGCGCGCGTATTAGCGCTAGGCTCGATGCTAGCTGATGCGGCT 3 ACATATAATATATAACCCGCGCGCATAATCGCGATCCGAGCTACGATCGACTACGCCGA 5 A. Ange DNA-sekvensen på två stycken primers som kan användas för att amplifiera sekvensen med PCR och samtidigt få den flankerad av EcoRI sites. (4p) B. Beskriv dessutom vilka steg som måste utföras för att klona in PCR-produkten i EcoRI sitet i pbs samt rena fram den slutliga plasmiden. (3p) SV A. primer 1 5 GATCGAATTCCGCGAATGCGCGAATATGCG primer 2 5 GATCGAATTCAGCCGCATCAGCTAGCATC (Röda nucleotider = extra baser för att kunna klyva, kan vara andra) B. 1. Rena PCR produkten 2. Klyv vektor och PCR-produkt med EcoRI 3. Defosforylera vektorn 4. Värmeinaktivera både vektor och klyvd PCR-produkt. 5. Ligera PCR-produkt + vektor. 6. Transformera ligering 7. Plocka bakteriekoloni och starta kultur 8. Rena plasmid 5
16. Du misstänker att ett protein, protein X, kan binda till östrogenreceptor α (ERα) eftersom det innehåller en sekvens som liknar en NR-box. Beskriv kort två metoder för att undersöka om protein X kan binda till ERα samt svarar på frågan om interaktionen är beroende av ligand. Rita gärna figur. (6p) SV: Exempel på metoder som går att använda. Jäst två-hybrid systemet, två mammalian-hybrid systemet, GST-pulldown, Biacor analys. Coimmunoprecipitation. 6