Tentamen Molekylärbiologi T3 / HT VG = 64-80p G = 44-63p U = 0-43p

Transkript

1 KORTSVARSFRÅGOR 1. Vilken metod kan man använda för att reducera d.v.s minska mängden mrna från en specifik gen? (1 p) sirna, eller shrna. 2. If you start with one template molecule, how many new DNA molecules are produced after 5 cycles of PCR? (1 p) Answer. 2 N = 2 5 = List four types of histone tail modifications. (2 p) Answer. Phosphorylation, acetylation, methylation, ubiqitination, ADP-ribosylation 4. Give 3 advantages and 3 disadvantages of using the Biacore system for studying protein-protein interactions. (3 p) Answer: adv Quantitative information Label-free detection Real-time measurements Non-invasive technology Adaptable to many different experimental systems Small amounts of protein disadv In vitro system Requires purified proteins One component is immobilized High cost of machine and consumables 5. qpcr: which of samples A or B contain most template? A: Ct=30, B: Ct=25 (1 p) Answer: B 1

2 6. Would you use synthetic agonists or antagonists to treat estrogen receptor (ERalpha)- positive breast cancers? Why? (2 p) Answer: Antagonists (such as tamoxifen or raloxifen). Inhibition of estrogen /ERalpha-dependent transcriptional activity /gene expression / cell proliferation. 7. How would you identify and clone the zebrafish homologues of human transcription factor HTF-1? (2 p) Answer: Blast search (protein homology) Design PCR primers against protein coding sequence (5 ATG, 3 Stop codon) PCR amplification from a Zebrafish cdna preparation (e.g. total embryo cdna) Cloning into plasmids (e.g. T-vectors) Sequencing for verification 8. Proteiner som reglerar genuttryck är ofta uppbyggda av olika domäner. Många av dessa proteiner har en aktiveringsdomän. Beskriv hur en aktiveringsdomän kan öka transkriptionen från en promotor? (2 p) Answer: Förmedla signaler till transkriptionskomplexet vid promotorn att det skall initiera transkription. Attrahera, placera och stabilisera transkriptionskomplexet vid promotorn direkt eller indirekt via coactivatorer. 9. What are the advantages and disadvantages associated with the ChIP assay? (3 p) Advantages - time resolution in minutes - can be perform in all cell types and yeast, rodents etc... - works well with epitope tagged proteins - can study posttranslational modifacations (histone modifications) Disadvantages - time - minutes may actually be too long in some cases - requires a specific antibody - requires prior knowledge of the DNA sequence to design PCR primers - possible artifacts due to potentially biased "crosslinkability" - epitopes may be masked 2

3 10. Förklara begreppen ES-cell och homolog rekombination? (2 p) ES-cell: Embryonisk stamcell isolerad från en blastocyst som kan differentiera till alla celltyper i ett embryo (är pluripotent). Homolog rekombination: Utbyte av DNA-sekvenser som har stor homologi. 11. a. Definiera vad som menas med två homologa DNA sekvenser. (1 p) två sekvenser som har ett gemensamt evolutionärt ursprung/ som härstammar från en ursprunglig (förfader)sekvens b. Definiera vad som menas med två ortologa gener samt ge ett exempel på två ortologa gener. (2 p) homologa gener som har separerats pga artbildning (1 p) korrekt exempel (1 p) 12. Du har gjort en BLAST sökning med sekvens X och får upp två träffar: sekvens Y och Z. Sekvens Y har ett E värde (expect value) på 0 medan sekvens Z har ett E värde på 1. Vilket av följande påståenden är korrekt (1 p) a. Varken Y eller Z är signifikanta träffar. b. Endast Y är signifikant. c. Endast Z är signifikant. d. Både Y och Z är signifikanta träffar. b 3

4 13. Describe four features that make C. elegans a good model system for (human) neurobiology. (4 p) Answer: The overall set-up / network of the nervous system or brain is the same: sensory neuron (input), interneuron or brain (computation, comparison, processing, decision making), motor neuron (output) Many molecules that function in neurons are conserved between worms and humans (e.g. neurotransmitters, signal receptors, transport molecules, etc. etc.) One can analyze single cells of the nervous system with a technique called laser ablations - removing any particular neuron and then check which specific nervous system function is disturbed or absent The C. elegans nervous system is completely described with regard to numbers of neurons, their connectivity, cell types, and is very, very simple, yet at the same time displays all the features a nervous system needs to have (see first answer) One can mutate worms easily and then look at many, many different behaviors that are due to malfunctions in the nervous system: bahvioral genetics help analyze nervous system / brain functions 4

5 14. Both genetic and embryological features make zebrafish an excellent model system to study vertebrate development. What are the embryological features that make zebrafish well suitable for the study of early development and organogenesis? (4 p) Answer: Embryology: -breed all year, large number of progeny -external development, easy accessible for experimental manipulation -transparent embryos, easy for microscopic observation of developmental processes, all major body parts and organ rudiments can be recognized -rapid development, the principle vertebrate bauplan is laid down within 24 hours (Bonus: -embryological tools available: transplantation, cell fate mapping,cell lineage tracing... 5

6 15 a. Nämn två olika kliniska kännetecken på ärftlig cancer (2p) - låg debutålder - typisk släkthistoria (släktingar med samma eller associerad cancersjukdom) - multipla tumörer hos en individ b. Hur stor andel av all cancer beräknas vara ärftlig? (1p) % c. Nämn en förutsättningen för att ett presymptomatiskt anlagsbärartest kan utföras? (1p) - Att mutationen är identifierad hos en släkting med sjukdomen 16 a. Nämn två olika bakomliggande genetiska mekanismer till Down syndrom. (2p) - Klassisk fristående trisomi 21 - mosaicism - Bakomliggande Robertsons translokation b.vid bedömning av upprepningsrisk är det viktigt att känna till den bakomliggande orsaken till Down syndrom i familjen. Varför? (1p) Upprepningsrisken varierar! (Detta svar räcker för 1p) (- Klassisk fristående trisomi 21- låg upprepningsrisk - Mosaicism låg upprepningsrisk 6

7 17. Figuren visar en släkt där två medlemmar avlidit i Duchennes muskeldystrofi. Siffrorna under varje individ anger genotypen i en polymorf markör inom sjukdomsgenen på X-kromosomen. Räkna inte med att överkorsningar förekommer. Ange risken för de två nyfödda kusinerna i generation IV att drabbas av sjukdomen. Motivera Ditt svar. (3p) I II III IV 1,2 4 2,4 7 1, Svar Max 3 p Rita in kromosomerna, Sjukdomsallelen är kopplad till 2-allelen (se III:5) 1p Risken för IV:l l00% 1p Risken för IV:2 0% 1p I II III IV X X XY X X XY X X X X Y 2 1 X X 7

8 18. Fosforylering av proteiner används i många sammanhang, t ex olika signaltransduktionsvägar, i cellen. Vilka aminosyror är det som brukar fosforyleras och vad har de gemensamt? (2 p) (SVAR: TYR, THR OCH SER som alla har en OH-grupp som fosfatgruppen sätts fast på) 19. Vilka skillnader skulle du vänta dig att hitta i det aktiva centret hos två enzymer, där det ena är specifikt för lysin och det andra för valin? (2 p) (SVAR: LYS ÄR POSITIVT LADDAD OCH AKTIVA CENTRET BÖR VARA POLÄRT/NEGATIVT LADDAT MEDAN VAL ÄR HYDROFOB OCH AKTIVA CENTRET BÖR VARA HYDROFOB, OCH LITE MINDRE) 20. Den bakteriella K + kanalen släpper igenom K + joner, men inte Na + ; detta är inte helt trivialt vad är det underliga med detta, och hur kan det förklaras? (3 p) (SVAR: Na + jonerna är mindre. Jonerna är hydratiserade i vattenlösning. K + kan i kanalen i stället bilda goda kontakter med karbonylgrupper från kanalproteinet. För Na + fungerar detta inte lika bra, den är för liten för att få god kontakt med karbonyler på alla sidor av kanalen.) 21. Vad är principen för hanging drop metoden vid proteinkristallisation? (2 p) (SVAR: EN DROPPE AV PROTEINLÖSNING HÄNGER I ETT LOCK OVANFÖR EN KONCENTRERAD LÖSNING MED NÅGON KRISTALLISATIONSAGENT. 8

9 BERÄTTARFRÅGOR 22. Beskriv hur man kan gå till väga för att klona DNA-sekvensen angiven nedan som finns i plasmid 1 till ett EcoRI site i plasmid 2. Plasmid 1 innehåller inga EcoRI site och EcoRI klyver sekvensen GAATTC. (6 p) GTAACTGAGTTGCCGTAGCGTGCGAGCTTGCAGTCGTGCCCGTTAGC TGCGATTTGCTGACCGGTAGCTGAAAGCTTGCAATGCAGTAGGCATG CGTAGCTAGCTAGCT Svar. 1. Använd PCR för att amplifiera sekvensen och addera EcoRI sites. Designa primers: Primers Forward: 5 - GATC GAATTC GTAACTGAGTTGGCCGTAGC Reverse: 5 - GATC GAATTC AGCTAGCTAGCTACGCATGC Primrarna ska innehålla : extra nukleotider för att för att restriktionsenzymet ska kunna klyva (GATC), EcoRI site (GAATTC), och cirka 20 baser som kan hybridisera med sekvensen som ska amplifieras. 2. Klyv PCR-produkten och plasmid 2 med EcoRI. 3. Defosforylera, t. ex med shrimp alkaline phosphatase (SAP), klyvd plasmid 2 för att förhindra återligering. 4. Ligera vektor och fragment. 9

10 23 a. Beskriv i stora drag hur man kan använda mammalie 2-hybridtekniken för att kunna avgöra om en okänd substans troligen fungerar som en agonist eller en antagonist till en östrogenreceptor. (2 p) Behövs vid transfektionen: Reporter Receptor fuserad med en aktiveringsdomän eller DBD från transkriptionsfaktor Peptid alternativt del av känd coregulator fuserad med den andra delen av transkriptionsfaktorn Intern kontroll för att normalisera med, kompensera för transfektionseffektiviteten Kända agonister / antagonister Efter transfektion avläses luciferas(eller reportergen) och intern kontroll, normaliserade värden uträknas. Om den okända liganden visar ett samma bindningsmönster som agonist eller antagonist med peptid/del av coregulator kan man anta att en liknande konformationsförändring i receptorn skett och därmed kan man tänka sig att liganden kommer att ha samma biologiska aktivitet som agonisten alternativt antagonisten. b. Du vill använda dig av mammalie två-hybridtekniken för att avgöra om en okänd substans (substans X) fungerar som en ligand till någon av östrogenreceptorerna. Du transfekterar in följande: DNA mix 1 DNA mix 2 VP16-ERα VP16-ERβ Gal4-LxxLL peptid Gal4-LxxLL peptid Gal4-luciferas reporter Gal4-luciferas reporter β-gal reporter som internkontroll β-gal reporter som internkontroll Efter behandling med dina ligander/substanser så skördar du cellerna och läser av reporteraktiviteten. Du får följande luciferas värden och β-gal värden: mix 1 mix 2 luc β-gal luc β-gal DMSO 10 1 DMSO 10 1 Östradiol Östradiol 50 1 Tamoxifen 5 1 Tamoxifen 3 1 X 5 2 X 25 0,5 Vad går att säga om substans X efter detta försök? Går det att avgöra om substansen fungerar som ligand, om det i så fall är som agonist eller antagonist? (4 p) 10

11 ERα ERβ DMSO Estradiol Tamoxifen 5 3 X 2,5 50 Substans X inducerar en sådan konformationsförändring I ERβ att LxxLL peptidens yta exponeras och peptiden kan binda in. Denna peptid sekvens finns i många kända coaktivatorer som binder in till estrogenreceptorn när en agonist har inducerat en konformationsförändring som gör att ytan exponeras. Till skillnad från antagonister då denna yta inte exponeras utan göms. Troligen fungerar substans X som en agonist specifikt för ERβ eftersom denna konformationsförändring inte sker i ERα när substansen finns närvarande. Interaktionen mellan peptid och ERβ i närvaro av substans X är jämförbar med närvaro av estradiol vilket tyder på en potent agonist. 24. Du har blivit intresserad av ett protein som du misstänker motverkar celldelning. a. Beskriv vilken metod du kan använda för uttrycka detta protein i alla celler i en cellodlingsskål på ett reglerbart sätt i syfte att studera dess funktion? (4p) b. Hur kan uttrycket av proteinet verifieras? (2p) Beskriv gärna genom att rita figur. a) Först så måste cellerna göras stabilt transfekterade med en plasmid som uttrycker en transaktivator (VP16 fuserad tetrepressor). En klon med låg basalnivå och hög induktion selekteras och stabilt transfekteras med en plasmid som har cdna för faktorn klonad efter ett tetracyklinresponselement. b) Tetracyklinreglering av faktorn verifieras sedan med hjälp av real time PCR. Alternativt med western blott mot proteinet. 11

12 25. Beskriv hur det går till att bestämma ett proteins 3D-struktur med NMR. Utgå ifrån att proteinet finns tillgängligt i lösning. (6 p) (SVAR: ASSIGNMENT, COSY GER VINKLAR, NOSY GER AVSTÅND, MODELLBYGGE, KONTROLL AV KVALITTET, HUR PASSAR MODELLEN MED DATA?) 12

13 26. In a screening for MAP kinase substrates a novel protein was identified. After purification and digestion with Trypsin one of the potential phosphorylated peptides was analysed by mass spectrometry. Figure 1 shows the fragmentation spectrum incuding the y-ions and the sulfonated peptide. A, Confirm the expected sequence SISSAHDTR by reading the spectrum! B, Is the peptide phosphorylated, and if, at which of the three serine residues? C, Please explain why the phosphorylation site was not discovered in a previous conducted Micro-array assay? (molecular weights of some amino acids: S: 87, G: 57, T: 101, Y: 163, H: 137, A: 71, R: 175, K: 147, M: 131, D: 115, W: 186, phosphorylation: +80) Sulfonated peptide I m/z Figure 1: Fragment spectrum of the peptide m/z 1053 with an sulfonated N-terminus (m/z 1268). 13

14 Lösung: A, R T D H A S ps X S m/z B, Yes, at serine 2, position # 3 from the N-terminus C, Phosphorylation is a post translational event. 14