Umeå Universitet Institutionen för Klinisk Mikrobiologi Biomedicinsk Laboratorievetenskap Laborationer i Grundläggande laboratorievetenskap BMA-11 Ht- 2011
2
LABORATIONER Kursen Grundläggande laboratorievetenskap omfattar fem laborationer, enligt följande. 1. Statistiska undersökningar och jämförelser mellan några volumetriska kärl 2. Felanalys vid densitetsbestämning av magnesium 3. Kvalitetskontroll av spektrofotometer 4. Koncentrationsbestämning med hjälp av spädningsteknik och spektrofotometri 5. ph - meter och buffertlaboration Ni kommer att arbeta i laborationsgrupper om 2-3 personer/grupp. Redovisning av laboration 1 sker under statistik examinationen medan laboration 2 och 3 redovisas med laborationsrapport. Laboration 4 och 5 redovisas enligt instruktioner i laborationshandledningen. Generellt gäller för alla laborationer att de ska vara väl förberedda. Närvaro samt redogörelser för laborationer är obligatoriska. Laborationsrapporten bör vara inlämnad senast fem arbetsdagar efter laborationstillfället, gäller ej för laboration 1. Se Anvisningar för arbetsböcker och laborationsrapporter. OBS! Alla laborationsredogörelser/rapporter måste vara inlämnade och godkända vid laborationskursens slut för att få denna kurs godkänd. RISKINFORMATION Det är nödvändigt att ALLA laboranter känner ansvar för sin egen och sina kamraters säkerhet. Därför måste varje student ta del av dessa anvisningar. Man bör känna till var säkerhetsanordningar, sjukvårdsmaterial, brandsläckningsutrustning mm förvaras. Vid inträffande av en olycka bör man veta hur man handlar. Slarv vid laboratoriearbete kan vålla svåra personliga och materiella skador. Kemikalier kan vara giftiga, frätande, irriterande, brandfarliga eller explosiva. Behandla alla kemikalier som om de är giftiga. Smaka aldrig på kemikalier och förtär aldrig något i kemilokalerna. Ta inte i kemikalier med händerna, använd alltid spatel, sked eller dylikt. Hantering av frätande vätskor kräver stor försiktighet. Det är obligatoriskt att använda skyddsglasögon och gummihandskar vid arbete med starka syror eller baser. Syror som svavelsyra, saltsyra, salpetersyra och koncentrerade organiska syror samt även baser tex natriumoch kaliumhydroxid lösningar kan ge svåra skador på kroppen (speciellt ögon) men även kläder. Spill av frätande ämnen ska genast torkas upp. Vid utspädning av koncentrerade syror hälls syran i fin stråle under omrörning i vattnet (ej tvärtom) för att undvika stänkning. SIV - syra i vatten. 3
Många organiska lösningsmedel är ytterst eldfarliga tex eter med flera. Deras lättflyktiga ångor ger explosiva blandningar med luft. Ångorna är tyngre än luft och kan rinna vida omkring på ett bord etc. Vid arbete med sådana ämnen får inga lågor finnas i närheten. Observera att gnistor uppkomna genom friktion samt statisk elektricitet kan tända en explosiv gasblandning. Även andra brandfarliga ämnen måste hanteras försiktigt (etanol mm). Var aktsam vid användande av gaslåga. Lämna inte gaslågan utan uppsikt. Se till att du har stängt gasbrännaren ordentligt när du använt lågan klart. Sök reda på information om kemikaliers egenskaper före användandet av dem. Slå upp och läs om kemikalien i den litteratur som finns i laborationssalen eller använd nätet. AFS 1997:10 AFS 2000:4 www.av.se/regler/ Laboratoriearbete med kemikalier Kemiska arbetsmiljörisker www.kemi.se RISKBEDÖMNING Kontrollera vilka farliga egenskaper som den aktuella kemikalien har. Antingen används de böcker som finns på laboratoriet, alternativt läs bifogat produktsäkerhetsblad från producenten (detta kan fås fram via Internet) eller gå in på kemikalieinspektionens hemsida. Ange om ämnet är farligt för inandning, hudkontakt, ögon, oralt intag etc, samt eventuella problem vid kvittblivning (miljöfarligt avfall). Ange även hur man ska skydda sig vid laborationen (handskar, skyddsglasögon, dragbänk, skyddsrock etc). Beskriv även, om olyckan är framme, hur man gör första hjälpen vid akut behov. Anteckna också eventuella restriktioner vid kvittblivning av kemikalien. Riskbedömningen görs innan laborationen och bifogas till laborationsrapporten. OM OLYCKAN ÄR FRAMME. Här följer en kortfattad beskrivning av vad man bör göra vid olika typer av olyckor. El-skador: Bryt omedelbart strömmen. Frigör först därefter (annars finns det risk att du får ström i dig) den skadade. Om personen inte andas, ge konstgjord andning. Tillkalla ambulans. Skärsår: Mindre skärsår får blöda en stund. Tvätta sen såret med tvål och vatten. Lägg på ett snabbförband. Större skärsår bör förbindas och därefter är det bra om man uppsöker läkare. Brännskador: Kyl brännskadan med kallt vatten. Spola länge, håll på tills smärtan avtar. Lägg på förband men använd inte sårsalva. Vid svårare brännskador - tillkalla läkare. Frätskador på hud: Skölj med stora mängder vatten. Tillkalla läkare. Ögonskador: Om man har fått kemikalier i ögonen är det viktigt att handla snabbt. Skölj ögonen noggrant med stora mängder vatten. Börja omedelbart och fortsätt under lång tid. Kom ihåg att ögat måste vara öppet under sköljningen. Alla ögonskador ska snarast möjligt kontrolleras av läkare. Fortsätt att skölja ögat på väg till läkaren under väntan på behandling. Kontaktlinser är förbjudna att använda vid laboratoriearbete. 4
Tag reda på var Brandsläckare och Nödutgång finns! Vid brand: RÄDDA Se till att ingen person är i fara LARMA Ring 112 SLÄCK Känner du till utrymningsplanen? ORDNINGSREGLER VID LABORATIVT ARBETE Allt laborativt arbete ska vara väl planerat och förberett. Stressa inte!! Kontaktlinser får inte användas vid laborativt arbete Använd skyddsglasögon vid alla riskmoment. Ögonen är mycket utsatta och ömtåliga Du får ALDRIG äta, dricka, snusa eller röka på ett laboratorium Använd labrock. Inga ytterkläder förvaras på lab - utnyttja omklädningsrum Håll ordning på din arbetsplats - rent och snyggt Använd tuschpenna/etiketter för att märka vad som finns i kärl, flaskor etc. Det får inte finnas ett enda kärl vars innehåll du är osäker på. Märk även med datum om det ska sparas Meddela om du har slagit sönder något - kasta glaskross i särskild avfallskartong Meddela om en kemikalie håller på att ta slut Se till att vågarna är rena. Blås ej bort pulver utan använd borste. Var och en rengör efter sin vägning Häll inte tillbaka kemikalier och lösningar i sina ursprungliga burkar eller flaskor Häll inte olämpliga kemikalier i slasken tex hydrofoba och lättantändliga vätskor som eter. Använd särskilda avfallskärl Håll ordning i kemikalieförrådet Ta hand om egen och gemensam disk. Plocka in ren lab utrustning på dess plats Efter avslutat arbete lämnas arbetsplatsen i sådant skick att en annan person utan risk ska kunna arbeta där. 5
Laboration 1 Statistiska undersökningar och jämförelser mellan några volumetriska kärl Syfte Bestämma riktighet/noggrannhet (validitet) och precision (reliabilitet) hos några olika volumetriska kärl; Konstruera histogram och kontrolldiagram; Avgöra om extrema mätvärden kan strykas; Ange resultat med största antal säkra (gällande) siffror; Tolka resultaten; Identifiera och bedöma felkällor. Mål Kunna göra tabeller med tabelltext enligt anvisning Kunna tillverka olika typer av diagram/figurer med figurtext Kunna utföra olika typer av statistiska beräkningar både inom beskrivande statistik och enklare statistisk inferens/analys Kunna tolka de beräknade värdena, dvs. kunna skapa information ur mätdata Kunna bestämma och analysera viktiga felkällor 6
Bakgrund Validitet och reliabilitet är två begrepp som är tillämpbara på alla typer av verksamhet där man utför mätningar, både kvantitativa men också kvalitativa. Överfört till kvantitativa mätningar kan man beskriva validitet som en metods eller ett mätinstruments förmåga att mäta det man vill mäta. I volymetriska sammanhang innebär en hög validitet att volymgraderingen stämmer med verkligheten, dvs. om man ska mäta upp 50 ml så är graderingen på 50 ml riktig. Låg validitet kan innebära att graderingen 50 ml kanske innebär 48,5 ml. Realiabilitetsbegreppet är i volymetriska sammanhang kopplat till hur nära ett upprepat antal mätningar av en viss volym sammanfaller med varandra. Ju mindre spridning av värdena, desto större är reliabiliteten. Som verktyg för att bestämma de olika mätinstrumentens validitet och reliabilitet används statistiska metoder. Dessa statistiska metoder utgör viktiga verktyg vid bedömning av olika mätinstruments och mätmetoders kvalitet, dvs. de är kvalitetssäkringsverktyg. Denna laboration är i första hand en bedömning av olika volymetriska kärls validitet och reliabilitet. Material (Arbetsbok ska föras till alla laborationer) Mätglas 25 ml Pasteur-(dropp-)pipett Mätpipett 10 ml Vollpipett 10 ml Mikropipett för uppmätning av 500 L Mikropipettspetsar Bägare storlek 10 ml, 150 ml, 500 ml Pipettfyllare Våg med tre decimaler Våg med fyra decimaler Rumstempererat vatten Termometer Metod Rumstempererat vatten används vid uppmätning av de olika volymerna. Samtliga uppmätningar görs med optimal noggrannhet. Den största bägaren används som förrådskärl för rumstempererat vatten, de mindre placeras på vågskålarna för vägning av uppmätta volymer. För graderade mätkärl (mätglas, mätpipett och vollpipett) gäller att när underdelen av menisken (dvs. den linsformade delen av vattenpelarens yta) tangerar den önskade volymens gradering är uppmätningen klar och vattnet kan tömmas i bägaren på vågskålen. Vid uppsugning av vätska i pipett används aldrig mun utan pipettfyllare (Peleusboll etc). För användning av mikropipetter, se avsnittet Användning av mikropipetter nedan! Innan du fyller vatten i bägaren på vågskålen, ska vågen tareras (nollställas). Töm det uppmätta vattnet i bägaren och avläs därefter vattnets massa. För in det avlästa värdena i tabell i arbetsboken. 7
Uppmätning av 10 ml Använd våg med tre decimaler (g). (Mätserie 1 3 nedan.) Användning av mikropipetter De tekniker som ska användas för uppsugning med mikropipett är antingen forward-teknik eller reverseteknik. Vid nedanstående mätserier används våg med fyra decimaler (g). (Mätserie 4 6 nedan.) Innan du avläser massan stänger du sidoluckor och topplucka runt vågskålen för att minska avdunstningen. För att ytterligare minska risken för snabb avdunstning ska en bägare med rumstempererat vatten vara placerad i vågrummet för att luften ska vara mättad med vattenånga. Manuella mikropipetter har ofta en tryckknapp med tre lägen. Vi kan kalla läget för tryckknappen 0 (noll) när den inte är intryckt. Avståndet till läge 1 beror på vilken volym mikropipetten är inställd på. En mekanisk display visar den inställda volymen. Det innersta läget är 2. (En del pipetter har ytterligare ett läge, men det är för att lossa spetsen.) Använd rätt pipettspets! Tillvägagångssätt för forwardteknik: a) Efter att ha fäst en spets på pipetten, för tryckknappen (med tummen) till läge 1. b) Sätt pipettspetsen under ytan på den vätska som ska sugas upp. Släpp långsamt upp tryckknappen till läge 0. Nu innehåller spetsen den inställda volymen vätska. c) Lyft upp spetsen ur vätskan och torka försiktigt av eventuell droppe på spetsens utsida utan att vidröra spetsöppningen, i vilket fall vätska kan sugas ut ur spetsen. d) Töm ur spetsen i det kärl vätskan ska överföras till genom att pressa ner tryckknappen till läge 2. Tillvägagångssätt för reverseteknik: a) Efter att ha fäst en spets på pipetten, för tryckknappen (med tummen) till läge 2. b) Se forwardteknik! c) Se forwardteknik! d) Töm ur spetsen i det kärl vätskan ska överföras till genom att pressa ner tryckknappen till läge 1. Utförande Mätserie 1: mätglas 25 ml Mät upp 10 ml vatten i mätglaset genom att först hälla försiktigt från förrådskärlet och därefter finjustera nivån med hjälp av pasteurpipett. Häll över vattnet i bägaren på vågskålen och avläs. Gör en mätserie på 10 mätningar. Mätserie 2: mätpipett 10 ml Mät upp 10 ml vatten i pipetten. Töm pipetten i bägare på vågskål. Väg vattnet! Gör en mätserie på 10 mätningar. Mätserie 3: vollpipett 10 ml Mät upp 10 ml vatten i pipetten. Töm pipetten i bägare på vågskål. Väg vattnet! Gör en mätserie på 10 mätningar. Mätserie 4: mikropipett för uppmätning av 500 L Gör en serie på 20 mätningar av vatten med forwardteknik. Mätserie 5: mikropipett för uppmätning av 10 L Gör en serie på 20 mätningar av vatten med forwardteknik. Mätserie 6: mikropipett för uppmätning av 10 L Gör en serie på 20 mätningar av vatten med reverseteknik. 8
Laborationsrapport För laborationsrapporten gäller: Med undantag för rådatakolumn ska mätdata vara omvandlade till volym (ml eller L). Ta reda på vattnets densitet i HANDBOOK of CHEMISTRY and PHYSICS för vattnets aktuella temperatur. Kommentera de beräkningar du gjort och tolka resultaten. Rapporten skickas in som attachment. Detta sker efter det att teorimomenten i statistik och kvalitetssäkring som behövs för redovisning är genomgångna. OBS 1! Vid presentation av uppmätta och beräknade värden, använd alltid det maximala antal gällande siffror som mätningarna medger. Ofta presenteras uppmätta men framför allt beräknade värden med för många siffror, vilket betyder att det eller de sista siffrorna med största sannolikhet är helt felaktiga. Detta kallas för falsk noggrannhet. Detta ska i princip göras vid alla laborativa mätningar! OBS 2! För att inte bli misstänkt för plagiering, ha alltid med källhänvisningar om andra källor använts i redogörelsen. Innehåll Försättsblad Tabeller Tabell med rådatakolumner för massa (g) och volym (ml) för mätglas, mätpipett och vollpipett. Tabell med beräknade Q-test samt beräknade medelvärden, standardavvikelser och variationskoefficienter för mätglas, mätpipett och vollpipett (i enheten ml) Tabell med rådatakolumner för massa (mg) och volym (L) för mikropipett 500 L och mikropipett 10 L forward- och reverseteknik. Tabell med beräknade Q-test samt beräknade medelvärden, standardavvikelser och variationskoefficienter för de tre mätserierna med mikropipetter (i enheten μl) Figurer Histogram för mätserien på 500 L. Kontrolldiagram för de två mätserierna på 10 L (forward och reverse). Diskussion De viktigaste felkällorna Tolkning av hypotestesten Tolkning av jämförelser mellan medelvärden, standardavvikelser och variationskoefficienter dels mellan mätglas, mätpipett och vollpipett, dels mellan forward och reverse 10 μl mikropipett Kommentar och tolkning av kontrolldiagrammen Slutsats Litteratur Statistik för hälsovetenskaperna; Ejlertsson, G., Studentlitteratur, 2003. Chemistry A Molecular Approach; 2 nd ed. Nivaldo J. Tro; Pearson; 2011 9
Laboration 2 Felanalys vid densitetsbestämning av magnesium Syfte Att densitetsbestämma magnesium och att identifiera och bedöma mätosäkerhetens påverkan på resultatet Mål Inse varför exakta mätningar av kvantitativa kontinuerliga variabler inte är möjliga Förstå principen för och kunna utföra, där så är möjligt maximalfelsskattningar Förstå den grundläggande skillnaden mellan maximalfelsskattningsintervall ( ) och konfidensintervall. 10
Bakgrund Vid mätning avläses olika typer av skalor. De fel som kan uppstå har både slumpmässig och systematisk karaktär. Till de slumpmässiga felen hör avläsningsfel beroende på skalors osäkerhet eller ögats oförmåga att bestämma t.ex. när en vätskemenisks nedre kant tangerar en gradering. Denna osäkerhet är ofrånkomlig. Vid bestämning av ett värde som beror på flera oberoende mätningar kan i värsta fall varje mätning ge ett maximalt fel som fortplantas och förstärks. Detta är bakgrunden till den s.k. maximalfelsskattningen som bygger på en matematisk metod kallad logaritmisk differentiering (logarithmic differentiation). I denna maximalfelsskattning adderar man samtliga fel. Genom att mäta ett magnesiumbands längd, bredd och tjocklek samt genom vägning av dess massa kan magnesium densitetsbestämmas med hjälp av formeln (1) m/ V m/( l bt) där m = massa; V = volym; l = längd; b = bredd; t = tjocklek och densiteten som beräknas har beteckningen (rho). Beteckningen på de maximala fel som kan uppstå vid avläsning av dessa är l (delta l), b, t och m. De beräknade medelvärdena betecknas l, b, t, m och för densiteten är det uträknade medelvärdet. Maximalfelsskattningen (Δ) beräknas med hjälp av formeln (2) ( m / m l / l b / b t / t) Med hjälp av denna kan man göra en skattning av gränserna för det intervall inom vilket det sanna värdet bör ligga med hjälp av formeln (3) 11
Material 1. Linjal 2. Skjutmått Där linjen på Nonie-skalan sammanfaller med en linje på skalan avläser man skjutmåttet. I detta fall visar skjutmåttet 2,3 mm. 3. Mikrometerskruv På skalan kan man avläsa antal hela och halva millimetrar, i detta fall 1,5 mm. Uppmätt tjocklek: (1,5 +0,26) mm = 1,76 mm. På cylinder kan man avläsa antal hundradels mm. I detta fall 26 hundradelar. 4. Våg 5. Magnesiumband 12
Utförande 20 magnesiumbands längd, bredd och tjocklek mäts med största möjliga noggrannhet med hjälp av linjal, skjutmått och mikrometerskruv. Banden vägs också på våg som visar minst tre decimaler (g). Laborationsrapport Innehåll Försättsblad Tabeller En tabell över längd, bredd, tjocklek, volym, massa och densitet för de undersökta magnesiumbanden Tabell med medelvärde, median, standardavvikelse, kvartilavstånd och ett 95 %-igt konfidensintervall för magnesiums densitet (under antagande att de beräknade densiteterna är normalfördelade) Maximalfelsskattning av magnesiums densitet och maximalfelsintervall av densiteten En diskussion vid jämförelse mellan maximalfelsintervall och 95 %-igt konfidensintervallet för magnesiums densitet. Förklara skillnaderna i bredd på de två intervalltyperna. Kontrolldiagram över de beräknade densiteterna Diskussion Jämförelse och tolkning/slutsats mellan det beräknade 95 %-iga konfidensintervallet för magnesium och magnesiums sanna densitet vid 20 o C Förklaring till storleken på skattningarna av l, b, t och m Diskussion om olika mätfelens relativa påverkan på säkerheten vid bestämning av magnesiums densitet Kontrolldiagram Diskussion av begreppen slumpmässiga och systematiska fel, dessa begrepps koppling till begreppen validitet och reliabilitet samt begreppet bias. Litteratur Statistik för hälsovetenskaperna; Ejlertsson, G., Studentlitteratur, 2003. Analysteknik, Instrument och metoder (Kap. 1 5); Simonsen, F., Studentlitteratur, 2005. 13
Laboration 3 Kvalitetskontroll av spektrofotometer Syfte Att undersöka absorbansens linearitet mot koncentration absorberande ämne för en spektrofotometer samt bestämma andelen ströljus. Mål Kunna bestämma lineariteten hos en spektrofotometer Kunna bestämma ströljus för en spektrofotometer Förstå linearitetens och ströljusets inverkan på en spektrofotometers kvalitet 14
Bakgrund Orbitalbundna elektroner, dvs. elektroner i atomer, molekyler och joner har förmåga att absorbera elektromagnetisk strålning av olika frekvenser. Inom det synliga och ultravioletta våglängdsområdet absorberar dessa elektroner den elektromagnetiska strålningen varvid elektronerna exciteras, alltså får en högre potentiell (läges-) energi. (I fortsättningen används ljus som synonym till elektromagnetisk strålning.) Olika ämnen absorberar inom olika våglängdsområden. Vattenlösningar av ämnen som absorberar inom det synliga området är färgade, lösningar av ämnen som enbart absorberar inom det ultravioletta området är färglösa. Lösningar med höga koncentrationer uppnår skuggningseffekt, dvs. koncentrationen är så hög att de lösta partiklarna skymmer varandra. Detta medför att lösta partiklar som har förmåga att absorbera ljus inte gör det därför att de är avskärmade från ljus av andra partiklar. För lösningar med höga partikelkoncentrationer finns inget linjärt förhållande mellan koncentration lösta partiklar och mängd strålning som passerar lösningen. Lösningar, vilkas koncentrationer inte uppnår skuggningseffekt följer Bouguer Lambert Beers lag, vilken matematiskt uttrycks enligt (1) A = *c *l där A är absorbansen, (epsilon) är absorptionskoefficienteneller molära absorptiviteten som är våglängds- och ämnesberoende, c är det absorberade ämnets koncentration och l är den längd ljuset går genom lösningen som ju bestäms av kyvettens dimensioner. Av Bouguer Lambert Beers lag framgår att absorbansen är proportionell mot koncentrationen när är konstant, dvs. vid konstant våglängd. Ett annat sätt att uttrycka absorbansen matematiskt är (2) A = lg(1/t) där T är transmittansen eller den andel av ljuset som passerar genom kyvetten. Denna kan också uttryckas som (3) T = I/I 0 där I 0 är intensiteten hos det ljus som går in i kyvetten och I är intensiteten hos det ljus som lämnar kyvetten. Sätts (3) in i (2) fås (4) A = lg(i 0/I) Om inget ljus absorberas så är I = I 0 vilket ger T = 1 (alltså 100 % transmittans) och A = lg1, alltså A = 0. Om däremot inget ljus passerar genom kyvetten är I = 0 vilket ger T = 0, alltså ingen transmittans. Detta ger A = lg(1/0) eller A = lg( ), dvs. A =. Uttryckt med ord, om inget av det ljus som går in i kyvetten lämnar kyvetten så är absorbansen oändligt stor. Generellt når alltid en viss andel ljus en spektrofotometers detektor, dvs. den del som registrerar ljus som passerar genom kyvetten. En anledning till det är att i kyvetthuset, dvs. det utrymme i spektrofotometern där kyvetthållare för prov och referenser finns, finns också s.k. ströljus. Ströljus är det ljus som inte har gått genom kyvetten men som når detektorn på annan väg. Detta ströljus kan uppstå genom att spektrofotometerlampans ljus sprids av dammpartiklar, reflekteras i kyvett osv. Hur påverkar detta ströljus värdet på absorbansen? Antag att förutom I 0 som går in i kyvetthuset så tillkommer 0,1 ströljus. Det innebär att det ljus som går in i kyvetthuset har intensiteten 1,0001 I 0. Vad händer om 60,00 % av det ljus som går in i kyvetten passerar genom kyvetten? Den intensitet ljus som når detektorn blir 0,6000 I 0 + 0,0001 I 0. Absorbansen blir A = lg(i 0/0,6001 I 0). A = lg1,666 eller A = 0,222. Vad blir absorbansen man inte tar med ströljus i beräkningen? A = (I 0/0,6000I 0); A = lg1,667. A = 0,222. Med andra ord märks inte ströljuset i avläsning av absorbans. Antag att inget ljus passerar genom kyvetten. Vad kommer spektrofotometern att visa för absorbans? Ströljuset som ju når detektorn har intensiteten 0,0001 I 0. Den absorbans som kommer att avläsas blir A = lg(i 0/0,0001 I 0) eller A = lg10000, 15
dvs. A = 4. Detta innebär att det finns ett tak för den högsta absorbans som kan visas. I exemplet ovan är den högsta absorbansen 4 när ströljuset är 0,0001 I 0. Material Spektrofotometer Kyvetter (UV) Kaliumdikromatlösningar (K 2Cr 2O 7 i 0,005 M H 2SO 4) av olika koncentrationer Utförande Först görs en riskbedömning av kaliumdikromat och svavelsyra. (Se sid. 2 och 3; Riskinformation och Riskbedömning.) Meddela därefter vilka försiktighetsåtgärder ni har tänkt vidta för att minimera olycksfallsrisk. Detta ska göras och redovisas innan laborationen påbörjas! Absorbansen ska mätas vid 350 nm på sex olika koncentrationer av kaliumdikromat, K 2Cr 2O 7 vilka lösts i 0,005 M H 2SO 4. Koncentrationerna är 25 mg/l; 50 mg/l; 75 mg/l; 100 mg/l; 150 mg/l samt 200 mg/l. Som referens används 0,005 M H 2SO 4. Matcha först kyvetterna genom att i både referenskyvett och provkyvett ha 0,005 M H 2SO 4. Nivån i kyvetten ska vara ca 2/3 av fylld kyvett. Använd pasteurpipett. OBS! Repa inte kyvett med spets på pasteurpipettspets! När matchningen är klar byts lösningen i provkyvetten ut mot kaliumdikromatlösningar. Börja med lägsta koncentration och gå mot högre koncentrationer. Töm kaliumdikromatlösningarna i provkyvetten i en speciell kaliumdikromatslask! När absorbansen vid samtliga koncentrationer är uppmätt blockeras ljuset genom kyvetthållaren för att bestämma ströljus. Laborationsrapport Innehåll Försättsblad Resultat Tabell med kolumner för koncentration, absorbans före matchning och absorbans efter matchning Punktdiagram i vilket linjeanpassning är gjord både för alla mätpunkter och för de mätpunkter som ger bäst linjeanpassning (minst tre). För båda linjeanpassningarna anges derminationskoefficient (r 2 ) och linjeekvation Uppmätt absorbans vid T = 0 och beräknad andel på ströljus i förhållande till I 0 Diskussion (Om spektrofotometerns kvalitet) Riskbedömning Kaliumdikromat och svavelsyra Litteratur Statistik för hälsovetenskaperna; Ejlertsson, G., Studentlitteratur, 2003. Analysteknik, Instrument och metoder (Kap. 1 5); Simonsen, F., Studentlitteratur, 2005. Chemistry A Molecular Approach; 2 nd ed. Nivaldo J. Tro; Pearson; 2011 16
Laboration 4 Koncentrationsbestämning med hjälp av spädningsteknik och spektrofotometri Syfte Att bestämma koncentrationen av en KMnO 4 lösning med hjälp av spädningsteknik, spektrofotometrisk avläsning och beräkning av koncentration med linjär regression mot en standardkurva. Mål Vara väl förtrogen med de spädningstekniker som används Kunna använda och förstå principen för en spektrofotometer anpassad för mikroplattor Bestämma koncentrationen av en KMnO 4 lösning med hjälp av en spektrofotometer och en känd standardlösning. Material Spektrofotometer (Multiscan plus, Labsystems, Helsinki, Finland) Mikroplatta med 96 brunnar, flat botten KMnO 4 standardlösning med känd koncentration 10 mm KMnO 4 lösning med okänd koncentration Använd inte mer KMnO 4 lösning än behövligt Pipett för 40-200 µl inklusive passande spetsar Utförande 1. Gör en riskbedömning för KMnO 4. 2. Titta i manualen för spektrofotometern (Multiscan plus) och läs igenom det stycke som beskriver hur man använder instrumentet (operation). Absorbansen för dina mätningar bör ligga mellan 0,100-1,000 för bäst tillförlitlighet. 3. Gör en seriespädning (se rutan) på standardlösningen (känd koncentration, 10 mm) direkt i mikroplattan (7 brunnar) och avläs absorbansen vid 540 nm. 4. Identifiera det koncentrationsintervall som lämpar sig för att använda i en standardkurva.(jämför dina absorbansvärden och avgör vilka koncentrationer som blir bäst att använda till en standardkurva). I detta intervall ska ett diagram där koncentration ritas mot lösningens absorbans bilda en rät linje. 5. Gör om standardspädningen och konstruera en standardkurva, välj fem lämpliga koncentrationer (se resultatet från punkt 3). Pipettera seriespädning av standarden som triplikat (trippelprover) i mikroplattan. Seriespäd den okända KMnO 4 lösningen till minst 3 brunnar, gör även det som triplikat. 17
6. Bestäm den okända lösningens koncentration med hjälp av standardkurvan. Lämplig koncentration är när den okända lösningens koncentration sammanfaller med det linjära koncentrationsintervallet på standardkurvan. Seriespädning: Du tillsätter 100 µl avjoniserat H 2 O i ett antal brunnar (ex 6 brunnar) i en mikroplatta. Du tar sedan 100 µl av den lösning du skall späda och tillsätter till första brunnen med H 2 O och blandar upp och ned 3 x med pipetten. Sug sedan upp 100 µl av lösningen och flytta över till nästa brunn och upprepa proceduren. I sista provspädningen suger du upp 100 µl som du kastar. Om du som i detta fall startar med en 10 mm lösning så kommer koncentrationen att halveras för varje spädning. Använd den bifogade mallen över mikroplattan för att beskriva hur du späder dina standarder och prover. Gör först en provspädning med enkelprover av lösningen med känd koncentration och avläs absorbanse, se punkt 3. Gör sedan en standardkurva med triplikat och beräkna med hjälp av kurvan det okända provets koncentration. Mall för 96-brunnars mikroplatta A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Beräkningar i Excel 1. Gör en tabell och skriv in alla mätvärden för standardlösningen med känd koncentration. En kolumn för koncentration och 3 parallella kolumner för de avlästa absorbansvärdena för respektive koncentration. 2. Beräkna medelvärde för absorbansvärdena i ytterligare en kolumn och gör ett punktdiagram där koncentration (x-axel) plottas mot medelvärdet för absorbansen (y-axel). 3. Infoga en linjär trendlinje (högerklicka på punktserien i diagrammet). 18
Absorbans 540 nm 4. Formatera trendlinje och infoga ekvation (högerklicka på trendlinjen och gå till fliken (alternativ)). 5. Beräkna koncentrationen från absorbansvärdena för varje mätning av det okända provet. Använd formeln i diagrammet och beräkna sedan medelvärde och standardavvikelse för koncentrationen av det okända provet. Glöm ej multiplicera med spädningsfaktorn. 1,2 1 y = 0,3x - 0,2 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 1 2 3 4 5 KMnO 4 (mm) Figur 1. Exempel på hur en standarkurva med linjär trendlinje och ekvation kan se ut i Excel Att redovisa Skriv en rapport enligt Anvisningarna där följande delar ingår Försättsblad Introduktion Kom ihåg syftet i slutet av stycket Material och metod Resultat Absorbansvärden och beräkningar i tabellform och diagram. Kom ihåg tabell- och figurtexter. Beskrivande statistik (medelvärde och standardavvikelse) Diskussion Kortfattad där ni kommenterar era resultat Bilaga Riskbedömning KMnO 4 19
Laboration 5 ph-meter och buffertlaboration Syfte Du ska lära dig att hantera och kalibrera en ph-meter, kunna tillverka en fosfatbuffet med visst ph samt få förståelse för hur en buffert verkar. Du ska även lära dig syra-bas titrering samt presentera erhållna resultat. Mål Kunna hantera och kalibrera en ph-meter Känna till principen för en ph elektrod Kunna tillverka en buffert och göra spädningar Förstå vad som menas med buffertkapacitet Kunna utföra en syra-bas titrering Kunna presentera resultat i tabell och diagram Bakgrund Kroppens livsprocesser är i stor grad beroende av ph i kroppsvätskorna. Många biologiska molekyler innehåller svagt sura och basiska grupper. Ett förändrat ph påverkar laddningarna på sådana grupper, vilket ofta har stor effekt på deras funktion. Exempelvis är ett enzyms aktivitet helt beroende av ph. Det är därför viktigt att man i biokemiska experiment har rätt ph-värde och att detta hålls konstant, vilket kan göras med hjälp av buffertar. Många kroppsvätskor har ett ph omkring 7 med undantag av magsaften vars ph~2. Blodets ph är normalt ca 7,4. Om blodets ph sjunker under ph 6,8 eller stiger över ph 7,8 riskerar vi att dö. Det finns flera buffertsystem som verkar i kroppen tex karbonat/bikarbonatsystemet och fosfatsystemet. ph är lika med exponenten med ombytt tecken, när vätejonkoncentrationen skrivs som tiopotens. H 3 O + = 1 10 -ph M Exempel: H 3 O + = 1 10-8 M ger ph 8 ph är den negativa 10-logaritmen för en lösnings koncentration av vätejoner, H + (egentligen H 3 O +, oxoniumjoner). Dvs en lösning med ph 1,0 har en vätejonkoncentration på 0,1 M och en lösning med ph 3,0 en vätejonkoncentration på 0,001M (1 mm). ph-elektroden och ph-metern En lösnings ph mäts med en ph-elektrod kopplad till en ph-meter. ph-metern är i princip en voltmeter, som mäter potentialdifferensen mellan två elektroder, glaselektroden (känslig mot H + -joner) och en yttre referenselektrod. Den vanliga ph-elektroden sk kombinationselektrod innehåller både en glas- och en referenselektrod. När en kombinationselektrod sänks ner i en provlösning fås en elektrisk förbindelse mellan elektroderna genom en liten glasfilterskiva 20
(keramisk plugg). Därför är det viktigt att elektroden sänks ner så mycket att keramikpluggen täcks av provlösningen. Glaselektroden ändrar sin potential efter lösningens H + -koncentration, medan referenselektroden alltid uppvisar samma potential. Potentialskillnaden i glaselektroden är proportionell mot H + koncentrationen (och därmed lösningens ph) och är ca 59.1 mv / ph-enhet vid 25 C. Glaselektroden består av ett rör av isolerande glas på vilket det nedtill finns ett tunt (0,1mm), kulformat glasmembran, som har en mycket speciell kemisk sammansättning. Glasmembranet är mycket känsligt och ska hanteras varsamt. Glaskulan är fylld med en viss buffert med ett konstant ph, beroende på modell. Ned i denna lösning sticker en sk innerelektrod (inre referenselektrod), som utgörs av en klorerad silvertråd, som sedan via en platinatråd och kabel är ansluten till voltmetern (ph-metern). När glaselektroden doppas ned i en provlösning, fås över glasmembranet en potentialskillnad som är direkt proportionell mot skillnaden i ph mellan de båda sidorna om glasmembranet, d v s provlösningens ph respektive ph i lösningen inuti glaskulan. Vid ph 7.0 uppvisar de flesta ph-metrar det sk iso-ph't, vilket innebär att potentialskillnaden mellan glas- och referenselektroden är 0. Vid ph över iso-ph visar ph-metern negativ potential och vid ph under iso-ph visar ph-metern positiv potential. Provlösningen är vanligen baserad på vatten, som med salter bildar en elektrolyt med förmåga att leda ström. Om joner saknas, kan inte lösningen leda ström och man kan då heller inte mäta ph. Detta gör det vanskligt att mäta ph i organiska lösningar eller vattenlösningar med låg jonstyrka. Man får otillförlitliga resultat. Till lösningar med låg jonstyrka, t ex dricksvatten, brukar man tillsätta sk hjälpelektrolyt i form av KCl-lösning. Denna brukar endast marginellt påverka det erhållna ph-värdet. Temperaturberoende Elektrodens potential är beroende av temperaturen och måste därför kalibreras vid samma temperatur som den skall användas vid. Detta medför att lösningen man skall mäta ph i bör ha samma temperatur som de lösningar som man kalibrerat ph elektroden med. Observera att även ph på referenslösningarna, som används vid kalibreringen, kan varierar med temperaturen, se flaskornas etikett. Skötsel av ph-elektroden En ph-elektrod bör skötas varsamt för att man skall kunna lita på sina mätvärden. o Var rädd om glaskulan och glasmembranet - det är ömtåligt! Låt därför aldrig kulan komma i kontakt med kärlens väggar eller botten. Om du använder magnetomrörare så se till att magnetloppan inte hoppar omkring i lösningen eller på annat sätt kan komma i kontakt med membranet. o Se till att det finns ordentligt med elektrodlösning (tex 3M KCl-lösning, beroende på typ av elektrod) i referenselektroden. Denna lösning kan bytas ut. o Se till att elektroden när den inte används står i förvaringslösning (tex 3M KCl). Förvara inte elektroden i dest. vatten, kranvatten eller ph referensbuffert. o Se till att det inte finns luftblåsor i den inre lösningen i kombinationselektroden. Den viktigaste mätningen är kalibreringen av ph-elektroden Vid mätning av ph måste först mätsystemet kalibreras. Eftersom ytan på glasmembranet påverkas både av att elektroden står oanvänd men även när den används så måste glaselektroden kalibreras. Kalibreringen leder till ett mer tillförlitligt samband mellan mv och ph. Kalibreringen görs mot buffertlösningar med kända ph värden. Ofta görs tvåpunktskalibrering dvs mot två lösningar ph 7 och ph 4 alternativt ph 10 beroende om man skall mäta ph på sura 21
eller basiska lösningar. Välj inte kalibreringsbuffertar som ligger mer än 3 ph-enheter från varandra. Använd alltid fräscha buffertar (spara inte från en dag till nästa). De flesta elektroder är byggda så att 0 mv mellan glaselektrod och referenselektrod motsvarar ph 7. Börja därför alltid med ph 7 för att nollställa instrumentet och för att justera för avvikelser i elektroden. Kalibrera vid samma temperatur som den temperatur provet ska mätas vid. Inställning av ph-metern två punktskalibrering Skölj elektroden med avjonat eller destillerat vatten. Låt den sista vattendroppen, som vanligen hänger kvar på elektroden, sugas upp av mjukt papper (Kleenex). Sätt ned elektroden i referenslösningen med ph 7.0. Mät temperaturen och ställ in rätt temperatur på ph-metern. Följ ph-meterns manual för att genomföra kalibreringen. I och med denna 2-punkts kalibrering ändras lutningen ("slope") på linjen mellan faktiskt ph-värde och skalutslag (eg mv). ph-metern mäter en potentialdifferens mellan glas- och referenselektroden. Buffert och buffertkapacitet En buffertlösning är en lösning vars ph är relativt konstant då en liten mängd syra eller bas tillsätts. Buffertlösningen består av två komponenter. De ena komponenten ska kunna neutralisera en liten mängd bas och den andra komponenten ska kunna neutralisera en liten mängd syra. De två komponenterna får inte neutralisera varandra (tex stark syra och stark bas). En svag syra och dess konjugerande bas kan användas som buffertlösning (t.ex. ättiksyra och natriumacetat). H 2 O + HA H 3 O + + A - Jämviktskonstanten för den svaga syran kan uttryckas som: Ka= H 3 0 + ]A - /[HA] Logaritmering ger: ph= pk a + log [ A - ]/ [HA Om [HA = [A - ] är ph = pk a En buffertlösning påverkas obetydligt av: o Utspädning o Måttlig tillsats av syra o Måttlig tillsats av bas När man blandar en buffert finns i praktiken två alternativ. o Tillsätt de två olika buffertkomponenterna enligt tabell 1, sida 15. o Beräkna den massa som behövs av den svaga syra alternativt den svaga basen. Lös upp kemikalien i vatten och ställ ph med en bas alternativt en syra tills man får rätt ph. Buffertkapaciteten definieras som buffertens förmåga att motstå ph-förändringar vid tillsats av syra eller bas. Vid den punkt där ph =pk a har bufferten den största buffertkapaciteten. Förberedelse Teorigenomgång gällande ph-elektrod och tillverkning av buffert kommer att ges före laborationen. Gör de beräkningar som behövs för att kunna bereda lösningarna, se moment 2 innan laborationen. Molmassan för de kemkalier ni kommer använda vid laborationen är för Na 2 HPO 4 12 H 2 O: 358,14 g/mol och för NaH 2 PO 4 2 H 2 O: 156,01 g/mol. Skriv en riskbedömning. 22
Utförande Laborationen genomförs i stationssystem. Stationerna omfattar fyra olika moment och alla grupper ska göra alla moment men i vilken ordning skiftar. Moment 1: ph-metern Läs manualen till Mettler-Toledo MP220, så ni kan hantera ph-metern. Gör en två-punkts kalibrering - följ instruktionsmanualen. Mät därefter ph på lösningarna; 0.3 M HAc och 0.1 M Na-acetat (finns färdigberedda). Beräkna det teoretiska ph-värdet på lösningarna och jämför med det uppmätta ph-värdet. Förklara i rapporten principen för ph-metern och kalibrering. Moment 2: Lösningsberedning Tillverka 100 ml 0.2 M Na 2 HPO 4 och 100 ml 0.2 M NaH 2 PO 4 Gör 0.1 M fosfatbuffert ph 7.2 enligt tabell 1. Moment 3: Jämförelse av ph-förändringar i en buffertlösning i förhållande till vatten. Material: 0.1 M fosfatbuffert ph 7.2 (se moment 2) avjoniserat vatten samt indikatorer. Överför 25 ml fosfatbuffert till en bägare, tillsätt någon droppe av indikatorn bromfenolblått. Droppa från en byrett 0.1 M HCl till färgomslag. Ange antalet milliliter som åtgår. Överför 25 ml fosfatbuffert till en bägare, tillsätt någon droppe av indikatorn fenolftalein. Droppa från en byrett 0.1 M NaOH till färgomslag. Ange antalet milliliter som åtgår. Upprepa samma procedur men med vatten i stället för buffert. Sammanfatta era resultat och besvara frågorna (skrivs som bilaga). Frågor: 1. Vad menas med en buffert? 2. Vad är en indikator och inom vilka ph intervall ändrar bromfenolblått och fenolftalein, färg? 3. Ange vätejonkoncentration i blod vilkens ph är 7,4? Moment 4: Bestämma molekylmassan hos en syra med hjälp av titrering Uppgift: Två syrors (en en-protonig och en två-protonig) molekylmassor ska bestämmas genom titrering med NaOH-lösning av känd koncentration (ni blir tilldelade en av syrorna). Redogör kortfattat hur man gör en titrering. 23
OBS! Hantera syrorna och NaOH försiktigt. Använd skyddsglasögon och handskar. De okända syrorna finns utspädda som färdiga lösningar i flaskor märkt A resp C. Utförande: Till en E-kolv av lämplig storlek sätts 10,00 ml av den utspädda, okända syran (titrand) och dessutom 2-3 droppar av indikatorn fenolftalein. Från en 25 ml byrett tillsätts 0,100 M NaOH (titratorn) till ekvivalenspunkten är nådd. Upprepa titreringen och gör 3-4 titreringar per syra. Från de erhållna volymerna beräknas molekylmassorna och därefter anger ni vilken av de föreslagna syrorna ni anser ni har. För att beräkna molekylmassan utgå från en reaktionsformel och titta på ekvivalensförhållandena. Ex: HA + OH - A - + H 2 O (en-protonig syra) Information om de två syrorna A och C Enprotonig syra: Syra A Vätska med densiteten 0.993 g/ml För beredning av 1 liter syra A har 15 ml koncentrerad syra A använts. Tvåprotonig syra: Syra C Fast ämne. Båda de "sura" protonerna har avgetts när indikatorn ändrar färg. Varje syra C - molekyl binder två vattenmolekyler. För beredning av 1 liter syra C har 11,1 g syra C använts. Diskutera och jämför era värden med tabellvärdet för några av de nedan angivna syrorna. Enprotoniga syror o Myrsyra o Smörsyra o Ättikssyra o Propionsyra Tvåprotoninga syror o Bärnstenssyra o Oxalsyra o Malonsyra o Adipinsyra Att redovisa Skriv en rapport enligt Anvisningar för arbetsböcker och laborationsrapporter Försättsblad Introduktion där syftet skrivs i slutet Material och metod (kortfattat) Resultat med tabeller och figurer ev uträkningar visas i bilaga Diskussion kommentera era resultat Bilaga Riskbedömning 24
Tabell 1. Buffertlösningars sammansättning för olika ph (vid 23 C) 1. Glycin-HCl: 0,1 M; ph 1,2-3,2 x ml 0,1 M HCl+0,1 M glycin till 100 ml ph 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 x 85,4 71,1 62,0 54,7 48,1 42,4 36,4 30,4 24,0 17,9 12,0 2. Citrat-HCl, 0,1 M; ph 1,2-4,8 x ml 0,1 M HCl+0,1 M Na-citrat till 100 ml ph 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 x 88,9 80,7 75,4 71,8 69,4 67,4 65,5 63,6 61,7 59,7 57,3 ph 3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 x 54,6 51,6 48,1 44,0 38,9 32,1 21,1 12,0 3. Acetat, 0,1M; ph 3,6-5,6 x ml 0,2 M ättiksyra + 0,2 M Na-acetat till 100 ml+ 100 rnl vatten ph 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 x 92,6 88,0 82,0 73,6 61,0 51,0 40,0 29,6 21,0 17,6 9,6 4. Succinat, 0,05 M; ph 4,0-6,0 25 ml 0,2 M bärnstenssyra + x ml 0,2 M NaOH+ vatten till 100 ml ph 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6 5,8 6,0 x 10,0 13,3 16,7 20,0 23,5 26,7 30,3 34,2 37,5 40,7 43,5 5. Fosfat, 0,1 M; ph 5,7 8,0 x ml 0,2 M Na 2 HPO 4 + 0,2 M NaH 2 PO 4 till 100 ml + 100 ml vatten ph 5,7 5,8 5,9 6,0 6,1 6,2 6,3 6,4 6,5 6,6 6,7 6,8 x 6,5 8,0 10,0 12,3 15,0 18,5 22,5 26,5 31,5 37,5 43,5 49,0 ph 6,9 7,0 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 7,7 7,8 7,9 8,0 x 55,0 61,0 67,0 72,0 77,0 81,0 84,0 87,0 90,5 91,5 93,0 94,7 6. Veronal-HCl, 0,1 M; ph 7,0-8,4 x ml 0,1 M HC1+0,1 M veronal-na till 100 ml ph 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 8,2 8,4 x 46,4 44,6 41,8 38,4 33,8 28,4 23,1 17,9 7. Tris, 0,05 M; ph 7,2-9,0 50 ml 0,2 M tris(hydroximetyl)aminometan + x ml 0,2 M HCl + vatten till 200 ml ph 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6 8,8 9,0 x 44,2 41,4 38,4 32,5 26,8 21,9 16,5 12,2 8,1 5,0 25